Name: Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę wykrywania wirusów w bioaerozolach z wykorzystaniem żywicy anionowymiennej i impingerów ciekłych. Technika ta zwiększa czułość detekcji molekularnej i umożliwia badania w terenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z CDC/NIOSH High Plains Intermountain Center for Agricultural Health and Safety (5U54OH008085) oraz Colorado Bioscience Discovery Evaluation Grant Program (14BGF-16).

1. Konfiguracja komory bioaerozolowej (Zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Wstępnie załaduj płynne impingery 20 ml 0,01 M roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7,5 (PBS).
	<ol>
		<li>Dodać 0,5 g żywicy anionowymiennej i zawiesić w PBS jednego z uderzających cieczy, z innym płynnym impingerem służącym jako kontrola.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść uderzenia cieczy równolegle w komorze bioaerozolowej za pomocą stojaków zaciskowych z wlotami aerozolu skierowanymi w stronę nebulizatora. 
	UWAGA: Zobacz Rysunek 2, aby uzyskać dodatkowe szczegóły.</li>
	<li>Umieść monitor aerozolu z bezpośrednim odczytem w pobliżu uderzeń cieczy, aby zmierzyć stężenie masowe (mg/m3) bioaerozolu.</li>
	<li>W pobliżu uderzeń cieczy należy umieścić dodatkowe oprzyrządowanie do bezpośredniego odczytu (monitor jakości powietrza w pomieszczeniu i anemometr termiczny) w celu monitorowania zmiennych środowiskowych, takich jak temperatura, wilgotność względna i prędkość wiatru, w komorze bioaerozolowej.</li>
	<li>Uruchomić wentylatory osiowe w rogach komory bioaerozolu, aby ułatwić mieszanie aerozolu. 
	UWAGA: Wentylatory osiowe pracują ze stałą prędkością i nie można ich regulować.</li>
</ol>
2. Modelowe eksperymenty bioaerozolowe (zobacz Rysunek 3)
<ol>
	<li>Wykonać seryjne, 10-krotne rozcieńczenia bakteriofaga MS2 i szczepionki przeciw grypie do pożądanych stężeń w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). 
	UWAGA: Aby zademonstrować tę metodę, wykorzystuje się 103,5 FFU/ml szczepów szczepionki przeciwko wirusowi grypy typu A i B oraz 105 PFU/ml bakteriofaga MS2. Aby określić miana inokula, bakteriofagi rozmnaża się w Escherichia coli HS (pFamp)R i wylicza zgodnie z wcześniejszym opisem20. Komercyjna szczepionka zawiera znane ilości czterech żywych atenuowanych szczepów wirusa grypy, dwóch wirusów grypy typu A i dwóch wirusów grypy typu B, wyrażonych w fluorescencyjnych jednostkach ogniskowych lub FFU.</li>
	<li>Przygotuj inokulację w szklanym naczyniu 6-strumieniowego nebulizatora zderzeniowego, tworząc zawiesiny o pożądanych stężeniach cząstek wirusa w 100 ml PBS i zainstaluj w niestandardowej komorze bioaerozolowej.</li>
	<li>Uruchom oprzyrządowanie do pomiaru zmiennych w komorze bioaerozolu, takich jak temperatura, % wilgotności względnej, stężenie dwutlenku węgla i prędkość wiatru (generowane za pomocą wentylatora osiowego). Użyj monitora aerozolu z bezpośrednim odczytem, aby śledzić stężenie masy w komorze bioaerozolowej i ustalić spójność w ramach prób i między nimi.</li>
	<li>Uszczelnij komorę bioaerozolu i przewietrzaj przez 10 minut powietrzem przefiltrowanym przez HEPA.</li>
	<li>Dostarczyć przefiltrowane, osuszone powietrze do nebulizatora pracującego pod ciśnieniem 6,9 kPa.</li>
	<li>Wygeneruj docelowe stężenie bioaerozoli wirusowych (za pomocą nebulizatora) w każdym badaniu w komorze bioaerozolowej. Na potrzeby tej demonstracji wytwarzane są bioaerozole o stężeniu 5 mg/m3.</li>
	<li>Po osiągnięciu docelowego stężenia masowego aerozolu należy przerwać nebulizację.</li>
	<li>Uruchomić pompę do pobierania próbek powietrza dla każdego impingera cieczy, który został skalibrowany do natężenia przepływu 12,5 l/min. Kalibrację należy przeprowadzić przy użyciu wzorca przepływu pierwotnego przed i po każdym pobraniu próbki, aby zapewnić spójność objętości próbkowania. Powietrze rozcieńczające należy dostarczyć za pomocą przewodu z filtrem HEPA umieszczonego w pobliżu nebulizatora i utrzymywać stałe ciśnienie w komorze.</li>
	<li>Aktywnie pobieraj próbki atmosfery w komorze bioaerozolowej przez okres 40 minut, aby uzyskać objętość próbki 500 l na próbkę. 
	UWAGA: Pobieranie próbek przez 40 minut z prędkością 12,5 l/min za pomocą dwóch pomp pracujących równolegle pozwala na pobranie próbki 1 000 l bioaerozolu. W związku z tym, po zakończeniu eksperymentu, oczekuje się, że większość powietrza obecnego w komorze bioaerozolowej została pobrana i uwolniona do środowiska za pomocą systemu filtrowanego przez HEPA. Świadczy o tym spadek stężenia cząstek. Po eksperymencie powierzchnie są odkażane 10% wybielaczem domowym i 70% etanolem. W tej demonstracji wykorzystywane są wskaźniki; Jeżeli jednak w systemie tym wykorzystywane są znane organizmy chorobotwórcze, w razie potrzeby można zastosować dodatkowe środki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych i wykrywanie qRT-PCR
<ol>
	<li>Wyizolować kwasy nukleinowe bezpośrednio z żywicy anionowymiennej oraz, do celów porównawczych, z cieczy stosowanej w płynnych uderzeniach. W tym przykładzie opisano procedurę izolacji RNA, ale podobny protokół można zastosować w przypadku wirusów DNA.
	<ol>
		<li>Izolacja kwasu nukleinowego z żywicy anionowymiennej.
		<ol>
			<li>Przenieść całą ciecz zawierającą żywicę anionowymienną z płynnego impingera do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
			<li>Poczekaj, aż żywica opadnie i powoli zdekantuj ciekłą próbkę z żywicy anionowymiennej. Użyj końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć całą pozostałą ciecz z żywicy anionowymiennej.</li>
			<li>Z zestawu do izolacji wirusowego RNA dodać 560 μl buforu do lizy wirusa zawierającego nośnik RNA bezpośrednio do żywicy anionowymiennej i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z okresowym mieszaniem.</li>
			<li>Za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml przenieś lizat wirusa (bufor do lizy wirusa) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml i kontynuuj izolację RNA za pomocą zestawu do izolacji wirusowego RNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem elucji RNA w całkowitej objętości 60 μl buforu elucyjnego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Izolacja kwasów nukleinowych od ciekłych uderzeń.
		<ol>
			<li>Pobrać pipetę ze 140 μl płynnej próbki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 1,5 ml i przeprowadzić izolację RNA za pomocą zestawu do izolacji wirusowego RNA zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem elucji RNA w całkowitej objętości 60 μl buforu elucyjnego. 
			UWAGA: 140 μL to maksymalna objętość próbki, którą można przetworzyć za pomocą specyficznego zestawu do izolacji wirusowego RNA zastosowanego tutaj w jednoetapowym preparacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj qRT-PCR w celu wykrycia wirusów MS2 oraz grypy A i B, jak opisano wcześniej23,24. W tej demonstracji do qRT-PCR używa się 5 μl eluatów kwasów nukleinowych.</li>
</ol>

<ol><li>Pirtle, E. C., Beran, G. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1782426">Virus survival in the environment.</a> Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).</li>
<li>Nguyen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+community-wide+outbreak+of+legionnaires+disease+linked+to+industrial+cooling+towers--how+far+can+contaminated+aerosols+spread%3F%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread?</a> The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).</li>
<li>Marks, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+airborne+transmission+of+Norwalk-like+virus+%28NLV%29+in+a+hotel+restaurant%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant.</a> Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).</li>
<li>Marks, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+school+outbreak+of+Norwalk-like+virus%3A+Evidence+for+airborne+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission.</a> Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).</li>
<li>Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+detection+and+quantification+of+swine+influenza+a+virus+in+air+samples+collected+inside%2C+outside+and+downwind+from+swine+barns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns.</a> PLoS One. 8 (8), e71444(2013).</li>
<li>Anderson, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioaerosol+sampling+in+modern+agriculture%3A+A+novel+approach+for+emerging+pathogen+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).</li>
<li>Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+air+sampling+to+detect+exotic+Newcastle+disease+virus+in+two+California+commercial+poultry+flocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).</li>
<li>Jonges, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wind-mediated+spread+of+low-pathogenic+avian+influenza+virus+into+the+environment+during+outbreaks+at+commercial+poultry+farms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms.</a> PLoS One. 10 (5), e0125401(2015).</li>
<li>Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+aerosol+transmission+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+under+controlled+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Record%22%5BJournal%5D)">Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions.</a> The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolized+avian+influenza+A+%28H5N6%29+virus+isolated+from+a+live+poultry+market%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China.</a> The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).</li>
<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+animal+markets+in+Minnesota%3A+A+potential+source+for+emergence+of+novel+influenza+A+viruses+and+interspecies+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission.</a> Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).</li>
<li>Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioaerosol+sampling%3A+Sampling+mechanisms%2C+bioefficiency+and+field+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hospical+Infection%22%5BJournal%5D)">Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies.</a> The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).</li>
<li>Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bioaerosol+aampling+for+airborne+virus+surveillance+in+swine+production+facilities%3A+A+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, 121(2017).</li>
<li>Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+sampling+of+airborne+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Methods for sampling of airborne viruses.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).</li>
<li>Hogan, C. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+methodologies+and+dosage+assessment+techniques+for+submicrometre+and+ultrafine+virus+aerosol+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles.</a> Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).</li>
<li>Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021850216300143">Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration.</a> Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).</li>
<li>Perez-Mendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+simple+and+cost+effective+filter+paper-based+shipping+and+storage+medium+for+environmental+sampling+of+F-RNA+coliphages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).</li>
<li>Chandler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-based+evaluation+of+a+male-specific+%28F%2B%29+RNA+coliphage+concentration+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method.</a> Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).</li>
<li>Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteric+viruses+from+tap+water+using+an+anion+exchange+resin-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method.</a> Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).</li>
<li>Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+anion+exchange+resin-based+method+for+concentration+of+F-RNA+coliphages+%28enteric+virus+indicators%29+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples.</a> Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).</li>
<li>Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+ion+exchange%3A+Basic+principles+and+their+application+in+food+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).</li>
<li>Chandler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+improved+detection+of+aerosolized+influenza+viruses+and+the+male-specific+%28F%2B%29+RNA+coliphage+MS2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2.</a> Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).</li>
<li>Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assessment+of+a+real+time+reverse+transcription-PCR+method+to+genotype+single-stranded+RNA+male-specific+coliphages+%28Family+Leviviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae).</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).</li>
<li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+influenza+A+and+B+real-time+reverse+transcription-PCR+assays+and+a+new+2009+H1N1+assay+for+detection+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).</li>
<li>Cademartiri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+bacteriophages+on+modified+silica+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Immobilization of bacteriophages on modified silica particles.</a> Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).</li>
<li>Michen, B., Graule, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+points+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Appled+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Isoelectric points of viruses.</a> Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).</li>
<li>Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+bacteriophages+as+models+for+viral+aerosol+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).</li>
<li>Vergara, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FRNA+coliphages+as+indicators+of+human+enteric+viruses+in+a+tropical+urban+freshwater+catchment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment.</a> Water Research. 79, 39-47 (2015).</li>
<li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolization+of+a+human+norovirus+surrogate%2C+bacteriophage+MS2%2C+during+simulated+vomiting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting.</a> PLoS One. 10 (8), e0134277(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia metodę czułego wychwytywania wirusa z bioaerozoli przy użyciu zmodyfikowanych płynnych uderzeń. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem wykrywania i oznaczania ilościowego miana wirusa w bioaerozolach. Przedstawiona tutaj specyficzna modyfikacja polega na dodaniu żywicy anionowymiennej do cieczy zawartej w zwykłym impingerze cieczowym. Metoda ta została opracowana ze względu na jej prostotę w dalszym przetwarzaniu próbek, podczas gdy inne techniki przetwarzania próbek, takie jak wirowanie, filtracj...

Celem tej metody jest dostarczenie bardzo czułej platformy do pobierania próbek bioaerozoli, która ułatwi molekularne wykrywanie ujemnie naładowanych wirusów z bioaerozoli. Mikroorganizmy, w tym cząsteczki wirusów, mogą przetrwać w bioaerozolach przez dłuższy czas1. Bioaerozole mogą przemieszczać się na stosunkowo duże odległości i utrzymywać żywotność i zakaźność, o czym świadczy wybuch choroby legionistów, który wywodzi się z przemysłowych chłodni kominowych znajdujących się w odległości 6 km od dotkniętych osób i spowodował 18 ofiar śmiertelnych2. Pośrednia transmisja wirusów na ludzi za pośrednictwem bioaerozoli może wystąpić w wielu sytuacjach i wykazano w przypadku epidemii norowirusów w szkołach i restauracjach3,4. Podobnie, przenoszenie wirusów przez bioaerozol może wystąpić w warunkach rolniczych, takich jak fermy trzody chlewnej i drobiu, przy czym ta droga transmisji jest uważana za główny czynnik przemieszczania się wirusów między zakładami produkcyjnymi5,6,7,8,9.
Skuteczne pobieranie próbek bioaerozoli zawierających wirusy pozwala na poprawę szybkiej diagnostyki i przygotowania do zapobiegania wybuchom epidemii, jak pokazano w demonstracjach, w których wirusy grypy H5 A zostały wykryte z bioaerozoli na targach żywych zwierząt w Chinach i Stanach Zjednoczonych10,11. Obecne technologie pobierania próbek bioaerozoli obejmują wiele różnych zasad wychwytywania cząstek i można je ogólnie podzielić na uderzenia, cyklony, impaktory i filtry12. Wyczerpujące omówienie wszystkich zalet i wad tych platform do pobierania próbek wirusów z bioaerozoli wykracza poza zakres niniejszego protokołu; Można jednak stwierdzić, że większość tych urządzeń do pobierania próbek nie została zoptymalizowana pod kątem zbierania wirusów i bakteriofagów13. Co więcej, zakaźność cząstek wirusa jest często negatywnie naruszona, przy czym uważa się, że płynne uderzenia utrzymują zakaźność wirusa skuteczniej niż urządzenia do pobierania próbek, takie jak stałe impaktory lub filtry14. Jednak jedną z wad uderzenia cieczy jest efekt docelowego rozcieńczenia, który występuje, ponieważ wirusy są gromadzone w stosunkowo dużych objętościach (zwykle ≥20 ml) cieczy w naczyniu zbiorczym. Inną ważną wadą jest nieoptymalna wydajność cieczy w koncentracji cząstek o rozmiarze <0,5 μM15. Jednak skuteczność wychwytywania tych urządzeń można poprawić poprzez unieruchomienie na matrycach stałych, ponieważ immobilizacja może poprawić zachowanie wirusowych kwasów nukleinowych i zakaźność wirusa16,17.
Wcześniej wykazaliśmy, że żywica anionowymienna jest skutecznym narzędziem do wychwytywania i koncentracji wirusów z płynnych matryc, w tym bakteriofagów F-RNA, wirusa zapalenia wątroby typu A, ludzkiego adenowirusa i rotawirusa18,19,20. Zgodnie z definicją producenta, żywica anionowymienna wykorzystana w tej pracy jest makrosiatkowatą żywicą anionowymienną o silnej zasadzie polistyrenowej, w której funkcjonalizowane czwartorzędowe grupy aminowe pośredniczą w przyciąganiu i wychwytywaniu anionów w ciekłym ośrodku21. W związku z tym oczekuje się, że żywica anionowymienna wychwytuje wirusy o ujemnych ładunkach powierzchniowych, w tym wiele wirusów jelitowych, wirusów grypy i innych wirusów istotnych dla zdrowia publicznego i zwierząt.
Obecny protokół polega na dodaniu żywicy anionowymiennej do płynnego impingera. W tym systemie żywica służy jako wtórny etap zagęszczania cząstek wirusa wychwyconych w cieczy impingerowej. Kwasy nukleinowe mogą być następnie bezpośrednio eluowane w małych objętościach, zapewniając skoncentrowaną próbkę do analiz molekularnych. Tak więc główną zaletą tej metody jest poprawa czułości wykrywania wirusów, przede wszystkim poprzez zmniejszenie objętości próbki. Dodatkowo, ze względu na nieodłączne niespecyficzne wychwytywanie ujemnie naładowanych wirusów, metoda ta jest prawdopodobnie stosowana do wykrywania dużej liczby wirusów będących przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu metoda została zademonstrowana dla szczepów szczepionkowych wirusów grypy typu A i typu B oraz grupy coli FRNA MS2 (MS2). Wirusy te są następnie wykrywane za pomocą standardowych testów qRT-PCR, jak opisano wcześniej22. Użytkownik punktu końcowego nie powinien spodziewać się trudności w wykonywaniu tej metody, ponieważ modyfikacje obecnie istniejącego sprzętu nie stanowią poważnych zakłóceń w konwencjonalnym przepływie pobierania próbek i analizy bioaerozoli.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli bakteriofag MS2 (ATCC 15597-B1)</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>ATCC 15597-B1</td><td></td></tr><tr><td>FluMist Czterowalentny</td><td>AstraZeneca</td><td>Skontaktuj się z producentem</td><td>Składniki wirusowe tej szczepionki mogą ulegać corocznym zmianom</td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>Startery i sondy</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mikro; M sterylny filtr</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1 L butelki z pyreksu lub równoważne</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1 ml końcówki do pipet</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipeta</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>50 ml pipeta serologiczna</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA PCR probówki</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td></td></tr><tr><td>Pomoca do pipetowania lub równoważne</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>Sonda QuantiTect Zestaw RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>204443</td><td></td></tr><tr><td>Postać chlorku Amberlite IRA-900</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216585-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Woda (klasa biologii molekularnej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf DNA LoBind</td><td>ThermoFisher</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki</td> wirówkowe Falcon <td>ThermoFisher</td><td>05-538-62</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Platynowy jednoetapowy zestaw qRT-PCR z ROX</td><td>ThermoFisher</td><td>11745100</td><td></td></tr><tr><td>SKC Biosampler 20 mL, 3-częściowy zestaw szklanek</td><td>SKC Inc.</td><td>225-9593</td><td></td></tr><tr><td>Pompy do pobierania próbek Vac-u-Go</td><td>SKC Inc.</td><td>228-9695</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizator Collison (6-dyszowy)</td><td>BGI Inc.</td><td>Kapsuła NA</td><td></td></tr><tr><td>HEPA</td><td>PALL</td><td>12144</td><td></td></tr><tr><td>Q-TRAK monitor jakości powietrza w pomieszczeniach 8554</td><td>TSI Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Wiatromierz termiczny Alnor AVM440-A TSI</td><td>Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SidePak AM510 osobisty monitor aerozoli</td><td>TSI Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Komora bioaerozolowa</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Ten protokół demonstruje dostosowaną metodę pobierania próbek bioaerozolu dla wirusów. W tym systemie żywica anionowymienna jest sprzężona z urządzeniami do pobierania próbek powietrza na bazie cieczy w celu skutecznego zagęszczenia ujemnie naładowanych wirusów z bioaerozoli. W ten sposób żywica służy jako dodatkowy etap zatężania w procesie pobierania próbek bioaerozolu. Ekstrakcja kwasów nukleinowych cząstek wirusa jest następnie przeprowadzana bezpośrednio z żywicy anionowymiennej, a otrzymana próbka nadaje się do analiz molekularnych. Ponadto protokół ten opisuje specjalnie zbudowaną komorę bioaerozolową zdolną do generowania bioaerozoli zawierających wirusy w różnych warunkach środowiskowych i pozwalającą na ciągłe monitorowanie zmiennych środowiskowych, takich jak temperatura, wilgotność, prędkość wiatru i stężenie masy aerozolu. Główną zaletą stosowania tego protokołu jest zwiększona czułość wykrywania wirusa, oceniana poprzez bezpośrednie porównanie z niemodyfikowanym konwencjonalnym impingerem cieczowym. Inne zalety to możliwość koncentracji różnych ujemnie naładowanych wirusów, niski koszt żywicy anionowymiennej (~0,14 USD za próbkę) oraz łatwość użycia. Wady obejmują niezdolność tego protokołu do oceny zakaźności cząstek wirusa zaadsorbowanych przez żywicę oraz potencjalną potrzebę optymalizacji buforu do pobierania próbek cieczy stosowanego w impingerze.

Rysunek 1 przedstawia zasadę przechwytywania wirusów z bioaerozoli na podstawie ładunku poprzez zastosowanie żywicy w impingerach cieczowych. Rysunek 2 pokazuje konfigurację specjalnie zbudowanej komory do bioaerozoli. Rysunek 3 opisuje kroki involved w przygotowaniu eksperymentu aerozolizacji oraz środki zapewniające kontrolę jakości. Rysunek 4 przedstawia krzywe amplif...

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rodzaju, poziomu i dystrybucji wirusów w bioaerozolach, które są ważne dla zdrowia publicznego i weterynaryjnego. Głównymi zaletami tej metody jest poprawa czułości wykrywania molekularnego wirusów z bioaerozoli, jej przydatność w terenie i łatwość użycia. Stwórz zawiesiny eksperymentalnych stężeń cząstek wirusa będących przedmiotem zainteresowania w 100-mililitrowych objętościach PBS w szklanych naczyniach sześciostrumieniowego nebulizatora zderzeniowego.Aby ustawić komorę bioaerozolową, należy wstępnie załadować dwa płynne impingery 20 mililitrami 0,01 molowego PBS, a następnie dodać 0,5 grama żywicy anionowymiennej do pojedynczego impingera. Zamontuj impinger. Zamontuj zawiesiny w komorze.Użyj stojaków zaciskowych, aby ustawić uderzenia cieczy równolegle wewnątrz komory bioaerozolowej z wlotami próbnika aerozolu skierowanymi w stronę nebulizatora. Umieść przyrząd do bezpośredniego odczytu w pobliżu uderzeń cieczy, aby monitorować zmienne środowiskowe i umieść dodatkowy monitor aerozolu z bezpośrednim odczytem w pobliżu uderzeń cieczy, aby zmierzyć stężenie masowe bioaerozolu. Następnie uruchom wentylatory osiowe w rogach komory bioaerozolu, aby ułatwić mieszanie aerozolu.Gdy komora jest gotowa, uruchom przyrządy do pomiaru zmiennych w komorze bioaerozolowej. Użyj wzorca przepływu pierwotnego, aby skalibrować system w celu utrzymania spójności między objętościami próbek. Uszczelnij komorę na 10-minutowe przedmuchiwanie powietrzem przefiltrowanym przez HEPA.Dostarczyć przefiltrowane, osuszone powietrze do nebulizatora pod ciśnieniem 6,9 kilopaskali w celu wytworzenia docelowego stężenia bioaerozoli wirusowych. Po osiągnięciu docelowego stężenia masowego aerozolu należy przerwać nebulizację. Następnie należy użyć przewodu z filtrem HEPA znajdującego się w pobliżu nebulizatora, aby dostarczyć rozcieńczone powietrze, zwracając uwagę na utrzymanie stałego ciśnienia w komorze i aktywnie pobierać próbki atmosfery w komorze bioaerozolu przez 40 minut, aby uzyskać objętość próbki 500 litrów na próbkę.Kalibracja przyrządu ma kluczowe znaczenie dla określenia stężenia zanieczyszczeń powietrza. Ciąg pobierania próbek powinien być kalibrowany przed i po każdym zdarzeniu pobierania próbek. Kalibracje wstępne i końcowe powinny różnić się od siebie w granicach 5%.Wyłączyć pompy po zakończeniu pobierania próbek. Aby wyizolować kwasy nukleinowe bezpośrednio z żywicy anionowymiennej, przenieś całą ciecz zawierającą żywicę anionowymienną z płynnych uderzeń do indywidualnych, sterylnych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Po pozostawieniu żywicy do opadnięcia, powoli zdekantuj próbkę cieczy z żywicy anionowymiennej, używając jednomililitrowej końcówki pipety, aby usunąć pozostałą ciecz z żywicy.Następnie dodaj 560 mikrolitrów buforu do lizy wirusa zawierającego nośnik RNA z zestawu do izolacji wirusowego RNA bezpośrednio do żywicy anionowymiennej, na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej z okresowym mieszaniem. Pod koniec inkubacji za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety przenieś lizat wirusa do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i kontynuuj izolację RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym w celu wykrycia bakterii MS2 oraz wirusów grypy A i B przy użyciu pięciu mikrolitrów eluentu kwasu nukleinowego na próbkę.Jak pokazano w tych reprezentatywnych krzywych amplifikacji qRT-PCR, wykrywanie wirusów grypy typu A można osiągnąć do 3,26 cyklu szybciej, gdy stosuje się żywicę anionowymienną, w porównaniu z bezpośrednim testowaniem cieczy uderzeniowej. W qRT-PCR, który jest w 100% skuteczny, wzmocnienie jednego cyklu progowego odpowiada dwukrotnemu wzrostowi stężenia docelowego, stąd reprezentatywne wyniki wskazują na 9,58-krotną poprawę czułości wykrywania. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że gdy pobieranie próbek powietrza odbywa się w terenie, parametry takie jak wilgotność względna i temperatura mogą wpływać na wydajność zbierania i że zbiorcze mogą wymagać optymalizacji pod kątem różnych wirusów. Po tej procedurze można zastosować inne metody oparte na hodowlach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zakaźności wirusa. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom i innym specjalistom w dziedzinie rolnictwa i zdrowia publicznego do zbadania alternatywnych metod wychwytywania i zagęszczania wirusa z bioaerozoli w celu oceny ryzyka w nadzorze nad chorobami wirusowymi.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wychwytywać i koncentrować wirusy z bioaerozoli za pomocą zmodyfikowanych płynnych uderzeń, ekstrahować kwasy nukleinowe bezpośrednio z żywicy anionowymiennej i wykrywać wirusy za pomocą qRT-PCR. Nie zapominaj, że praca z patogenami wirusowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej i poziom bezpieczeństwa biologicznego drugi lub wyższy.

detection-of-viruses-from-bioaerosols-using-anion-exchange-resin

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Anion Exchange Resin–Based Detection of Viruses from Bioaerosols

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Extraction of Viral RNA from Surface-Bound Virions Using a Silica Spin Column

Opisujemy szybki, molekularny test na grypę A i B. Test grypy wykrywa każdy cel w ciągu 15 minut, stosując amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. Test na grypę A i B jest przyjazny dla użytkownika i wymaga minimalnego czasu na wykonanie.

Szybkie wykrywanie molekularne i różnicowanie wirusów grypy A i B

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Szybko wdrażalne, niezależne od sieci laboratorium zostało zaprojektowane i zbudowane dla odległych, ograniczonych zasobami globalnych ustawień. Badane są cechy i krytyczne aspekty ulepszonych logistycznie, rozszerzalnych, wielofunkcyjnych modułów laboratoryjnych. Opracowywana i prezentowana jest lista kontrolna dotycząca podstawowego przebiegu pracy w laboratorium oraz protokół testu diagnostycznego na obecność wirusa układu oddechowego.

Zdalne zarządzanie laboratorium: diagnostyka wirusów układu oddechowego

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Przedstawiamy tutaj badanie mające na celu ocenę skuteczności przeciwwirusowej powłok powierzchniowych na filtrach powietrza na bazie miedzi i srebra. Korzystając z komory bioaerozolowej i bakteriofaga Phi6, ta metoda mierzy nieaktywację wirusów i efektywność mechanicznej filtracji dla samoczyszczących technologii czyszczenia powietrza wewnętrznego.

Ocena wpływu pokrytych filtrów i filtrów wstępnych na zakaźność i stężenie aerozolu zawierającego wirusa Phi6

Poznaj metodę wykrywania wirusów w bioaerozolach z wykorzystaniem żywicy anionowymiennej i impingerów ciekłych. Technika ta zwiększa czułość detekcji molekularnej i umożliwia badania w terenie.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Przeglądaj więcej filmów