Name: Pobieranie próbek i obróbka wstępna węglanu szkliwa zębów w celu stabilnej analizy izotopów węgla i tlenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Naucz się pobierania próbek węglanu szkliwa zębów do analizy izotopów węgla i tlenu. Ta metoda pozwala rekonstruować dietę i środowisko w badaniach archeologicznych i paleontologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Towarzystwu Maxa Plancka za sfinansowanie tych badań, jak również za niedawne założenie laboratorium stabilnych izotopów w Departamencie Archeologii Instytutu Nauki o Historii Człowieka im. Maxa Plancka.

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Laboratorium Spektrometrii Mas Izotopów Światła w Instytucie Nauki o Historii Człowieka im. Maxa Plancka. Należy starać się o odpowiednie zezwolenia etyczne od krajowych i międzynarodowych komitetów w przypadku analiz obejmujących zagrożone współczesne lub historyczne okazy fauny oraz w przypadku wykorzystania materiału archeologicznego i faunistycznego, który może być interesujący dla współczesnych interesariuszy. W niniejszej pracy wykorzystano próbki archeologiczne i kopalne. W tym badaniu nie wykorzystano żadnych żywych ludzi i uzyskano pełne etyczne, instytucjonalne i rządowe pozwolenia na jakąkolwiek destrukcyjną analizę.
1. Próbkowanie zbiorcze
Uwaga: Dla ludzi i zwierząt, podstawową metodą pobierania próbek szkliwa zębów jest przyłożenie wiertła do krawędzi policzkowej zęba.
<ol>
	<li>Oczyść zewnętrzną powierzchnię zęba (~0,1 mm) za pomocą śrutownicy aluminiowej lub delikatnie ścierając za pomocą zestawu wiertarskiego. Użyj wiertarki ręcznej z czystym wiertłem z diamentową końcówką (patrz poniżej), o równym kształcie, przymocowanym za pomocą uchwytu do zestawu wiertarki. Upewnij się, że delikatne i równomierne ścieranie jest wykonywane jako rowek równoległy do całej osi wzrostu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Tam, gdzie to możliwe, należy podjąć próbę zastosowania metody do tej samej części zęba dla każdego człowieka lub zwierzęcia, od którego pobrano próbki. 
	Uwaga: W badaniach paleodietetycznych na ludziach, trzecie zęby trzonowe są ogólnie faworyzowane jako reprezentatywne dla diety późnych młodych / dorosłych, podczas gdy pierwsze zęby trzonowe są unikane ze względu na efekty odsadzenia23. Preferowany ząb dla każdego taksonu i reprezentowany okres życia będą się różnić w zależności od dostępnych próbek i badanego pytania.</li>
	<li>Wiercić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu podczas noszenia maski, aby uniknąć wdychania proszku do szkliwa zębów. Noś okulary, aby chronić oczy. Należy pamiętać, że ilość wywierconej próbki proszku będzie się różnić w zależności od sprzętu używanego do analizy, protokołu leczenia wstępnego i wielkości zęba. Wiercić z małą prędkością, aby zapobiec nagrzewaniu się próbki. 
	Uwaga: W przybliżeniu 4-8 mg próbki w proszku jest odpowiednim celem dla wielu analiz przy użyciu systemu przygotowania i wprowadzania gazów online do spektrometrii mas proporcji izotopów i badań diagenetycznych. Należy pamiętać, że wybrana prędkość wiercenia będzie zależeć od kruchości próbki i będzie wymagała pewnego poziomu prób i błędów. Ogólnie rzecz biorąc, na wiertarce ręcznej wystarczą dwa z pięciu prętów siły. Wywierć proszek do zębów na kawałku czystej folii aluminiowej lub papierze wagowym.</li>
	<li>Zbierz powstały proszek emaliowany i przenieś go do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, która przed wierceniem została wytarowana na odpowiednio dokładnej wadze. Oznacz każdą probówkę oznaczeniem próbki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Zapisz numery próbek i masę szkliwa w notatniku laboratoryjnym, a także w elektronicznej bazie danych.</li>
	<li>Przed wywierceniem każdego nowego zęba należy najpierw wyczyścić używane wiertła za pomocą 0,5 M HCl na wytrzymałej tkance. Następnie umyj wiertło rozpuszczalnikiem organicznym (takim jak aceton, metanol lub etanol) za pomocą wytrzymałej chusteczki.</li>
	<li>Po wierceniu dokładnie wyczyść miejsce pracy za pomocą dedykowanego odkurzacza lub szufelki i szczotki. Przetrzeć przestrzeń pobierania próbek metanolem. Odkurz lub lekko spryskaj wiertło sprężonym powietrzem, aby usunąć kurz i próbkę proszku między próbkami.</li>
</ol>
2. Próbkowanie sekwencyjne
Uwaga: Sekwencyjne pobieranie próbek może być stosowane w różnych formach i zależy od próbkowanego taksonu, wielkości zęba, a także pożądanej rozdzielczości czasowej.
<ol>
	<li>Oczyść powierzchnię zęba, z którego pobierana jest próbka, usuwając bardzo cienką (~0,1 mm) warstwę zewnętrznego szkliwa zębów.</li>
	<li>Wywierć próbki wzdłuż powierzchni policzka prostopadle do osi wzrostu zęba, biegnącej od połączenia korzenia szkliwa do górnej części korony. Wywierć poziome pasma prostopadłe do osi wzrostu, przy czym każda próbka powoduje rowek o szerokości 1-2 mm w poprzek warstwy szkliwa (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig">Rysunek 4). Należy uważać, aby nie wiercić w szkliwie zębiny, ponieważ mogłoby to zanieczyścić próbkę i wynikowy pomiar. 
	Uwaga: Liczba pobranych próbek będzie się różnić w zależności od pożądanej rozdzielczości, ale ok. 10 stanowi odpowiedni cel do zbadania sezonowych zmian wartości δ13C i δ18O dla hipsodonta wielkości udomowionego bydła.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie wiertło do każdej próbki, ponieważ szerokość linii próbkowania zależy od średnicy wiertła.</li>
	<li>Użyj zestawu do bardziej delikatnych zębów wymagających większej liczby próbek przyrostowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) (np. ludzkie zęby), a także do bardziej stabilnego wiercenia. Ustaw stojak, który bezpiecznie trzyma wiertło, z wiertłem skierowanym w dół. 
	Uwaga: Podczas gdy cztery próbki można łatwo uzyskać ze stałego ludzkiego zęba trzonowego przy użyciu podejścia ręcznego24, bardziej wyrafinowane pobieranie próbek wymaga podejścia do ablacji laserowej CO2, które nie będzie tutaj omawiane14. Innym powszechnym podejściem jest użycie półautomatycznego mikropróbkowania25.</li>
	<li>Przytrzymaj ząb lub przymocuj do zacisku. Dociśnij szkliwo zębów do wiertła i dociśnij. Próbki wierci się stopniowo wzdłuż powierzchni policzkowej od wierzchołka (powierzchni zgryzu) do podstawy korony w miejscu połączenia szkliwo-korzeniowego (ERJ). Powtórz tę samą strategię wiercenia próbki wiele razy, wiercąc każdą kolejną linię równolegle do poprzedniej linii próbkowania. Użyj małego cylindrycznego wiertła diamentowego do delikatnych zębów, takich jak zęby trzonowe owiec, o średnicy 1 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Zmierz odległość każdej linii pobierania próbek od ERJ za pomocą suwmiarki i zapisz tę odległość dla porównania.</li>
	<li>Wykonaj kroki 1.3-1.6 powyżej. 
	Uwaga: Jeśli analizowane są małe, delikatne zęby, a metody leczenia wstępnego i kontroli diagenetycznej nie są stosowane, próbki o wielkości 1-4 mg dadzą wiarygodne wyniki w konfiguracji on-line do przygotowania i wprowadzenia gazów do analizy węglanów. Zmodyfikowane zautomatyzowane systemy peryferyjne mogą ułatwiać stosowanie próbek o jeszcze niższych masach, ale są nieuchronnie ograniczone przez udział węglanów w badanym szkliwie (4 do 5% wag.)26,27. Badacze powinni skonsultować się z laboratorium, w którym będą mierzone próbki, aby określić wymaganą ilość próbki.</li>
</ol>
3. Spektrometria w podczerwieni z transformacją Fouriera/metoda tłumienia całkowitego odbicia
<ol>
	<li>W przypadku metody tłumienia całkowitego współczynnika odbicia należy ustalić tło komory próbki, w próżni lub w normalnych warunkach atmosferycznych.</li>
	<li>Umieść około 1 mg szkliwa zębów na krysztale diamentu w komorze na próbkę za pomocą szpatułki. Opuść i zabezpiecz próbkę słupka, aż nastąpi mocne połączenie między słupkiem, próbką i płytką diamentową. Zamknąć komorę próbki, z wytworzeniem próżni lub bez niej, w zależności od konfiguracji lub dostępności.</li>
	<li>Zmierz widma FTIR próbki 64 razy dla liczby falowej w zakresie od 400 do 4,000 cm-1. Pożądana liczba powtórzeń będzie się różnić w zależności od celów badania, chociaż analiza trzech powtórzeń, najlepiej z różnymi podwielokrotnościami, które są pobierane i następnie zwracane do probówki mikrowirówkowej zawierającej próbkę, zapewni wiarygodne wyniki.</li>
	<li>Oczyścić szpatułkę metanolem między każdą podwielokrotnością i między każdą próbką.</li>
	<li>Wykonaj korektę linii bazowej za pomocą dostępnego oprogramowania. Oprogramowanie automatycznie odejmuje tło komory próbki od wynikowego profilu FTIR. Aby zapewnić lepszą odtwarzalność, należy brać pod uwagę tylko widma szkliwa o minimalnej absorbancji 0,06 dla najwyższego pasma fosforanowego na poziomie ~1035 cm-1.</li>
	<li>Monitorować obecność powszechnego wtórnego zanieczyszczenia kalcytu węglanowego we wszystkich próbkach, sprawdzając, czy pik znajduje się na wysokości 711 cm-1.</li>
	<li>Po zakończeniu analizy ostrożnie umieścić próbki z powrotem w probówkach mikrowirówek za pomocą szpatułki lub urządzenia ssącego i przejść do następnego etapu obróbki wstępnej lub analizy.</li>
	<li>Wyeksportuj surowe dane dotyczące długości fali i intensywności jako plik .csv (lub podobny) i użyj do obliczenia interesujących wskaźników (powszechnie używane wskaźniki obejmują indeks fosforanowy miejsca A, indeks fosforanowy miejsca B, indeks krystaliczności fosforanów, indeks woda-amid na indeksie fosforanowym i indeks CO3/PO417,18,19) (Tabela 1).</li>
	<li>Porównaj wyniki FTIR z próbek kopalnych lub archeologicznych z rosnącymi zestawami danych szkliwa zębów współczesnej fauny, dostępnymi obecnie w literaturze19,20, aby określić charakter i zakres zmian diagenetycznych w pobranym szkliwie.</li>
</ol>
4. Prosty kwas octowy (0,1 m) Obróbka wstępna
<ol>
	<li>Zważyć szkliwo w proszku dla każdej próbki w probówce mikrowirówkowej, używając odpowiedniej wagi. Oznacz odpowiednio rurkę. Proszek emaliowany musi być zmielony w tym samym stopniu, z cząstkami o podobnej wielkości. 
	Uwaga: Wielu badaczy stosuje środek utleniający, taki jak rozcieńczony wybielacz (NaClO) lub 30% nadtlenek wodoru (H2O2) do usuwania substancji organicznych z próbki i należy to dodać w tym momencie. Jednak odczynniki te mogą nie tylko zmieniać stabilne wartości izotopów węgla i tlenu w próbce, ale widma próbek kolagenu kostnego w systemie przygotowania i wprowadzania gazów on-line pokazują, że 100% kwas fosforowy użyty do pomiaru węglanów nie reaguje z próbkami organicznymi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5), co sugeruje, że ten krok jest niepotrzebny.</li>
	<li>Dodać 0,1 ml 0,1 M kwasu octowego (na 1 mg szkliwa) do każdej próbki za pomocą pipety. Unikaj dotykania próbek pipetą. Jeśli dojdzie do kontaktu próbki z pipetą, należy użyć nowej pipety do następnej próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Mieszać przez wstrząsanie lub elektroniczne mieszadło (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3), a następnie pozostawić próbki na 10 minut. Emalii w proszku nie należy pozostawiać w kwasie octowym przez dłuższy czas (>4 godziny).</li>
	<li>Umieścić próbki w mikrowirówce na 2 minuty w temperaturze 13 700 x g. 
	Uwaga: Tanią alternatywą jest użycie miniwirówki przez 4 minuty przy 3 500 x g, która mieści mniej próbek, ale jest mniej czasochłonna w przypadku dużych zestawów próbek.</li>
	<li>Po zatrzymaniu programu mikrowirówki zastąp kwas octowy 2 ml ultraczystej wody za pomocą czystej pipety, a następnie mikrowiruj próbki przez 2 minuty przy 13 700 x g.</li>
	<li>Wymień ultraczystą wodę jeszcze dwa razy, tak jak poprzednio, i przetestuj neutralność. Usunąć pozostały płyn za pomocą pipety (nie naruszając supernatantu). 
	Uwaga: Łącznie trzy prania ultraczystą wodą to standardowa procedura mająca na celu uzyskanie neutralności. Próbkę należy myć aż do osiągnięcia neutralności.</li>
	<li>Wytnij arkusze Parafilmu (1 cm × 1 cm) i umieść na każdej probówce do mikrowirówki. Zrób mały otwór w środku za pomocą ostrego przedmiotu, aby próbka odpowiednio wyschła.</li>
	<li>Umieść probówki w liofilizatorze, aby usunąć pozostały płyn. 
	Uwaga: Jeśli liofilizator nie jest dostępny, możliwe jest również delikatne suszenie w piecu (40 °C), które nie powinno mieć żadnego negatywnego wpływu na dane dotyczące stabilnych izotopów węgla i tlenu.</li>
	<li>Po wyschnięciu usuń Parafilm i zamknij pokrywy mikrowirówki. Upewnij się, że etykieta probówki jest prawidłowa i w razie potrzeby napisz ją ponownie. 
	Uwaga: Jest to ostatni etap przed przechowywaniem w celu zważenia, który w laboratoriach dysponujących ograniczonymi funduszami może być ostatnim etapem przed dystrybucją próbek do analizy w innym miejscu.</li>
</ol>
5. Ważenie i mierzenie próbek i wzorców
<ol>
	<li>Za pomocą szpatułki odważ około 2 mg proszku emalii na blaszanym krążku na wadze wrażliwej na 0,001 mg (<klasa silna = "xfig">Rysunek 6). Następnie ostrożnie przenieść próbkę do fiolki ze szkła borokrzemianowego odpornej na kwas fosforowy. Taka ilość szkliwa jest wymagana do uzyskania wiarygodnych wyników ze względu na stosunkowo niewielką zawartość węglanu w szkliwie zębów.</li>
	<li>Wyczyść szpatułkę między próbkami za pomocą metanolu i użyj świeżej, czystej tarczy lub naczynia wagowego do każdej próbki.</li>
	<li>Odważyć 0,2 mg międzynarodowego wzorca, takiego jak MAEA NBS18, MAEA 603, MAEA CO8 lub Merck CaCO3. Można również użyć własnego wzorca wykonanego z homogenizowanego szkliwa dużego zęba20. W przypadku pełnej serii 76 próbek i wzorców należy użyć 61 próbek i 15 wzorców, które powinny być równomiernie rozłożone w całym cyklu. Kilka badań wykazało odpowiednią liczbę standardów i szczegółów w badaniach archeologicznych20,28. 
	Uwaga: Wielokrotna obróbka wstępna i analiza szkliwa w standardzie wewnętrznym, w wielu seriach próbek archeologicznych, prawdopodobnie również zapewni odpowiednią miarę dokładności dla badanych próbek20.</li>
	<li>Dokręcić specjalnie zaprojektowane pokrywki, dostępne dla igły, aż przegroda będzie szczelna, ale nie zostanie zassana do fiolki. Nie dokręcaj pokrywki zbyt mocno, ponieważ nacisk na przegrodę stanie się zbyt silny i może ostatecznie spowodować złamanie igły podczas analizy. Umieścić fiolki w podanej kolejności w bloku grzewczym w temperaturze 70 °C. Kolejność i masa próbek muszą być wiarygodnie rejestrowane w celu wprowadzenia ich do oprogramowania komputerowego.</li>
	<li>Zmierz próbki, wykonując trzy kroki: 1) przepłukać próbki czystym helem, 2) dodać kwas fosforowy, 3) zmierzyć próbkę.
	<ol>
		<li>Przepłukiwać próbki czystym helem (stopień 5.0) o przepływie 100 ml/min przez 5 minut w celu wypłukania otaczającego powietrza.</li>
		<li>Dodać 4-5 kropli kwasu fosforowego (99%, gęstość 1,85 g/ml) do próbki zawierającej węglany. Rozpoczyna się reakcja między próbką aH3PO4. Podczas reakcji uwalniany jestCO2, który przenosi wartość izotopową jonu węglanowego CO32- próbki.</li>
		<li>Odczekać 1 godzinę na próbkę, aż zostanie osiągnięta równowaga CO2 . Po 1 godzinie próbki należy zmierzyć w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Podczas akwizycji mieszanina próbki gazu i On przechodzi do urządzenia. Etap suszenia usuwa wodę z próbki mieszaniny gazów.</li>
		<li>Zmierzyć próbkę, rozpoczynając od trzech pików gazu odniesienia CO2 o znanym składzie izotopowym. Natężenie piku powinno wynosić 4000 mV, aby dopasować się do intensywności pików próbki (od 4000 do 8000 mV). Trzy piki gazu odniesienia powinny mieć długość 20 s i odległość 30 s. Następnie określ interwał pomiarowy próbki. Zmierzyć próbkę 10 razy przez 5 s każda i w odstępie 55 s. Upewnij się, że wysokość piku zmniejsza się z czasem, wskazując na prawidłowy transport mieszaniny próbka/hel (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). 
		Uwaga: Podczas pomiaru oprogramowanie oblicza skład izotopowy próbki, porównując znaną wartość izotopową, wysokość piku i obszar piku gazu odniesienia z wysokością piku i powierzchnią pików próbek. Oblicza się surowy skład próbki o stężeniach 13C/12C i 18O/16O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizować próbki po pomiarze. 
	Uwaga: Jest to ważne, ponieważ gaz odniesienia nie przechodzi tej samej ścieżki chemicznej i fizycznej co próbka gazu po wprowadzeniu do spektrometru masowego. Dlatego ważne jest, aby próbki były dodatkowo kalibrowane zgodnie z międzynarodowymi standardami (krok 5.3), które są poddawane takiej samej obróbce fizycznej i chemicznej w ciągu serii, jak sama próbka20. Te międzynarodowe wzorce węglanowe umożliwiają dwupunktową kalibrację próbek w międzynarodowej skali pomiarowej delta oraz ocenę precyzji i powtarzalności w całym danym przebiegu.</li>
</ol>

<ol><li>Balasse, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/oa.601">Reconstructing dietary and environmental history from enamel isotopic analysis: time resolution of intra-tooth sequential sampling.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 12 (3), 155-165 (2002).</li>
<li>Balasse, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/oa.656">Potential biases in sampling design and interpretation of intra-tooth isotope analysis.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 3-10 (2003).</li>
<li>Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1475-4754.2008.00441.x">On isotopes and old bones.</a> Archaeometry. 50 (6), 925-950 (2008).</li>
<li>Clementz, M. T. <a target="_blank" href="https://www.mammalsociety.org/articles/new-insight-old-bones-stable-isotope-analysis-fossil-mammals">New insight from old bones: stable isotope analysis of fossil mammals.</a> Journal of Mammalogy. 93 (2), 368-380 (2012).</li>
<li>Loftus, E., Roberts, P., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0067270X.2016.1150083">An isotopic generation: four decades of stable isotope analysis in African archaeology.</a> Azania: Archaeological Research in Africa. 51 (1), 88-114 (2016).</li>
<li>Ventresca Miller, A. R., Makarewicz, C. <a target="_blank" href="https://www.taylorfrancis.com/books/e/9781351389921/chapters/10.4324%2F9781315143026-1">Isotopic approaches to pastoralism in prehistory: Diet, mobility, and isotopic reference sets.</a> Isotopic Investigations of Pastoralism in Prehistory. , 1-14 (2018).</li>
<li>Hollund, H. I., Ariese, F., Fernandes, R., Jans, M. M. E., Kars, H. <a target="_blank" href="https://research.vu.nl/en/publications/testing-an-alternative-high-throughput-tool-for-investigating-bon">Testing an alternative high-throughput tool for investigating bone diagenesis: FTIR in attenuated total reflection (ATR) mode.</a> Archaeometry. 55 (3), 507-532 (2013).</li>
<li>LeGeros, R. Z. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Book/Home/221958">Calcium phosphates in oral biology and medicine.</a> Monographs in oral sciences. 15, 109-111 (1991).</li>
<li>Lee-Thorp, J. L., Van Der Merwe, N. J. <a target="_blank" href="https://inis.iaea.org/search/search.aspx?orig_q=RN:19035123">Carbon isotope analysis of fossil bone apatite.</a> South African Journal of Science. 83 (11), 712-715 (1987).</li>
<li>Cerling, T. E., Harris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+isotope+fractionation+between+diet+and+bioapatite+in+ungulate+mammals+and+implications+for+ecological+and+paleoecological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Carbon isotope fractionation between diet and bioapatite in ungulate mammals and implications for ecological and paleoecological studies.</a> Oecologia. 120 (3), 347-363 (1999).</li>
<li>Koch, P. L. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470691854.ch5">Isotopic study of the biology of modern and fossil vertebrates.</a> Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science. , 99-154 (2007).</li>
<li>Nelson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+SJ+%22Wheeler%27s+Dental+Anatomy%2C+Physiology+and+Occlusion-E-Book%22">Wheeler's Dental Anatomy, Physiology and Occlusion-E-Book</a>. , Elsevier Health Sciences. (2014).</li>
<li>Tsutaya, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/ase/124/3/124_161029/_article/-char/en">From cradle to grave: multi-isotopic investigations on the life history of a higher-status female from Edo-period Japan.</a> Anthropological Science. 124 (3), 185-197 (2016).</li>
<li>Sponheimer, M., Passey, B. H., De Ruiter, D. J., Guatelli-Steinberg, D., Cerling, T. E., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+evidence+for+dietary+variability+in+the+early+hominin+Paranthropus+robustus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isotopic evidence for dietary variability in the early hominin Paranthropus robustus.</a> Science. 314 (5801), 980-982 (2006).</li>
<li>Lee-Thorp, J., Sponheimer, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278416503000357">Three case studies used to reassess the reliability of fossil bone and enamel isotope signals for paleodietary studies.</a> Journal of Anthropological Archaeology. 22 (3), 208-216 (2003).</li>
<li>Zazzo, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031018214002399">Bone and enamel carbonate diagenesis: a radiocarbon prospective.</a> Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology. 416, 168-178 (2014).</li>
<li>Sponheimer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSponheimer%2C+M+%22Isotopic+paleoecology+of+the+Makapansgat+Limeworks+fauna+%28Australopithecus+africanus%2C+South+Africa%29%22">Isotopic paleoecology of the Makapansgat Limeworks fauna (Australopithecus africanus, South Africa)</a>. , (1999).</li>
<li>Sponheimer, M., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030544039890293X">Alteration of enamel carbonate environments during fossilization.</a> Journal of Archaeological Science. 26 (2), 143-150 (1999).</li>
<li>Roche, D., Ségalen, L., Balan, E., Delattre, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0305440310000348">Preservation assessment of Miocene-Pliocene tooth enamel from Tugen Hills (Kenyan Rift Valley) through FTIR, chemical and stable-isotope analyses.</a> Journal of Archaeological Science. 37 (7), 1690-1699 (2010).</li>
<li>Roberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calling+all+archaeologists%3A+guidelines+for+terminology%2C+methodology%2C+data+handling%2C+and+reporting+when+undertaking+and+reviewing+stable+isotope+applications+in+archaeology%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Calling all archaeologists: guidelines for terminology, methodology, data handling, and reporting when undertaking and reviewing stable isotope applications in archaeology.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Snoeck, C., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254115300528">Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 1-Impact on structure and chemical composition.</a> Chemical Geology. 417, 394-403 (2015).</li>
<li>Pellegrini, M., Snoeck, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254115300851">Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 2-Impact on carbon and oxygen isotope compositions.</a> Chemical Geology. 420, 88-96 (2016).</li>
<li>Wright, L. E., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+carbon+and+oxygen+isotopes+in+human+tooth+enamel%3A+identifying+breastfeeding+and+weaning+in+prehistory%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+physical+anthropology%22%5BJournal%5D)">Stable carbon and oxygen isotopes in human tooth enamel: identifying breastfeeding and weaning in prehistory.</a> American Journal of physical anthropology. 106 (1), 1-18 (1998).</li>
<li>Roberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruits+of+the+forest%3A+Human+stable+isotope+ecology+and+rainforest+adaptations+in+Late+Pleistocene+and+Holocene+%28%E2%88%BC+36+to+3+ka%29+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+human+evolution%22%5BJournal%5D)">Fruits of the forest: Human stable isotope ecology and rainforest adaptations in Late Pleistocene and Holocene (∼ 36 to 3 ka) Sri Lanka.</a> Journal of human evolution. 106, 102-118 (2017).</li>
<li>Zazzo, A., Balasse, M., Patterson, W. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703705001808">High-resolution δ13C intratooth profiles in bovine enamel: Implications for mineralization pattern and isotopic attenuation.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 69 (14), 3631-3642 (2005).</li>
<li>Sydney-Zax, M., Mayer, I., Deutsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonate+content+in+developing+human+and+bovine+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Carbonate content in developing human and bovine enamel.</a> Journal of dental research. 70 (5), 913-916 (1991).</li>
<li>Rink, W. J., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030544038570026X">Tests for diagenesis in tooth enamel: ESR dating signals and carbonate contents.</a> Journal of Archaeological Science. 22 (2), 251-255 (1995).</li>
<li>Szpak, P., Metcalfe, J. Z., Macdonald, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352409X16306824">Best practices for calibrating and reporting stable isotope measurements in archaeology.</a> Journal of Archaeological Science: Reports. 13, 609-616 (2017).</li>
<li>Wright, L. E., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030544039890351X">Correspondence between stable carbon, oxygen and nitrogen isotopes in human tooth enamel and dentine: infant diets at Kaminaljuyu.</a> Journal of Archaeological Science. 26 (9), 1159-1170 (1999).</li>
<li>Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/oa.653">Isotopic alteration of mammalian tooth enamel.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Wyzwania związane z udanym pobieraniem próbek (masowych i przyrostowych) uzębienia opierają się na dostępie do wiedzy na temat technik wiercenia i przygotowania próbek, a także na inwestycji w stosunkowo niedrogi sprzęt. Wyzwania te można łatwo pokonać, gdy dostępne są jasne instrukcje dotyczące metod pobierania próbek i obróbki wstępnej. Mamy nadzieję, że w tym artykule udało nam się je rozpowszechnić w jasny i zwięzły sposób dla badaczy, którzy nie mają doświadczenia w tych metodach. Uczeni stosujący te metody po raz p...

Analizy stabilnych izotopów węgla i tlenu w szkliwie zębów zostały wykorzystane do zbadania wcześniejszego spożycia przez ludzi, odsadzenia od matki i mobilności, a także zależności fauny od roślinności, ruchu zwierząt i paszy dla zwierząt gospodarskich. Aplikacje te zostały kompleksowo omówione i sprawdzone pod kątem różnych warunków środowiskowych wskazujących na wpływ lokalnej suszy, temperatury, źródeł wody i składu roślinności1,2,3,4,5,6. Różnorodność potencjalnych zastosowań w archeologii i paleontologii, a także dobre zachowanie węglanu szkliwa zębów, sprawiły, że jest to atrakcyjny materiał do pracy z izotopami stabilnymi3. Metody pobierania próbek, obróbki wstępnej i badań przesiewowych diagenezy są pokrótce opisane w wielu poprzednich publikacjach1,7. Jednak dokładne demonstracje werbalne i wizualne pozostają w dużej mierze niedostępne, szczególnie dla osób spoza laboratoriów archeologicznych oraz wśród grup laboratoryjnych o ograniczonych funduszach, gdzie zainteresowanie zastosowaniem tej techniki rośnie5.
Szkliwo zębów składa się głównie z krystalitów hydroksyapatytu (bioapatytu)8 większych niż te w kościach, co czyni je bardziej odpornymi na pośmiertne diagenetyczne substytucje jonowe i zanieczyszczenia3. Nowoczesne badania wykazały, że pomiary szkliwa zębów fauny za pomocą stabilnego izotopu węgla (δ13C) wiarygodnie rejestrują dietę i zachowanie zwierząt9,10. Wartość stabilnego izotopu tlenu (δ18O) szkliwa zębów zależy od składu izotopowego tlenu spożywanej wody, który obejmuje wodę w żywności roślinnej i zwierzęcej, wodę pitną, oddychanie, a także różne wpływy środowiska na wodę, które mogą prowadzić do dalszego frakcjonowania izotopowego (np. suchość, temperatura, wysokość, ilość opadów, położenie kontynentalne)11. To sprawiło, że stała się popularną metodą rekonstrukcji dietetycznej i środowiskowej w badaniach archeologicznych, paleoekologicznych i paleontologicznych.
Okres tworzenia się szkliwa zębów jest stosunkowo krótki (lata) i różni się w zależności od zęba, z którego pobierana jest próbka. U ludzi pierwsze zęby trzonowe mineralizują się między urodzeniem a 3 rokiem życia, przedtrzonowce mineralizują się między 1,5 a 7 rokiem życia, drugie zęby trzonowe mineralizują się między 2,5 a 8 rokiem życia, a trzecie zęby trzonowe mineralizują się w okresie dojrzewania, między 7 a 16 rokiem życia12. Biorąc pod uwagę, że szkliwo zębów tworzy się stopniowo w okresie powstawania, można je pobrać zbiorczo wzdłuż całej osi wzrostu lub pobrać sekwencyjnie w celu zbadania zmian w diecie i środowisku, które zaszły w okresie formacji13. Chronologicznie uporządkowane zmiany w diecie w obrębie danego zęba są możliwe do zaobserwowania dla ludzi i innych zwierząt1,14, dostarczając informacji na temat międzyrocznych zmian sezonowych i dietetycznych.
Chociaż szkliwo jest zazwyczaj odporne na diagenezę, modyfikacje izotopowe wynikające ze środowiska pochówku są możliwe i zostały zaobserwowane15,16, co sprawia, że badania eksperymentalne i wybory przed obróbką są użyteczne. Chociaż nie jest to jedyna dostępna metoda, spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), szczególnie w trybie transmisji tłumionej, stała się szybką, niedrogą i stosunkowo dostępną metodą oceny zmian tafonomicznych w szkliwie zębów, szczególnie w kontekstach paleontologicznych17,18,19,20. Jednak szczegółowe protokoły i standardy zapisu pozostają stosunkowo niedostępne dla wielu osób spoza dziedzin geochemii lub materiałoznawstwa.
Czasy reakcji i substancje chemiczne stosowane przez badaczy w wstępnej obróbce szkliwa zębów również różnią się znacznie w literaturze, często z ograniczonym uwzględnieniem tego, jak ta zmienność może wpłynąć na stabilne wartości izotopów węgla i tlenu w próbce21,22. W tym miejscu przedstawiamy podejście, w którym wykorzystuje się rozcieńczony kwas octowy (0,1 M) do wstępnej obróbki próbek proszku emalii. Biorąc jednak pod uwagę, że różnice w pomiarach izotopowych wynikające z obróbki wstępnej są stosunkowo niewielkie w przypadku szkliwa zębów, najlepiej jest, aby badacze postępowali zgodnie z protokołami dla zestawów danych, z którymi chcą porównać swoje dane do11. Ponadto w przypadku pobierania małych próbek sekwencyjnych, w szczególności próbek holoceńskich, nie można zdecydować się na obróbkę wstępną (po pilotażowych testach diagenetycznych) w celu uniknięcia marnotrawstwa próbki.
Chociaż metody, które tutaj opisujemy, nie są bynajmniej nowe, według naszej wiedzy, po raz pierwszy dokładna pisemna i wizualna dokumentacja masowego i sekwencyjnego pobierania próbek, wyborów przed leczeniem i metod kontroli diagenetycznej (w formie FTIR) dla szkliwa zębów została szeroko udostępniona zróżnicowanej publiczności akademickiej. Chociaż mamy nadzieję, że nasze wysiłki sprawią, że to podejście będzie łatwiej dostępne dla szerszej liczby osób i laboratoriów, badacze, którzy chcą zastosować i opublikować tę technikę, muszą być świadomi minimalnych standardów raportowania, rozważań diagenetycznych i wymagań dotyczących prezentacji omówionych gdzie indziej20, a także potencjalnych zawiłości interpretacyjnych, które będą unikalne dla ich regionu badania, analizowane taksony i okres5.

<table><tbody><tr><td>Dremel Micro</td><td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro</td></tr><tr><td>Wiertło z końcówką diamentową</td><td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de&region=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE</td></tr><tr>Wzór liniowy<td>metanolu</td><td></td><td></td><td>:&nbsp; CH3OH</td></tr><tr><td>Kwas</td><td></td><td></td> octowy <td>Wzór liniowy:&nbsp; CH3CO2H</td></tr><tr><td>Konfiguracja wiertnicy Dremel (stacja robocza)</td>Mikrowirówka <td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401</td></tr><tr><td>Miniwirówka</td><td>Sprout</td><td></td><td>http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4</td></tr><tr><td>Suszarka do liofilizacji</td><td>Zirbus Technology</td><td></td><td>http://www.zirbus.com</td></tr></tbody></table>

pobieranie próbek i obróbka wstępna węglanu szkliwa zębów w celu stabilnej analizy izotopów węgla i tlenu

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Analiza stabilnych izotopów węgla i tlenu w ludzkim i zwierzęcym szkliwie zębów została zastosowana w badaniach paleodietetycznych, paleoekologicznych i paleośrodowiskowych od niedawnych okresów historycznych aż do ponad 10 milionów lat temu. Podejścia masowe zapewniają reprezentatywną próbkę dla okresu mineralizacji szkliwa, podczas gdy sekwencyjne próbki w zębie mogą śledzić zmiany dietetyczne i środowiskowe w tym okresie. Chociaż metodologie te były szeroko stosowane i opisane w archeologii, ekologii i paleontologii, nie było wyraźnych wytycznych, które pomogłyby w wyborze niezbędnego sprzętu laboratoryjnego i dokładnie opisywały szczegółowe pobieranie próbek laboratoryjnych i protokoły. W tym artykule dokumentujemy tekstowo i wizualnie cały proces od pobierania próbek, poprzez obróbkę wstępną, aż po badania przesiewowe diagenetyczne, aby szerzej udostępnić metodologię badaczom rozważającym jej zastosowanie w różnych warunkach laboratoryjnych.

Zastosowano opisaną powyżej procedurę pobierania próbek do przygotowania przyrostowych próbek bioapatytu szkliwa. Analiza bioapatytu w szkliwie zależy od dokładności pobierania próbek, niezależnie od tego, czy są one masowe, czy przyrostowe. W tym przypadku zdecydowaliśmy się przedstawić wyniki próbek archeologicznych (dwie owce) pochodzących z różnych stref klimatycznych. Próbki przyrostowe pobrano z drugich trzonowców owiec i oznaczono, zaczynając od ERJ (Rysunek 4<...

Analiza stabilnych izotopów węgla i tlenu w szkliwie ludzkich i zwierzęcych zębów została wykorzystana jako wskaźnik zastępczy dla indywidualnej diety i rekonstrukcji środowiska. W tym miejscu zapewniamy szczegółowy opis i dokumentację wizualną masowego i sekwencyjnego pobierania próbek szkliwa zębów, a także wstępnej obróbki próbek archeologicznych i paleontologicznych.

Pobieranie próbek i obróbka wstępna węglanu szkliwa zębów w celu stabilnej analizy izotopów węgla i tlenu

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu archeologii, paleontologii i ekologii, takie jak dieta zwierząt udomowionych, strategie zarządzania zwierzętami i mobilność zwierząt. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo nieniszcząca i koncentruje się na materiale, który jest dość odporny na zmiany chemiczne w środowisku pochówku. Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, będą miały trudności, ponieważ nie ma dostępnych pomocy wizualnych do pobierania próbek paleontologicznych i archeologicznych szczątków ludzi i zwierząt.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest ona trudna do nauczenia, a praktyka na materiałach archeologicznych jest ograniczona. Aby rozpocząć masowe pobieranie próbek, należy ustawić wiertarkę ręczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym, z czystym wiertłem z diamentową końcówką o równym kształcie, przymocowanym za pomocą uchwytu do zestawu wiertła. Za pomocą wiertła oczyść zewnętrzną powierzchnię zęba poprzez delikatne ścieranie.Następnie wytaruj 1,5-mililitrową probówkę mikrowirówki na odpowiednio dokładnej wadze. Następnie umieść czystą folię aluminiową lub papier wagowy pod wiertarką, aby zebrać

sampling-pretreatment-tooth-enamel-carbonate-for-stable-carbon-oxygen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano protokół, w którym biodegradacja CO2 zmineralizowanego z zanieczyszczeń organicznych (pochodzących z surowców ropopochodnych) jest wychwytywana, oznaczana ilościowo i analizowana pod kątem zawartości 14C. Opracowano model w celu określenia zasięgu przestrzennego strefy wychwytywania CO2 . Pomiary przestrzenne i czasowe pozwalają na integrację wskaźników mineralizacji zanieczyszczeń w celu przewidywania zakresu i czasu remediacji.

Pomiar mineralizacji zanieczyszczeń na bazie węgla przy użyciu połączonych analiz strumienia CO2 i radiowęgla

Przedstawiamy metodę oceny pirogenicznego węgla (PyC) w środowisku za pomocą kwasu polikarboksylowego benzenu (BPCA). Podejście specyficzne dla związku w unikalny sposób dostarcza jednoczesnych informacji o charakterystyce, ilości i składzie izotopowym (13C i 14C) PyC.

Charakterystyka, kwantyfikacja i analiza izotopowa specyficzna dla związku węgla pirogennego przy użyciu polikarboksylowych kwasów benzenowych (BPCA)

Przedstawiono protokół równoległej produkcji wytrąconego węglanu wapnia i materiału zeolitowego z żużla wielkopiecowego poprzez karbonatyzację minerałów i alkaliczną konwersję hydrotermalną. Badana jest wydajność materiału zeolitowego w kierunku adsorpcji niklu.

Dwukierunkowa waloryzacja żużla wielkopiecowego: synteza wytrąconego węglanu wapnia i zeolitowego adsorbentu metali ciężkich

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Przestrzenne wzorce erozji i osadzania się gleby można wywnioskować z różnic w wysokości gruntu odwzorowanych w odpowiednich przyrostach czasu. Takie zmiany wysokości są związane ze zmianami węglanów glebowych przy powierzchni. Opisano tutaj powtarzalne metody pomiarów terenowych i laboratoryjnych tych wielkości oraz metody analizy danych.

Pomiar i mapowanie wzorców erozji i depozycji gleby związanych ze stężeniami węglanów w glebie w ramach gospodarki rolnej

Opisujemy protokół wytrącania i charakterystyki kryształów węglanu wapnia, które powstają w obecności biopolimerów.

Tworzenie węglanu wapnia w obecności dodatków biopolimerowych

Opisana tutaj metoda weryfikacji jest przystosowana do monitorowania pedogenicznej sekwestracji węgla nieorganicznego w różnych glebach rolnych wzbogaconych skałami zawierającymi krzemian metali ziem alkalicznych, takich jak wollastonit, bazalt i oliwin. Ten rodzaj walidacji jest niezbędny dla programów kredytów węglowych, które mogą przynieść korzyści rolnikom, którzy sekwestrują dwutlenek węgla na swoich polach.

Monitorowanie pedogennej akumulacji węgla nieorganicznego spowodowanej wietrzeniem zmodyfikowanych minerałów krzemianowych w glebach rolnych.

Ten protokół służy do izolowania ziaren kwarcu według wielkości w celu datowania luminescencyjnego osadów. Opisano fizyczne oczyszczanie i trawienie chemiczne poprzez sekwencyjne moczenie wH2O2, HCl, HF i HCl ponownie w celu wyizolowania ziaren kwarcu. Czystość kwarcu określa się ilościowo za pomocą oceny mikroskopowej, spektroskopii Ramana i współczynnika zubożenia IR.

Izolacja ziaren kwarcu do optycznie stymulowanej luminescencji (OSL) Datowanie osadów czwartorzędowych do badań paleośrodowiskowych

Protokół przedstawia serię najlepszych praktyk w zakresie pobierania proszku kostnego z ośmiu zalecanych miejsc pobierania próbek anatomicznych (konkretne miejsca na danym elemencie szkieletu) na pięciu różnych elementach szkieletu od średniowiecznych osobników (radiowęgiel datowany na okres ok. 1040-1400 CE, kalibrowany zakres 2-sigma).

Zoptymalizowane protokoły pobierania próbek kości w celu odzyskania starożytnego DNA ze szczątków archeologicznych

Ten protokół opisuje łatwą w użyciu metodę badania utleniania substratu poprzez śledzenie produkcji 14CO2 in vitro.

Ocena utleniania substratu energetycznego in vitro z pułapkowaniem 14CO2

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Naucz się pobierania próbek węglanu szkliwa zębów do analizy izotopów węgla i tlenu. Ta metoda pozwala rekonstruować dietę i środowisko w badaniach archeologicznych i paleontologicznych.

Pobieranie próbek i obróbka wstępna węglanu szkliwa zębów w celu stabilnej analizy izotopów węgla i tlenu

Przeglądaj więcej filmów