Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych
September 27th, 2018
Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.
Kardiomiocyty generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (IPS) są coraz częściej wykorzystywane do udzielania odpowiedzi na różne pytania biologiczne w dziedzinie elektrofizjologii serca. Głównymi zaletami tej technologii jest to, że pozwala ona na radykalne zwiększenie przepustowości, a także zapisy potencjału czynnościowego specyficznego dla podtypu w miocytach komorowych, takich jak miocyty, przy użyciu specyficznego dla komory elementu promotorowego. Wprowadzenie genetycznie kodowanych czujników napięcia poprzez transdukcję lentiwirusową umożliwia optyczne obrazowanie potencjałów czynnościowych kardiomiocytów pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Rozpocznij od zmieszania supernatantu z hodowli komórkowej zawierającego lentiwirusa z pożywką podtrzymującą kardiomiocyty, w stosunku jeden do jednego. Dodać bromek heksadimidyniny w końcowym stężeniu 8 mikrogramów na mililitr, aby zwiększyć skuteczność infekcji. I zastąp pożywkę podtrzymującą kardiomiocyty w naczyniu hodowlanym kardiomiocytów pochodzących z komórek IPS pożywką infekcyjną.
Hoduj zakażone kardiomiocyty przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zastąp pożywkę infekcyjną świeżą pożywką podtrzymującą kardiomiocyty. Przed obrazowaniem należy wymienić pożywkę do hodowli komórkowych na roztwór Tyrode'a, uzupełniony wapniem. Następnie umieść kardiomiocyty w komorze obrazowania na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w rozdzielacz obrazu.
Jeśli wymagana jest stymulacja elektryczna, zainstaluj elektrody stymulujące w komorze obrazowania i podłącz elektrody do generatora bodźców. Ustaw ostrość komórek i zlokalizuj komórkę wyrażającą genetycznie zakodowany wskaźnik napięcia w środku pola widzenia. Ustaw tor optyczny tak, aby emitowane światło było kierowane do rozdzielacza obrazu i przełącz kostkę filtra w mikroskopie na tę, która ma być połączona z filtrami w rozdzielaczu obrazu.
W oprogramowaniu sterującym kamerą ustaw akwizycję tak, aby możliwe było szybkie obrazowanie, a także ustaw rozdzielacz obrazu zgodnie z instrukcjami producenta. Dwa obrazy reprezentujące dwa różne pasma długości fal emisyjnych powinny przylegać do siebie, a każdy z nich powinien zajmować połowę obrazu. W razie potrzeby sprawdź i wyreguluj ostrość obrazu wytwarzanego przez aparat.
I dostosuj jasność światła oświetleniowego, aby uniknąć nasycenia pikseli. Ustaw akwizycję szeregów czasowych i przyciemnij światło w pomieszczeniu, aby światło rozproszone nie wpływało na pomiar. Następnie otwórz migawkę światła wzbudzającego i rozpocznij akwizycję serii obrazów, rozpoczynając stymulację elektryczną w odpowiednim punkcie czasowym, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami.
Po zakończeniu akwizycji zamknij w razie potrzeby migawkę światła wzbudzenia i zapisz nagranie na dysku twardym. Następnie, pozostawiając ustawienie nagrywania bez zmian, nagraj tło na obszarze szkiełka nakrywkowego bez komórek. W celu analizy zapisów potencjału błony optycznej otwórz stos tiff zawierający komórki w ImageJ i użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby narysować obszar zainteresowania nad fluorescencyjnym kardiomiocytem w kanale czerwonym, uważając, że obszar jest wystarczająco duży, aby komórka nie wysunęła się z regionu podczas kurczenia się.
Następnie wybierz pozycję Analizuj, Narzędzia, Menedżer obszaru zainteresowań i wybierz pozycję Dodaj T, aby dodać region jako Region zainteresowania 1. Przeciągnij obszar zainteresowania na tę samą komórkę w zielonym kanale i dodaj ten obszar jako Obszar zainteresowania 2. W menu Analizuj i Ustaw pomiary usuń zaznaczenie wszystkich opcji z wyjątkiem średniej wartości szarości.
W Menedżerze obszarów zainteresowania kliknij pozycję Więcej i Wiele miar, aby zaznaczyć opcje Zmierz wszystkie wycinki i Jeden wiersz na plasterek, a następnie kliknij przycisk OK. Otworzy się okno zawierające arkusz kalkulacyjny z trzema wierszami. Użyj opcji Plik i Zapisz jako, aby zapisać arkusz kalkulacyjny w pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami. Zamknij okno ze stosem obrazów i oknem arkusza kalkulacyjnego bez zamykania okna Menedżera obszarów zainteresowania, a następnie otwórz stos tiff zawierający pomiar tła.
W Menedżerze obszarów zainteresowania kliknij Więcej i Wiele miar, aby zaznaczyć opcje Zmierz wszystkie wycinki i Jeden wiersz na plasterek, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie zapisz dane w tle w osobnym pliku csv. Tutaj przedstawiono reprezentatywny kardiomiocyt pochodzący z pojedynczych komórek IPS za pomocą białych przerywanych linii oznaczających obszary zainteresowania, narysowanych podczas analizy obrazowej w kanałach RFP i GFP. Sygnał z kanału RFP wykazuje okresowy wzrost intensywności fluorescencji podczas każdego potencjału czynnościowego spowodowany rosnącym wymuszonym lub rezonansowym transferem energii spowodowanym zmianami potencjału błony.
Zgodnie z tym, sygnał GFP wykazuje okresowy spadek intensywności fluorescencji. Stosunek RFP/GFP jest sygnałem biologicznym wykorzystywanym w dalszych analizach, takich jak czas trwania potencjału czynnościowego 50 i 90 pomiarów. Na przykład, stosując tę metodę, 30-dniowe kardiomiocyty komorowe, takie jak kardiomiocyty pochodzące z komórek IPS, umieszczone na częstotliwości 0,5 Hz, wykazały średni czas trwania potencjału czynnościowego 50 wynoszący 439 milisekund i średni czas trwania potencjału czynnościowego 90 wynoszący 520 milisekund.
Elektryczna stymulacja kardiomiocytów pochodzących z komórek IPS przy rosnącym tempie stymulacji co pięć uderzeń wykazała postępujące skracanie potencjałów czynnościowych wraz ze wzrostem szybkości dudnienia. Co więcej, leczenie spontanicznie bijących kardiomiocytów pochodzących z komórek IPS izoproternolem, nieselektywnym agonistą receptora beta adreno, doprowadziło do szybkiego wzrostu szybkości dudnienia, która mogła być dalej zwiększona wraz ze wzrostem dawek agonisty. Chociaż metoda ta zapewnia lepszą przepustowość w porównaniu z klasycznymi pomiarami elektrofizjologicznymi, należy zdawać sobie sprawę z jej ograniczeń, w tym rozdzielczości czasowej, która jest ograniczona przez wewnętrzne właściwości kinetyczne fluorescencyjnego czujnika napięcia.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę obrazowania optycznego potencjałów czynnościowych w pochodzących z komórek macierzystych pluripotentnych komórkach mięśnia sercowego typu komórek komorowych. Technika wykorzystuje białko fluorescencyjne wrażliwe na napięcie, ekspresowane za pomocą podejścia opartego na promotorze.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia serca
- Biologia komórek macierzystych
- Techniki obrazowania optycznego
Tło
- Komórki pluripotentne indukowane (IPS) są używane do generowania komórek mięśnia sercowego.
- Ta technologia zwiększa wydajność rejestracji potencjałów czynnościowych.
- Elementy promotorów specyficznych dla komórek komorowych umożliwiają badania specyficzne dla podtypu.
- Genetycznie kodowane czujniki napięcia ułatwiają obrazowanie optyczne potencjałów czynnościowych.
Cel badania
- Rozwój metody obrazowania potencjałów czynnościowych w komórkach mięśnia sercowego.
- Poprawa rozumienia elektrofizjologii serca.
- Wykorzystanie komórek mięśnia sercowego pochodzących z IPS do zastosowań badawczych.
Stosowane metody
- Transdukcja lentiwirusowa wprowadzająca genetycznie zakodowane czujniki napięcia.
- Mieszanie lentiwirusu z medium do utrzymania komórek mięśnia sercowego.
- Użycie bromku heksadymetyryny do zwiększenia wydajności infekcji.
- Zastępowanie medium kulturalnego medium infekcyjnym dla komórek mięśnia sercowego pochodzących z IPS.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie optyczne potencjałów czynnościowych w komórkach mięśnia sercowego.
- Wykazane zwiększenie wydajności badań elektrofizjologicznych.
- Umożliwienie rejestracji specyficznych dla podtypu za pomocą ekspresji opartej na promotorze.
- Walidacji stosowania genetycznie zakodowanych czujników w obrazowaniu na żywych komórkach.
Wnioski
- Metoda dostarcza potężnego narzędzia do badania elektrofizjologii serca.
- Zwiększa rozumienie potencjałów czynnościowych w ludzkich komórkach mięśnia sercowego.
- To podejście może być zastosowane do różnych pytań biologicznych w badaniach nad sercem.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Subtype-specific optical action potential recording in human iPSC-derived ventricular cardiomyocytes addresses a key challenge in cardiac safety pharmacology: phenotypic heterogeneity obscuring target engagement signals. By enabling ventricular-selective measurements, this method improves predictive confidence in early-stage electrophysiology screening and supports mechanistic de-risking of ion channel modulators. It positions ventricular-like iPSC-CMs as a disease-relevant system for lead identification and preclinical model validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in ventricular-like cardiomyocytes by isolating action potential signals from atrial/nodal contaminants.
- Operational Value: Supports biological de-risking of ion channel targets through promoter-driven, subtype-specific voltage sensor expression.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking optical readouts to ventricular-specific electrophysiological phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces ventricular-specific optical membrane potential recordings compatible with time-lapse fluorescence microscopy for compound screening.
- Quantitative Output: Enables action potential duration 50 and 90 measurements from RFP/GFP ratio changes, providing scalable electrophysiological endpoints.
- Reproducibility: Lentiviral transduction with ventricular promoter ensures consistent sensor expression across batches, supporting assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Ventricular-like iPSC-CMs model human ventricular electrophysiology, enabling translational biomarker alignment for arrhythmia risk assessment.
- Preclinical Continuity: Optical action potential recordings bridge discovery-phase target validation with preclinical safety evaluation of cardiac liabilities.
- Risk-Adjusted Advancement: Rate-dependent action potential shortening and isoproterenol response data support go/no-go decisions based on physiological relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical cardiotoxicity assessment, providing ventricular-specific electrophysiological readouts that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating ventricular action potentials from mixed iPSC-CM populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible optical signals with quantitative duration metrics for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates RFP/GFP ratio-based time series enabling action potential duration and rate-response analysis for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects ventricular-specific optical recordings to preclinical continuity through human-relevant electrophysiological phenotypes.
- Enterprise Reuse: Lentiviral ventricular promoter construct establishes a reusable platform for subtype-specific cardiac electrophysiology screening across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity from phenotypic heterogeneity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of ventricular-specific optical recordings.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiac programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on ventricular-selective electrophysiological profiles.
Implementation Considerations
- Required expertise in lentiviral transduction, fluorescence microscopy, and iPSC-CM culture.
- Instrumentation needs include inverted epifluorescence microscope with image splitter and high-speed camera capability.
- Cross-team standardization requires consistent promoter-driven sensor expression and infection efficiency protocols.
- Adaptation considerations include promoter specificity validation across iPSC lines and differentiation batches.
- Practical limitations include temporal resolution constrained by fluorescent voltage sensor kinetics, as noted in source.
