Name: Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywych kardiomiocytów przedsionkowych z serca szczura z zespołem metabolicznym przy użyciu aparatu Langendorffa. Technika umożliwia badanie sprzężenia pobudzenia-skurczu w komórkach z zachowaną funkcją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez DZHK (Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych, D.B.), EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.) oraz przez BMBF (Niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań), a także program dla naukowców klinicznych BIH-Charité finansowany przez Charité - Universitätsmedizin Berlin i Berliński Instytut Zdrowia (F.H.).

<ol><li>Alberti, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonizing+the+metabolic+syndrome%3A+a+joint+interim+statement+of+the+International+Diabetes+Federation+Task+Force+on+Epidemiology+and+Prevention%3B+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute%3B+American+Heart+Association%3B+World+Heart+Federation%3B+International+Atherosclerosis+Society%3B+and+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity.</a> Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).</li>
<li>International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html">https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html</a> (2006).</li>
<li>Melenovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+atrial+remodeling+and+function+in+advanced+heart+failure+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).</li>
<li>Goette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHRA%2FHRS%2FAPHRS%2FSOLAECE+expert+consensus+on+atrial+cardiomyopathies%3A+definition%2C+characterization%2C+and+clinical+implication%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication.</a> EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).</li>
<li>Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+mechanisms+of+atrial+fibrillation%3A+a+translational+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal.</a> Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).</li>
<li>Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyssynchronous+calcium+removal+in+heart+failure-induced+atrial+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).</li>
<li>Hohendanner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+induced+Ca2%2B+release+and+excitation-contraction+coupling+in+atrial+myocytes+from+normal+and+failing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts.</a> The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).</li>
<li>Tada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mineralocorticoid+receptor+on+experimental+cerebral+aneurysms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats.</a> Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).</li>
<li>Iwasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+promotion+with+long-term+repetitive+obstructive+sleep+apnea+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).</li>
<li>Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+natriuretic+factor-SV40+T+antigen+transgenes+produce+tumors+and+cardiac+arrhythmias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice.</a> Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li>
<li>Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+hyperpolarization-activated%2C+non-selective+cation+current+I%28f%29+in+immortalized+HL-1+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes.</a> The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes%2C+Endothelial+Cells%2C+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).</li>
<li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), e51357(2014).</li>
<li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50289(2013).</li>
<li>Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+physiological+analysis+of+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51109(2014).</li>
<li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+Ca2%2B+tolerant+cardiomyocytes+from+the+adult+rat%3A+improvements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications.</a> Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).</li>
<li>Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolation+of+cardiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).</li>
<li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).</li>
<li>Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tubular+membrane+networks+in+cardiac+myocytes+from+atria+and+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51823(2014).</li>
<li>Hohendanner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+metabolic+syndrome-related+atrial+decompensation+in+a+rat+model+of+HFpEF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2033(2010).</li>
<li>Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+excitation-contraction+coupling+in+mammalian+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes.</a> Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).</li>
<li>Smyrnias, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+T-tubule+system+in+adult+rat+ventricular+and+atrial+myocytes%2C+and+its+role+in+excitation-contraction+coupling+and+inotropic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation.</a> Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).</li>
<li>Pritchett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diastolic+dysfunction+and+left+atrial+volume%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).</li>
<li>Linz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+A+mediates+susceptibility+to+atrial+tachyarrhythmia+and+impairment+of+atrial+emptying+function+in+Zucker+diabetic+fatty+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats.</a> Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Ramanathan, T., Skinner, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/bjaed/article-abstract/5/2/61/422091">Coronary blood flow.</a> Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).</li>
<li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+individual+collagenases+from+Clostridium+histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li>
<li>Deel, E. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28485491">In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes.</a> The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).</li>
<li>Wuensch, E., Heidrich, H. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14058277">[On the Quantitative Determination of Collagenase].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).</li>
<li>Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Netherlands+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal models of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).</li>
<li>Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+diastolic+dysfunction+and+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction.</a> Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj po raz pierwszy opisaliśmy protokół izolacji jednokomórkowych ACM od szczurzego modelu HFpEF związanego z MetS, który wykazuje wyraźną przebudowę przedsionków22. Zabieg jest wyjątkowo trudny, ponieważ nadmiar tkanki tłuszczowej może sprawić, że przygotowanie chirurgiczne, a także kaniulacja aorty, będą coraz trudniejsze. Przewodnik rozwiązywania problemów zamieszczony w tabeli 2 zawiera najczęstsze problemy związane z procedurą izolacji.
<table border="1" fo:keep-togethe...

MetS opisuje grupę czynników ryzyka cukrzycy typu 2 i chorób sercowo-naczyniowych, w tym podwyższone ciśnienie tętnicze krwi, dyslipidemię (podwyższony poziom trójglicerydów i obniżony poziom cholesterolu lipoprotein o dużej gęstości), podwyższony poziom glukozy na czczo i otyłość centralną1. Szacuje się, że rozpowszechnienie MetS na całym świecie wynosi 25–30% i stale rośnie2. HFpEF jest niejednorodnym zespołem klinicznym często związanym z MetS. Remodelacji serca podczas HFpEF i jej poprzedzających faz (tj. choroby nadciśnieniowej serca) towarzyszy również przebudowa przedsionków 3. Zmniejszona funkcja skurczowa i zmiany strukturalne lewego przedsionka są związane ze zwiększoną śmiertelnością, migotaniem przedsionków i nowo wystąpioną niewydolnością serca4. Przebudowa przedsionków charakteryzuje się zmianami w funkcji kanałów jonowych, homeostazieCa2+, strukturze przedsionków, aktywacji fibroblastów i zwłóknieniu tkanek5. Przebudowa lewego przedsionka w HFpEF związana z MetS i leżące u jej podstaw mechanizmy patologiczne są nadal słabo poznane i wymagają dalszych dogłębnych badań. Modele zwierzęce okazały się cennym narzędziem i doprowadziły do wielu postępów w dziedzinie kardiomiopatii przedsionkowych6,7,8,9.
Badania z izolowanymi kardiomiocytami jednokomórkowymi są często wykorzystywane do potwierdzania i uzupełniania wyników in vivo. Izolacja i potencjalna późniejsza hodowla komórkowa pozwalają na badanie szlaków sygnałowych, prądów kanałów jonowych i sprzężenia wzbudzenie-skurcz. W warunkach fizjologicznych kardiomiocyty nie namnażają się. Fuzja między transkrypcyjnymi sekwencjami regulatorowymi przedsionkowego czynnika natriuretycznego i antygenu T dużego antygenu T wirusa małpiego 40 u myszy transgenicznych doprowadziła do stworzenia pierwszych unieśmiertelnionych ACM, nazwanych AT-110. Dalszy rozwój komórek AT-1 doprowadził do powstania komórek HL-1, które nie tylko są szeregowo pasażowane, ale także kurczą się spontanicznie11. Wykazują jednak różnice strukturalne i funkcjonalne w porównaniu ze świeżo wyizolowanymi komórkami, takie jak mniej zorganizowana ultrastruktura, częste występowanie rozwijających się miofibryli 11 oraz prąd wewnętrzny aktywowany hiperpolaryzacją12. Izolacja kardiomiocytów komorowych (VCM) u szczurów i myszy z różnych modeli jest dobrze znana13,14,15,16,17,18,19. Ogólnie rzecz biorąc, wycięte serce jest montowane w aparacie Langendorffa i wstecznie perfundowane za pomocą buforu wolnego od Ca2 + zawierającego enzymy trawienne, takie jak kolagenazy i proteazy. Wapń jest następnie stopniowo wprowadzany do warunków fizjologicznych. Jednakże, mimo że dostępne są protokoły dedykowane izolacji ACM20,21, ze względu na zwiększone zwłóknienie i różnice związane z ciśnieniem, ich przydatność w modelach chorób z przebudową przedsionków jest ograniczona.
W tym artykule zaimplementowaliśmy protokół izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych od zwierząt, które wykazują przebudowę przedsionków (tj. w szczególności dla szczurzego modelu ZFS1 dla HFpEF związanego z MetS)22. Istniejące protokoły izolacji zostały zoptymalizowane i uzupełnione o proste, dostosowane do potrzeb urządzenie do kontroli i modyfikacji ciśnienia śródświetlnego w jamach serca, co doprowadziło do uzyskania wyższych plonów morfologicznie i funkcjonalnie nienaruszonych kardiomiocytów. Poniższy protokół zawiera przewodnik krok po kroku, szczegółowy opis sprzętu wykonanego na zamówienie, listę rozwiązań, a także obszerny przewodnik rozwiązywania problemów.

<table><tbody><tr><td>ZSF-1 Otyły szczur</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td></td><td>21 tygodni</td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do mikro opatrunków (zakrzywione, ząbkowane)</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek (proste, 1 x 2 zęby)</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>BD537R</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania (kątowe)</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>MA624R</td><td></td></tr><tr><td>Gilotyna do gryzoni i małych zwierząt</td>, <td>Kent Scientific Corp.</td>Niskokosztowa komora indukcyjna <td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>3,0 l</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>SOMNO-0730&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do naparu ze skrzydeł motyla 21 g</td><td>Hospira, Inc.</td><td></td><td></td>181106101</tr><tr><td>Abbocath 16 G</td><td>Hospira, Inc.</td><td>0G7149702</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna Microlance</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td>zmodyfikuj igłę do wykonania kaniuli</td></tr><tr><td>Braun Oryginalna strzykawka do perfusora 50 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Braun Inject Solo 10 ml</td><td>B. Zlewka do 2057926</td><td></td><td></td>Braun Melsungen AG</tr><tr><td>50ml</td><td>Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)</td><td>21 106 17</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego Duroplan (100 x 20 mm)</td><td>Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Seraflex Szew USP 3/0</td><td>SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG</td><td>IC208000</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe kwadratowe łodzie wagowe VWR 100ml</td><td>VWR, Inc.</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr>Powierzchnia <td></td><td></td><td></td><td>styropianowa</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan Magensium siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>230391</tr><tr><td>Chlorek magensium</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Monoksym 2,3-butanodionu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche (Sigma-Aldrich, Inc.)</td><td>LIBTM-RO</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Rotexmedica GmbH</td><td>3862357</td><td></td></tr><tr><td>Forene (Isoflurane)</td><td>Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG</td><td>10182054</td><td></td></tr><tr><td>Laminin z błony podstawnej mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem WillCo 500&micro; l 0,005 mm</td><td>WillCo Wells BV</td><td>HBST-3522</td><td></td></tr><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>F14201</td><td>5 i mikro; M przez 20 minut w RT</td></tr><tr><td>Di-8-ANNEPS</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>D3167</td><td>10&mikro; M przez 45 min w 37& C&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitotracker RED FM</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>M22425</td><td>20nM przez 30 min przy 37& C</td></tr><tr><td>Naczynie reakcyjne z płaszczem 500 ml</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>107024414</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie reakcyjne z płaszczem 1000 ml</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>107025414</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka bąbelkowa z płaszczem</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>134720001</td><td></td></tr><tr><td>Cyrkulator zanurzeniowy grzewczy ED</td><td>Julabo GmbH</td><td>9116000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Reglo Digital MS-2/6</td><td>Ismatec (Cole-Parmer Gmbh)</td><td>Termometr ISM 831</td><td></td></tr><tr><td>Voltcraft 302 K/J</td><td>Conrad Electronic SE</td><td>030300546</td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700</td><td>mikroskop Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania ZEN 2.3</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Numer katalogowy: 410135-1011-240&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jednokanałowy sterownik grzałki TC-324B</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>8-kanałowy system perfuzyjny</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-0185</td><td></td></tr><tr><td>8-kanałowe wielokanałowe grzejniki liniowe</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-0105</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

W tym artykule opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych (ACM) z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym (MetS) z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF). Częstość występowania HFpEF związanej z MetS rośnie, a kardiomiopatie przedsionkowe związane z przebudową przedsionków i migotaniem przedsionków są klinicznie bardzo istotne, ponieważ przebudowa przedsionków jest niezależnym predyktorem śmiertelności. Badania z izolowanymi kardiomiocytami jednokomórkowymi są często wykorzystywane do potwierdzania i uzupełniania wyników in vivo. Rarefikacja naczyń krwionośnych i zwłóknienie tkanki śródmiąższowej stanowią potencjalnie czynnik ograniczający pomyślną izolację pojedynczych komórek ACM ze zwierzęcych modeli tej choroby.
Rozwiązaliśmy ten problem, wykorzystując urządzenie zdolne do ręcznej regulacji ciśnienia śródświetlnego w jamach serca podczas procedury izolacji, znacznie zwiększając wydajność morfologicznie i funkcjonalnie nienaruszonych ACM. Pozyskane komórki można wykorzystać w wielu różnych eksperymentach, takich jak hodowla komórkowa i funkcjonalne obrazowanie wapnia (tj. wzbudzenie-skurcz-sprzężenie).
Dostarczamy badaczowi protokół krok po kroku, listę zoptymalizowanych rozwiązań, dokładne instrukcje dotyczące przygotowania niezbędnego sprzętu oraz obszerny przewodnik rozwiązywania problemów. Podczas gdy początkowa implementacja procedury może być dość trudna, udana adaptacja pozwoli czytelnikowi na wykonanie najnowocześniejszych izolacji ACM w szczurzym modelu HFpEF związanego z MetS dla szerokiego spektrum eksperymentów.

W wieku 21 tygodni, po readaptacji do wapnia (krok 5.4–5.7), metodą tą można wyizolować 60–90% żywotnych ACM (oszacowanych zgodnie z opisem w kroku 6.1) od otyłych szczurów ZSF-1 (Rysunek 4A). U szczurów ACM charakteryzują się innym i bardziej heterogennym fenotypem w porównaniu do VCM24,25. Rysunek 4B przedstawia pojedynczy ACM z zachowanymi błonami i strukturą sarkomeró...

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu funkcji poszczególnych kardiomiocytów i pozwala na badanie sprzężenia wzbudzenie-skurcz-sprzęgło. Główną zaletą tej techniki jest to, że można wyizolować wysoką wydajność żywotnych kardiomiocytów przedsionkowych z serc z kardiomiopatią przedsionkową i wykorzystać ją do kolejnych eksperymentów. Zacznij od umieszczenia kaniuli z długą, ostrą końcówką usuniętą na górze aparatu Langendorffa i rozpocznij przepływ.Włącz moduł grzewczy i wyreguluj tak, aby bufor perfuzyjny na końcu igły utrzymywał żądaną temperaturę perfuzji. Po zakończeniu kalibracji temperatury przenieś kaniulę do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej lodowatym buforem do kaniulacji. Umieść dwa gotowe podwójne węzły nad kaniulą, aby szybko następnie wykonać kaniulację aorty.Usuń serce od poddanego eutanazji, poddanego heparynizacji szczura, ściskając podstawę serca kleszczami i delikatnie ciągnąc w dół w kierunku ogona zwierzęcia. Przetnij aortę, utrzymując ciągnięcie serca, pozostawiając 5-milimetrowy odcinek aorty przymocowany do serca. Szybko przenieś serce do 50 ml lodowatego buforu do kaniulacji w zlewce o pojemności 50 ml.Odczekaj około 10 sekund,

isolation-atrial-cardiomyocytes-from-rat-model-metabolic-syndrome

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Poznaj metodę izolacji żywych kardiomiocytów przedsionkowych z serca szczura z zespołem metabolicznym przy użyciu aparatu Langendorffa. Technika umożliwia badanie sprzężenia pobudzenia-skurczu w komórkach z zachowaną funkcją.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Przeglądaj więcej filmów