Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej
August 20th, 2018
Technika wirekowego miografu jest używana do badania funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych i badania przesiewowego nowych leków. Przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy oraz badań przesiewowych nowych środków zwiotczających mięśnie gładkie naczyń krwionośnych.
Nasze laboratorium od wielu lat stosuje metodę miografu drucianego do pomiaru kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Używamy tej techniki do badania mechanizmu skurczu mięśni gładkich. Wykorzystujemy tę metodę do poszukiwania nowych leków stosowanych w terapii nadciśnienia tętniczego.
Główną zaletą tej techniki jest to, że segment naczynia przeżywa co najmniej cztery godziny po zamontowaniu i utrzymuje kurczliwość wywołaną wysokim poziomem potasu przez wiele razy. Wielokanałowy system daje możliwość badań przesiewowych nowych leków na wysokim poziomie terapii. Przypnij ciało uśpionej myszy brzuchem skierowanym do góry i zwilż brzuch 70% etanolem.
Następnie, po użyciu nożyczek do przecięcia skóry wzdłuż brzusznej linii środkowej od pachwiny, wykonaj nacięcia w dół każdej nogi od początku pierwszego nacięcia. Odciągnij skórę z powrotem po obu stronach, a następnie wykonaj podobne nacięcia, aby otworzyć otrzewną. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć przełyk, okrężnicę i inne tkanki łączne, aby całkowicie odizolować przewód pokarmowy z naczyniem pokarmowym od organizmu.
Po wypłukaniu krwi z przewodu pokarmowego roztworem HEPES-Tyrode lub HT, wyizolowany segment przenieść na powlekaną szalkę Petriego w celu wycięcia tętnicy krezkowej w temperaturze pokojowej. Wygładź żołądek, jelito czcze, jelito kręte i jelito ślepe w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i przypnij żołądek i jelito ślepe odpowiednio po lewej i prawej stronie. Włącz transmisyjne źródło światła mikroskopu stereoskopowego i przymocuj jelito za pomocą szpilek, aby odsłonić wypreparowane tętnice krezkowe.
Następnie zaciśnij tkankę tłuszczową wokół tętnic kleszczami i ostrożnie odizoluj tętnice, odcinając wszystkie tkanki łączne nożyczkami do preparowania. Chwyć nadmiar tętnicy kleszczami, przenieś i zanurz drzewo tętnicy krezkowej w zimnym, wolnym od jonów wapnia roztworze HT. Odetnij 1,4 milimetra część tętnicy proksymalnie do ściany jelita arkady krezki i użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie otworzyć obie strony tego odcinka tętnicy.
Przygotuj dwa segmenty drutu ze stali nierdzewnej o długości 2,5 centymetra i umieść je w tym samym naczyniu. Użyj kleszczy, aby delikatnie zacisnąć jeden koniec tętnicy. Następnie użyj kolejnych kleszczy, aby ostrożnie wprowadzić dwa przewody do światła tętnicy jeden po drugim.
Upewnij się, że druty są trzymane prosto i nie dotykają śródbłonka. Za pomocą dwóch kleszczyków zacisnąć oba druty jednocześnie na zewnątrz gwintowanego naczynia i ostrożnie przenieść naczynie z szalki Petriego do komory miografu wypełnionej roztworem HT. Rozkręć szczęki komory, aby zrobić miejsce do montażu, a następnie chwyć obie strony jednego z dwóch włożonych drutów za pomocą dwóch kleszczyków i umieść naczynie w szczelinie szczęki.
Owiń obie strony zaciśniętego drutu wokół szczęki podłączonej do mikrometru. Zamocuj po lewej stronie, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Następnie użyj kleszczy, aby wyprostować drut.
Następnie przykręć po prawej stronie, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Upewnij się, że naczynie zawsze znajduje się w szczelinie szczęki, ale nie dotykaj szczęki, aby uniknąć uszkodzenia. Zamknij obie szczęki za pomocą mikrometru.
Upewnij się, że dwie szczęki są wystarczająco blisko, ale nie stykają się ze sobą, a niezamocowany drut znajduje się na górze nieruchomego drutu. Za pomocą kleszczy po prawej stronie ostrożnie złóż odkręcony drut w rogu szczęki połączonej z przetwornikiem siły i owiń go zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół po prawej stronie. Następnie dokręć.
Powtórz rozkładanie i owijanie lewej strony drutu i dokręć po lewej stronie. Następnie lekko rozsuń szczęki bez rozciągania naczynia, ostrożnie obracając mikrometr tak, aby szczelina między dwiema szczękami mogła po prostu pomieścić dwa druty. Następnie za pomocą kleszczyków przesuń drut po stronie mikrometra do płaszczyzny poziomej drutu po stronie przetwornika.
Po zamontowaniu tętnic w pozostałych komorach należy połączyć wszystkie komory z urządzeniem i zakryć komory. Podłącz dopływ 100% tlenu i sondę temperatury i rozpocznij podgrzewanie do 37 stopni Celsjusza. Otwórz oprogramowanie do tworzenia wykresów.
Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie. Wybierz interesujący Cię kanał z menu DMT, aby otworzyć okno normalizacji DMT dla odpowiedniego kanału. Wprowadź następujące wartości stałe w oknie:Punkty końcowe tkanki a1, 0.1; Punkty końcowe tkanek a2, 4; Średnica drutu, 40.
W oknie zostanie wyświetlona obliczona długość naczynia jako 1,40 milimetra. Odczytać mikrometr odpowiedniej komory tkankowej. Wprowadź wartość w polu odczytu mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt.
Wartość ta jest początkową wartością X. Po upływie 60 sekund w oknie wyświetlana jest siła i ciśnienie efektywne odpowiadające tej wartości mikrometru. W tym samym czasie uaktywnia się skrzynka odczytu mikrometru. Rozciągnąć normalizowane naczynie, obracając mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
Wprowadź wartość mikrometru w polu odczytu mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt. Ponownie poczekaj na opóźnienie wynoszące 60 sekund. Kontynuuj rozciąganie naczynia i dodawaj wartości mikrometrów, aż w oknie pojawi się wartość mikrometra X-jeden, która jest obliczonym ustawieniem mikrometru wymaganym do rozciągnięcia naczynia do jego IC-one.
Ustaw mikrometr na wartość X-one. Po normalizacji równoważyć naczynie w komorze przez 15 do 20 minut. Po zrównoważeniu rzuć wyzwanie naczyniu roztworem o wysokiej zawartości potasu, zastępując roztwór HT 5 mililitrami roztworu o wysokiej zawartości potasu, aby wywołać skurcz przez 10 minut.
Po powtórzeniu 10-minutowej inkubacji w świeżym roztworze o wysokiej zawartości potasu, przemyć pięcioma mililitrami roztworu HT trzy do czterech razy. Ponownie rzuć wyzwanie naczyniu pięcioma mililitrami roztworu o wysokiej zawartości potasu, aby wywołać skurcz. Po pięciu minutach dodać 0,5 mikrolitra roztworu podstawowego neolienzyny do komory, aby rozluźnić naczynie przy końcowym stężeniu jednej mikromolowej neolienzyny.
Gdy siła ustabilizuje się po kilku minutach, dodaj kolejne 0,5 mikrolitra roztworu podstawowego neoliensyny, aby zwiększyć stężenie do dwóch mikromolów. Za każdym razem dodawać jeden mikrolitr roztworu podstawowego, aby zwiększyć stężenie do czterech, sześciu, ośmiu i dziesięciu mikromolów, aby wygenerować krzywą dawka-odpowiedź. Podczas procedury normalizacji naczynie było kilkakrotnie rozciągane, aż do osiągnięcia wartości IC-100, a każdy rozciągnięty cykl obejmował silny skurcz, szybkie rozluźnienie i utrzymanie siły w ciągu 60 sekund.
Skurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych wywołany przez roztwór potasu o wysokiej zawartości potasu zwykle wykazywał dwie fazy, fazę mocną i fazę podtrzymywaną. Opisano metodę pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą wieloprzewodowego systemu miografu. Metoda ta może być stosowana do oceny funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz do badań przesiewowych środków zwiotczających mięśnie gładkie.
Główna różnica między tą metodą a innymi polega na krokach montażu. Ten zastosowany tutaj krok jest łatwy do wykonania i nie uszkadza tkanki ani urządzenia. Po tej procedurze można również zastosować inne stymulatory, takie jak EP i angiotensyna II, w celu stymulacji skurczu mięśni gładkich w celu znalezienia nowych leków, które są wrażliwe na tego agonistę.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Technika myografu drucianego jest stosowana do oceny kurczliwości mięśni gładkich naczyń i do przesiewania potencjalnych środków terapeutycznych. Ta metoda pozwala na badanie mechanizmów kurczenia się mięśni gładkich i ocenę nowych leków przeciw nadciśnieniu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Fizjologia naczyń
- Farmakologia
- Biologia mięśni gładkich
Tło
- Metoda myografu drucianego jest wykorzystywana od lat do pomiaru kurczliwości mięśni gładkich naczyń.
- Ta technika umożliwia badanie mechanizmów kurczenia się mięśni gładkich.
- Jest szczególnie przydatna do badania nowych leków przeznaczonych do leczenia nadciśnienia.
- Segment naczynia pozostaje żywotny przez kilka godzin po zamontowaniu, zachowując kurczliwość.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowego protokołu pomiaru izometycznej kurczliwości tętnic mezenterycznych myszy.
- Przesiewanie nowych środków rozkurczających mięśnie gładkie naczyń.
- Zgłębienie zrozumienia funkcji mięśni gładkich w kontekście rozwoju leków.
Stosowane metody
- Technika myografu drucianego do pomiaru kurczliwości.
- Ocena kurczliwości wywołana wysokim poziomem potasu.
- Wielokanałowy system do przesiewania leków.
- Przygotowanie segmentów tętnic mezenterycznych myszy.
Główne wyniki
- Myograf druciany umożliwia przedłużoną żywotność segmentów naczyniowych.
- Wysoki potas skutecznie indukuje kurczliwość mięśni gładkich.
- Wielokanałowy system ułatwia przesiewanie wielu leków jednocześnie.
- Można zidentyfikować nowe środki rozkurczające o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym.
Wnioski
- Myograf druciany jest cennym narzędziem do badania funkcji mięśni gładkich naczyń.
- Ta metoda wspiera identyfikację nowych środków terapeutycznych przeciw nadciśnieniu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole, aby dalsze badać farmakologię mięśni gładkich.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The wire myograph technique enables precise measurement of vascular smooth muscle contractility, supporting target validation and mechanistic de-risking in hypertension drug discovery. By providing quantitative, reproducible force measurements in disease-relevant mouse mesenteric arteries, the method enhances predictive confidence for screening novel relaxants and assessing therapeutic potential early in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring isometric contraction in response to GPCR agonists, inhibitors, and depolarizing agents.
- Operational Value: Enables functional validation of vascular targets through dose-response analysis of compounds like neoliensinine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (force tension) for assessing compound potency and efficacy.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility via normalization procedures and multi-channel capability for parallel compound testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant mouse mesenteric artery to model human vascular pathophysiology and assess translational biomarker alignment.
- Operational Value: Maintains vessel viability for ≥4 hours, enabling time-consuming screening campaigns and repeated contractility challenges.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing contractility data that informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating vascular smooth muscle responses to specific stimuli like high-K+ solution.
- Screening: Enables reliable compound evaluation through cumulative dosing and stable sustained phase measurements.
- Analytics: Delivers quantitative force readouts that allow comparison of drug effects across concentrations and conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by using genetically tractable mouse models of vascular disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing vascular function across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement and reduces mechanistic ambiguity in smooth muscle pharmacology.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via wire mounting and normalization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in hypertension programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent relaxant effects in vascular tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular dissection, wire myograph operation, and solution preparation.
- Dependent on myograph chambers, force transducers, micrometers, and temperature-controlled perfusion systems.
- Necessitates cross-team standardization of dissection, mounting, and normalization procedures for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different vessel sizes or species.
- Limited by the need for isolated tissue segments and the technical challenge of wire insertion without endothelial damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:55
Mouse Mesenteric Artery Dissection
2:26
Arterial Mounting
5:30
Normalization
7:03
Artery Contraction Recording
8:18
Results: Representative Tracings Showing the Normalization Procedure, Potentiation by High-K+ Solution, and Contraction
8:47
Conclusion
