Name: Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów skurczu mięśni gładkich oraz przesiewanie nowych leków przeciwnadciśnieniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Wei Qi He (Soochow University, Suzhou, Chiny) i Dr. Yan Ning Qiao (Shaanxi Normal University, Xi'an, Chiny) za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant 31272311, 81373295 i 81473420) oraz projekt finansowany przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwój Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (Grant nr ysxk-2016).

Manipulacje na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania (IACUC) Centrum Badań nad Modelowymi Zwierzętami Uniwersytetu w Nankinie.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór HEPES-Tyrode (H-T) używając 137,0 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.</li>
	<li>Przygotuj roztwór HEPES-Tyrode bez wapnia (Ca2+ wolny od HT) przy użyciu 140,6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.</li>
	<li>Przygotuj roztwór HEPES-Tyrode używając 124 mM KCl (High K+), używając 15,7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Podgrzej roztwory H-T i High-K+ w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Włącz system miograph, sprzęt do akwizycji danych i komputer.</li>
	<li>Ostrożnie napełnij wszystkie komory miografu po 5 ml roztworu HT każda.</li>
	<li>Napełnij dwie szalki Petriego odpowiednio 20 ml roztworów H-T o temperaturze 4 °C i Ca2+ wolnych od H-T i przechowuj na lodzie.</li>
	<li>Napełnij pokrytą 10 cm szalką Petriego 20 ml roztworu HT i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie tętnicy krezkowej myszy
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 8-12-tygodniową samicę lub samca myszy C57BL/6J przez zwichnięcie szyjki macicy. Przypnij mysz brzuchem skierowanym do góry.</li>
	<li>Zwilż brzuch 70% etanolem. Następnie przeciąć skórę nożyczkami wzdłuż brzusznej linii środkowej od pachwiny i wykonać nacięcia od początku pierwszego nacięcia w dół do nóg po obu stronach. Odciągnij skórę z powrotem po obu stronach; Wykonaj podobne nacięcia, aby otworzyć otrzewną.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek przetnij przełyk, okrężnicę i inne tkanki łączne, aby całkowicie odizolować przewód pokarmowy z naczyniem pokarmowym od organizmu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś wyizolowany segment do naczynia zawierającego zimną HT przygotowaną w kroku 2.4 i delikatnie przepłucz tkankę w roztworze HT kilka razy, aby zmyć krew.</li>
	<li>Przenieść wyizolowany segment na powlekaną szalkę Petriego przygotowaną w kroku 2.5 i przeprowadzić rozwarstwienie tętnicy krezkowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wygładź żołądek, jelito czcze, jelito kręte i kątnicę w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, a żołądek i kątnicę przypnij odpowiednio po lewej i prawej stronie.</li>
	<li>Rozciągnij łożysko naczyniowe krezki i przymocuj jelito szpilkami, aby odsłonić wypreparowane tętnice krezkowe. 
	Uwaga: W tych warunkach tętnice znajdują się na szczycie żył.</li>
	<li>Włącz transmisyjne źródło światła mikroskopu stereoskopowego i wypreparuj tętnice pod mikroskopem. Upewnij się, że cała tkanka jest zanurzona w roztworze.</li>
	<li>Zacisnąć tkankę tłuszczową wokół tętnic za pomocą kleszczy i odizolować tętnice, odcinając wszystkie tkanki łączne nożyczkami preparacyjnymi. Unikaj uszkodzenia tętnic.</li>
</ol>
4. Montaż tętniczy
<ol>
	<li>Przenieść i zanurzyć drzewo tętnicze krezkowe w zimnym roztworze HT wolnym od Ca2+ (przygotowanym w kroku 2.4), zaciskając nadmiar tętnic kleszczami.</li>
	<li>Odetnij 1,4-milimetrową część tętnicy proksymalnie do ściany jelita arkady krezki i użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie otworzyć obie strony tego odcinka tętnicy.</li>
	<li>Przygotuj dwa segmenty drutu ze stali nierdzewnej o długości 2,5 cm i umieść je w tym samym naczyniu.</li>
	<li>Delikatnie zaciśnij jeden koniec tętnicy za pomocą kleszczy i ostrożnie włóż dwa druty do światła tętnicy jeden po drugim za pomocą innych kleszczyków. Upewnij się, że druty są trzymane prosto i nie dotykają śródbłonka.</li>
	<li>Używając dwóch kleszczyków, zacisnąć jednocześnie dwa stalowe druty na zewnątrz gwintowanego naczynia i ostrożnie przenieść naczynie z płytki Petriego do komory miografu uprzednio wypełnionej roztworem HT (krok 2.3).</li>
	<li>Rozkręć szczęki, aby zrobić miejsce na montaż. Zaciśnij obie strony jednego z dwóch włożonych drutów za pomocą dwóch kleszczyków i umieść naczynie w szczelinie szczęki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Owiń obie strony zaciśniętego drutu wokół szczęki podłączonej do mikrometru (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
	<li>Zamocuj lewą, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Wyprostuj drut za pomocą kleszczy po prawej stronie, a następnie przykręć prawą, przekręcając zgodnie z ruchem wskazówek zegara (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C). Upewnij się, że naczynie zawsze znajduje się w szczelinie szczęki, ale nie dotykaj szczęki, aby uniknąć uszkodzenia.</li>
	<li>Zamknij obie szczęki za pomocą mikrometru (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D). Upewnij się, że dwie szczęki są wystarczająco blisko, ale nie stykają się ze sobą i że niezamocowany drut znajduje się na górze zamocowanego drutu.</li>
	<li>Używając kleszczyków po prawej stronie, ostrożnie złóż odkręcony drut w rogu szczęki połączonej z przetwornikiem siły i owiń go zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół po prawej stronie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Następnie dokręć. Powtórz ten krok po lewej stronie przewodu i przykręć po lewej stronie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Lekko rozsuń szczęki, ostrożnie obracając mikrometr (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Unikaj rozciągania naczynia. Za pomocą kleszczy przesuń drut po stronie mikrometra do płaszczyzny poziomej drutu po stronie przetwornika. Ostrożnie obróć mikrometr tak, aby szczelina między dwiema szczękami mogła po prostu pomieścić dwa druty.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.2 – 4.11, aby zamontować tętnice na pozostałych komorach. Podłącz wszystkie komory do urządzenia, przykryj komory, podłącz 100% dopływ tlenu i sondę temperatury, a następnie rozpocznij podgrzewanie do 37 °C. Otwórz oprogramowanie do tworzenia wykresów i naciśnij przycisk Start w oknie Widok wykresu, aby rozpocząć nagrywanie.</li>
	<li>Równowaga przez około 20 minut.</li>
</ol>
5. Normalizacja
Uwaga: W celu standaryzacji warunków eksperymentalnych i uzyskania niezawodnej reakcji fizjologicznej naczyń krwionośnych, konieczna jest procedura normalizacji15. Zgodnie z relacją między siłą czynną a wewnętrznym obwodem statku, system miografu drutowego ma standardowy program normalizacyjny do oceny obwodu wewnętrznego (IC) zamontowanego statku5,8,9. Krótko, aby obliczyć IC (μm), odczytaj mikrometr i wprowadź wartość jako wartość X, a siłę wyjściową przetwornika, tj. naprężenie spoczynkowe ścianki (mN / mm), jako wartość Y. Program zwróci dopasowaną krzywą (X, Y) i obliczy IC odpowiadającą ciśnieniu przezściennemu 100 mmHg (IC100). Naczynie jest ustawione na znormalizowany obwód wewnętrzny (IC1), gdy aktywna reaktywność jest maksymalna.
<ol>
	<li>Ustaw siły na zero dla wszystkich kanałów w urządzeniu i równoważ przez kolejne 1-2 minuty.</li>
	<li>Wybierz Ustawienia normalizacji z menu "DMT" i ustaw parametry w następujący sposób: 
	Kalibracja okularu (mm/dz.): 0,36; Ciśnienie docelowe (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Czas uśredniania online (sekundy): 2; Czas opóźnienia (sekundy): 60. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Ustawienia normalizacji DMT.</li>
	<li>Wybierz interesujący Cię kanał z menu DMT, aby otworzyć okno normalizacji DMT dla odpowiedniego kanału. Wprowadź wartości stałe do okna w następujący sposób: Punkty końcowe tkanek a1: 0,1; Punkty końcowe tkanek a2: 4; Średnica drutu (μm): 40. W oknie wyświetlana jest obliczona długość naczynia jako 1,40 mm.</li>
	<li>Odczytać mikrometr odpowiedniej komory tkankowej. Wprowadź wartość w polu Odczyt mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt. Ta wartość jest początkową wartością X (X0). Po upływie 60 sekund w oknie wyświetlana jest siła i ciśnienie efektywne (ERTP) odpowiadające tej wartości mikrometru. W tym samym czasie uaktywnia się pole odczytu mikrometru.</li>
	<li>Rozciągnąć normalizowane naczynie, obracając mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Wprowadź wartość mikrometru w polu Odczyt mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt. Ponownie poczekaj na czas opóźnienia wynoszący 60 s.</li>
	<li>Powtórz krok 5.5, kontynuuj rozciąganie naczynia i dodawaj wartości mikrometrów, aż w oknie pojawi się wartość "Mikrometr X1", która jest obliczonym ustawieniem mikrometru wymaganym do rozciągnięcia naczynia do IC1.</li>
	<li>Ustaw mikrometr na wartość X1. 
	Uwaga: Znormalizowane napięcie wynosi zwykle 1-2 mN.</li>
</ol>
6. Rejestracja skurczu tętnic
Uwaga: Wszystkie roztwory, w tym rozwiązania H-T i High-K+ użyte w tej sekcji, zostały przygotowane w kroku 2.1.
<ol>
	<li>Po normalizacji równoważyć naczynie w komorze przez 15-20 min. 
	Uwaga: W tym kroku nie ma potrzeby zmiany rozwiązania.</li>
	<li>Dwukrotnie rzuć wyzwanie naczyniu roztworem High-K+.
	<ol>
		<li>Aby rzucić wyzwanie naczyniu, zastąp roztwór H-T 5 ml roztworu High-K+, aby wywołać skurcz przez 10 minut, a następnie przemyj 5 ml roztworu H-T 3-4 razy. 
		Uwaga: Typowy skurcz ma maksymalną siłę powyżej 3 mN i stałą siłę podtrzymywaną około 2,5 mN12. Jeśli pierwsze prowokacja generuje maksymalną siłę poniżej 2,5 mN lub utrzymująca się siła zmniejsza się z czasem, lub drugie prowokacja generuje znacznie mniejszą siłę niż pierwsza dawka, naczynie jest odrzucane i nie będzie używane do dalszych badań.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rzuć wyzwanie naczyniu 5 ml roztworu High-K+, aby wywołać skurcz. Po 5 minutach dodać 0,5 μl roztworu podstawowego neolenzyny (10 mM w DMSO)14 do komory, aby rozluźnić naczynie przy końcowym stężeniu 1 μM neolienzyny.</li>
	<li>Gdy siła jest stabilna (zwykle trwa to kilka minut), dodaj kolejne 0,5 μl roztworu podstawowego neolenzyny do komory, aby zwiększyć stężenie do 2 μM. Za każdym razem dodawać 1 μl roztworu podstawowego, aby zwiększyć stężenie do 4, 6, 8 i 10 μM, aby uzyskać krzywą dawka-odpowiedź. 
	Uwaga: Stężenia podstawowe i robocze różnią się w zależności od leku.</li>
</ol>

<ol><li>Bevan, J. A., Osher, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+recording+tension+changes+in+the+wall+of+small+blood+vessels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+and+Actions%22%5BJournal%5D)">A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro.</a> Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).</li>
<li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ.</a> Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).</li>
<li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+Properties+of+Small+Arterial+Resistance+Vessels+in+Spontaneously+Hypertensive+and+Normotensive+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats.</a> Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).</li>
<li>Mulvany, M. J., Nyborg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increased+calcium+sensitivity+of+mesenteric+resistance+vessels+in+young+and+adult+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats.</a> British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).</li>
<li>Mulvany, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulvany%2C+MJ+%22Procedures+for+investigation+of+small+vessels+using+small+vessel+myograph%22">Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph</a>. , Danish Myo Technology. Denmark. (2004).</li>
<li>Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+smooth+muscle+cells+in+the+walls+of+arterial+resistance+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels.</a> The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).</li>
<li>Michael, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+blood+pressure+arising+from+a+defect+in+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High blood pressure arising from a defect in vascular function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).</li>
<li>Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+artery+contraction+and+relaxation+studies+using+automated+wire+myography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>del Campo, L., Ferrer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3adel+Campo%2C+L+%22Wire+Myography+to+Study+Vascular+Tone+and+Vascular+Structure+of+Isolated+Mouse+Arteries%22">Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries</a>. , Springer. New York. (2015).</li>
<li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).</li>
<li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+the+kidney+and+systemic+tissues+in+blood+pressure+regulation+by+the+renin-angiotensin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).</li>
<li>Qiao, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+phosphatase+target+subunit+1+%28MYPT1%29+regulates+the+contraction+and+relaxation+of+vascular+smooth+muscle+and+maintains+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+myosin+light+chain+kinase+in+regulation+of+basal+blood+pressure+and+maintenance+of+salt-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).</li>
<li>Yang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+a+tribenzylisoquinoline+alkaloid+from+Nelumbo+nucifera+Gaertn%2C+a+novel+potential+smooth+muscle+relaxant%5BTitle%5D)+AND+%22Fitoterapia%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant.</a> Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).</li>
<li>Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Normalization+Factor+for+Wire+Myography+of+Rat+Femoral+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery.</a> Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).</li>
<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+hypertension%3A+analysis+of+worldwide+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).</li>
<li>Good, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Ion+Buffers+for+Biological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Ion Buffers for Biological Research.</a> Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nadciśnienie tętnicze jest powszechnym wyzwaniem dla zdrowia publicznego ze względu na poważne powikłania, w tym choroby układu krążenia i nerek16. Zrozumienie patogenezy nadciśnienia tętniczego i zbadanie większej liczby leków przeciwnadciśnieniowych stało się pilnym zadaniem w tej dziedzinie. Ciśnienie krwi jest generowane i utrzymywane przez obwodowy opór krążenia. Zgodnie z prawem Poiseuille'a, stosunkowo małe tętnice generują dużą część oporu krążenia i służą jako dominujący producent ciśnien...

System miograficzny małych naczyń używany tutaj służył do pomiaru izometrycznego skurczu małych naczyń oporowych o wewnętrznych średnicach od 100 do 400 μm. Izolowane małe naczynia (o długości około 2 mm) były wprowadzane za pomocą dwóch drutów o średnicy 40 μm, a następnie były kolejno montowane na szczękach po stronie mikrometra i przetwornika. Ta technika miograficzna została po raz pierwszy zaproponowana w 1972 roku1, a następnie rozwinięta głównie przez Mulvany'ego i jego kolegów2,3,4,5,6. Jest to teraz dojrzała technika ze stabilnym sprzętem, łatwym wykonaniem i standardową procedurą normalizacji7,8,9. Zastosowaliśmy tę metodę z pewnymi modyfikacjami do pomiarów w tętnicy krezkowej myszy.
Mięśnie gładkie naczyń krwionośnych pokrywają ściany prawie wszystkich naczyń krwionośnych. Ich podstawową funkcją jest generowanie sił poprzez skurcz w odpowiedzi na różne bodźce. Prawidłowa kurczliwość mięśni gładkich naczyń krwionośnych jest niezbędna do regulacji ciśnienia krwi i suplementu diety10. Nieprawidłowa regulacja ciśnienia krwi skutkuje różnymi chorobami, w tym nadciśnieniem, niewydolnością serca i niedokrwieniem. Kilka badań sugeruje, że nieprawidłowe ciśnienie krwi jest zawsze związane z dysfunkcją kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych7,11,12,13. Metoda miografowa pozwala na badanie izometrycznej kurczliwości naczyń myszy indukowanej różnymi bodźcami, w tym środkami zwężającymi naczynia krwionośne, inhibitorami i lekami. Skuteczne pomiary skurczu pomogą nam zrozumieć mechanizmy utrzymania ciśnienia krwi i patogenezę chorób związanych z mięśniami gładkimi naczyń krwionośnych oraz zbadać nowe podejścia terapeutyczne.
Wiele chińskich ziół było powszechnie stosowanych w klinicznym leczeniu chorób naczyniowych; jednak ich skuteczne składniki zazwyczaj pozostają nieznane. W związku z tym izolacja i identyfikacja skutecznych składników jest bardzo ważna dla rozwoju nowych leków. Technologia miografu wielodrutowego oferuje proste podejście do badań przesiewowych składników aktywnych w ziołach. Opisaliśmy kilka badań z wykorzystaniem systemu miografu małych naczyń do zbadania skurczu tętnicy krezkowej myszy i zidentyfikowaliśmy naturalne związki o działaniu przeciwnadciśnieniowym12,13,14. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół metody miografu i oceniamy działanie rozkurczające neoliensyniny wyizolowanej z zarodków nasion lotosu (Nelumbo nucifera Gaertn).14.

<table><tbody><tr><td>Wieloprzewodowy system miograficzny</td><td>DMT</td><td>610-M</td><td></td></tr><tr><td>Drut ze stali nierdzewnej</td><td>DMT</td><td>400447</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparacji Geuder</td><td>DMT</td><td>400431</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>DMT</td><td>300413</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab/8SP</td><td>ADInstruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>ADInstruments</td><td>LabChart 5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>SigmaAldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100511-0250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SigmaAldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Technika miografu drutowego jest używana do oceny kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych w odpowiedzi na depolaryzację, agonistów/inhibitory GPCR i leki. Jest szeroko stosowany w wielu badaniach nad fizjologicznymi funkcjami mięśni gładkich naczyń krwionośnych, patogenezą chorób naczyniowych, takich jak nadciśnienie, oraz opracowywaniem leków zwiotczających mięśnie gładkie. Mysz jest szeroko stosowanym zwierzęciem modelowym z dużą pulą modeli chorób i genetycznie modyfikowanych szczepów. Wprowadziliśmy tę metodę, aby szczegółowo zmierzyć izometryczny skurcz tętnicy krezkowej myszy. 1,4-milimetrowy odcinek tętnicy oporowej krezki myszy wyizolowano i zamontowano na komorze miografu, przepuszczając dwa stalowe druty przez jej światło. Po etapach równoważenia i normalizacji segment naczynia został wzmocniony roztworem o wysokiej zawartości K+ dwukrotnie przed testem skurczowym. Jako przykład zastosowania tej metody w opracowywaniu leków, zmierzyliśmy działanie rozkurczające nowej substancji naturalnej, neoliensyny, wyizolowanej z chińskiego zioła, zarodków nasion lotosu (Nelumbo nucifera Gaertn.) na tętnice krezkowe myszy. Segmenty naczyń zamontowane w komorze miografu stymulowano roztworem o wysokiej zawartości K+. Gdy napięcie siły osiągnęło stabilną, podtrzymaną fazę, do komory dodawano skumulowane dawki neolienzyny. Odkryliśmy, że neolienzynina ma zależne od dawki działanie rozkurczające skurcze mięśni gładkich, co sugeruje, że ma ona potencjalne działanie przeciwko nadciśnieniu. Ponadto, ponieważ segment naczynia może przetrwać co najmniej 4 godziny po zamontowaniu i wielokrotnie utrzymywać kurczliwość wywołaną przez roztwór o wysokiej zawartości K+, sugerujemy, że system miografu drutowego może być używany do czasochłonnego procesu badań przesiewowych leków.

Zmierzyliśmy izometryczną kurczliwość tętnicy krezkowej myszy z wykorzystaniem wielodrutowego systemu mojograficznego i oceniliśmy efekt rozkurczowy neoliensininy oczyszczonej z embrionów nasion lotosu (Nelumbo nucifera Gaertn.)14. Tętnicę oporową krezkową myszy wyizolowano, oczyszczono z tkanek łącznych i pocięto na segmenty o długości 1,4 mm. Segment tętnicy wprowadzono za pomocą dwóch stalowych drutów do roztworu H-T pozbawionego Ca2+ w szalc...

Technika wirekowego miografu jest używana do badania funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych i badania przesiewowego nowych leków. Przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy oraz badań przesiewowych nowych środków zwiotczających mięśnie gładkie naczyń krwionośnych.

Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Nasze laboratorium od wielu lat stosuje metodę miografu drucianego do pomiaru kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Używamy tej techniki do badania mechanizmu skurczu mięśni gładkich. Wykorzystujemy tę metodę do poszukiwania nowych leków stosowanych w terapii nadciśnienia tętniczego.Główną zaletą tej techniki jest to, że segment naczynia przeżywa co najmniej cztery godziny po zamontowaniu i utrzymuje kurczliwość wywołaną wysokim poziomem potasu przez wiele razy. Wielokanałowy system daje możliwość badań przesiewowych nowych leków na wysokim poziomie terapii. Przypnij ciało uśpionej myszy brzuchem skierowanym do góry i zwilż brzuch 70% etanolem.Następnie, po użyciu nożyczek do przecięcia skóry wzdłuż brzusznej linii środkowej od pachwiny, wykonaj nacięcia w dół każdej nogi od początku pierwszego nacięcia. Odciągnij skórę z powrotem po obu stronach, a następnie wykonaj podobne nacięcia, aby otworzyć otrzewną. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć przełyk, okrężnicę i inne tkanki łączne, aby całkowicie odizolować przewód pokarmowy z naczyniem pokarmowym od organizmu.Po wypłukaniu krwi z przewodu pokarmowego roztworem HEPES-Tyrode lub HT, wyizolowany segment przenieść na powlekaną szalkę Petriego w celu wycięcia tętnicy krezkowej w temperaturze pokojowej. Wygładź żołądek, jelito czcze, jelito kręte i jelito ślepe w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i przypnij żołądek i jelito ślepe odpowiednio po lewej i prawej stronie. Włącz transmisyjne źródło światła mikroskopu stereoskopowego i przymocuj jelito za pomocą szpilek, aby odsłonić wypreparowane tętnice krezkowe.Następnie zaciśnij tkankę tłuszczową wokół tętnic kleszczami i ostrożnie odizoluj tętnice, odcinając wszystkie tkanki łączne nożyczkami do preparowania. Chwyć nadmiar tętnicy kleszczami, przenieś i zanurz drzewo tętnicy krezkowej w zimnym, wolnym od jonów wapnia roztworze HT. Odetnij 1,4 milimetra część tętnicy proksymalnie do ściany jelita arkady krezki i użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie otworzyć obie strony tego odcinka tętnicy.Przygotuj dwa segmenty drutu ze stali nierdzewnej o długości 2,5 centymetra i umieść je w tym samym naczyniu. Użyj kleszczy, aby delikatnie zacisnąć jeden koniec tętnicy. Następnie użyj kolejnych kleszczy, aby ostrożnie wprowadzić dwa przewody do światła tętnicy jeden po drugim.Upewnij się, że druty są trzymane prosto i nie dotykają śródbłonka. Za pomocą dwóch kleszczyków zacisnąć oba druty jednocześnie na zewnątrz gwintowanego naczynia i ostrożnie przenieść naczynie z szalki Petriego do komory miografu wypełnionej roztworem HT. Rozkręć szczęki komory, aby zrobić miejsce do montażu, a następnie chwyć obie strony jednego z dwóch włożonych drutów za pomocą dwóch kleszczyków i umieść naczynie w szczelinie szczęki.Owiń obie strony zaciśniętego drutu wokół szczęki podłączonej do mikrometru. Zamocuj po lewej stronie, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Następnie użyj kleszczy, aby wyprostować drut.Następnie przykręć po prawej stronie, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Upewnij się, że naczynie zawsze znajduje się w szczelinie szczęki, ale nie dotykaj szczęki, aby uniknąć uszkodzenia. Zamknij obie szczęki za pomocą mikrometru.Upewnij się, że dwie szczęki są wystarczająco blisko, ale nie stykają się ze sobą, a niezamocowany drut znajduje się na górze nieruchomego drutu. Za pomocą kleszczy po prawej stronie ostrożnie złóż odkręcony drut w rogu szczęki połączonej z przetwornikiem siły i owiń go zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół po prawej stronie. Następnie dokręć.Powtórz rozkładanie i owijanie lewej strony drutu i dokręć po lewej stronie. Następnie lekko rozsuń szczęki bez rozciągania naczynia, ostrożnie obracając mikrometr tak, aby szczelina między dwiema szczękami mogła po prostu pomieścić dwa druty. Następnie za pomocą kleszczyków przesuń drut po stronie mikrometra do płaszczyzny poziomej drutu po stronie przetwornika.Po zamontowaniu tętnic w pozostałych komorach należy połączyć wszystkie komory z urządzeniem i zakryć komory. Podłącz dopływ 100% tlenu i sondę temperatury i rozpocznij podgrzewanie do 37 stopni Celsjusza. Otwórz oprogramowanie do tworzenia wykresów.Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie. Wybierz interesujący Cię kanał z menu DMT, aby otworzyć okno normalizacji DMT dla odpowiedniego kanału. Wprowadź następujące wartości stałe w oknie:Punkty końcowe tkanki a1, 0.1; Punkty końcowe tkanek a2, 4; Średnica drutu, 40.W oknie zostanie wyświetlona obliczona długość naczynia jako 1,40 milimetra. Odczytać mikrometr odpowiedniej komory tkankowej. Wprowadź wartość w polu odczytu mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt.Wartość ta jest początkową wartością X. Po upływie 60 sekund w oknie wyświetlana jest siła i ciśnienie efektywne odpowiadające tej wartości mikrometru. W tym samym czasie uaktywnia się skrzynka odczytu mikrometru. Rozciągnąć normalizowane naczynie, obracając mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.Wprowadź wartość mikrometru w polu odczytu mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt. Ponownie poczekaj na opóźnienie wynoszące 60 sekund. Kontynuuj rozciąganie naczynia i dodawaj wartości mikrometrów, aż w oknie pojawi się wartość mikrometra X-jeden, która jest obliczonym ustawieniem mikrometru wymaganym do rozciągnięcia naczynia do jego IC-one.Ustaw mikrometr na wartość X-one. Po normalizacji równoważyć naczynie w komorze przez 15 do 20 minut. Po zrównoważeniu rzuć wyzwanie naczyniu roztworem o wysokiej zawartości potasu, zastępując roztwór HT 5 mililitrami roztworu o wysokiej zawartości potasu, aby wywołać skurcz przez 10 minut.Po powtórzeniu 10-minutowej inkubacji w świeżym roztworze o wysokiej zawartości potasu, przemyć pięcioma mililitrami roztworu HT trzy do czterech razy. Ponownie rzuć wyzwanie naczyniu pięcioma mililitrami roztworu o wysokiej zawartości potasu, aby wywołać skurcz. Po pięciu minutach dodać 0,5 mikrolitra roztworu podstawowego neolienzyny do komory, aby rozluźnić naczynie przy końcowym stężeniu jednej mikromolowej neolienzyny.Gdy siła ustabilizuje się po kilku minutach, dodaj kolejne 0,5 mikrolitra roztworu podstawowego neoliensyny, aby zwiększyć stężenie do dwóch mikromolów. Za każdym razem dodawać jeden mikrolitr roztworu podstawowego, aby zwiększyć stężenie do czterech, sześciu, ośmiu i dziesięciu mikromolów, aby wygenerować krzywą dawka-odpowiedź. Podczas procedury normalizacji naczynie było kilkakrotnie rozciągane, aż do osiągnięcia wartości IC-100, a każdy rozciągnięty cykl obejmował silny skurcz, szybkie rozluźnienie i utrzymanie siły w ciągu 60 sekund.Skurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych wywołany przez roztwór potasu o wysokiej zawartości potasu zwykle wykazywał dwie fazy, fazę mocną i fazę podtrzymywaną. Opisano metodę pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą wieloprzewodowego systemu miografu. Metoda ta może być stosowana do oceny funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz do badań przesiewowych środków zwiotczających mięśnie gładkie.Główna różnica między tą metodą a innymi polega na krokach montażu. Ten zastosowany tutaj krok jest łatwy do wykonania i nie uszkadza tkanki ani urządzenia. Po tej procedurze można również zastosować inne stymulatory, takie jak EP i angiotensyna II, w celu stymulacji skurczu mięśni gładkich w celu znalezienia nowych leków, które są wrażliwe na tego agonistę.

isometric-contractility-measurement-mouse-mesenteric-artery-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano zautomatyzowaną metodę miografii do pomiarów siły w izolowanych tętnicach krezkowych. Wykorzystuje ona urządzenie Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A do określania reakcji na fenylefrynę oraz wapń zewnątrzkomórkowy. Metoda ta pozwala na spójne określanie odpowiedzi izometrycznych na agonistów w małych naczyniach o średnicach od 60 do 300 μm, niezależnie od siebie.

Badania skurczu i rozkurczu tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drucianej

W miografii ciśnieniowej, nienaruszony mały fragment naczynia jest montowany na dwóch małych kaniulach i podbudowywany do odpowiedniego ciśnienia świetlnego. Tutaj opisujemy metodę pomiaru odpowiedzi wazorelaksacyjnej myszy tętnic krezkowych 3. rzędu u myszy c57 i sGCα1-/- myszy za pomocą miografii ciśnieniowej.

Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Miografia ciśnieniowa służy do oceny wazoaktywności małych tętnic, które rozwijają trwałe zwężenie pod wpływem ciśnienia. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół oceny w izolowanych odcinkach małych tętnic krezkowych u szczurów, wazoaktywności i wpływu ciśnienia śródświetlnego na średnicę naczyń krwionośnych.

Ocena odpowiedzi miogennej i wazoaktywności w opornych tętnicach krezkowych za pomocą miografii ciśnieniowej

Mysi mięsień brodawkowaty lewej komory może być użyty do zbadania kurczliwości serca in vitro. W tym artykule szczegółowo opisano izolację i protokoły eksperymentalne do badania charakterystyki kurczliwości serca.

Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Protokół opisuje użycie miografii drucianej do oceny przezściennego napięcia izometrycznego tętnic krezkowych wyizolowanych od myszy, ze szczególnym uwzględnieniem modulacji przez czynniki uwalniane z komórek śródbłonka i okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej.

Ocena reakcji na napięcie naczyniowe przy użyciu izolowanych tętnic krezkowych z naciskiem na modulację przez okołonaczyniowe tkanki tłuszczowe

Niniejszy protokół opisuje koncepcje i techniczne zastosowanie techniki miografu tensometrycznego z wykorzystaniem wielokomorowego systemu miograficznego w eksperymentalnej ocenie ex vivo funkcji śródbłonka aorty myszy.

Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w aorcie piersiowej myszy za pomocą tensometrycznej miografii komory o małej objętości

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana za pomocą kauteryzacji. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawału oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.

Zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Jelito cienkie jest często narażone na działanie toksyn, które mogą wpływać na przepływ krwi i negatywnie wpływać na wchłanianie składników odżywczych. Za pomocą multimiografu i izolatów tętnic i żył krezkowych można badać pod kątem wazoaktywności związki lub toksyny.

Izolowanie i wykorzystanie odcinków tętnicy i żyły krezkowej bydła jako testu biologicznego do badania wazoaktywności w jelicie cienkim

Poznaj izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów skurczu mięśni gładkich oraz przesiewanie nowych leków przeciwnadciśnieniowych.

Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej

Przeglądaj więcej filmów