Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych
27 września 2018
Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.
Kardiomiocyty generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (IPS) są coraz częściej wykorzystywane do udzielania odpowiedzi na różne pytania biologiczne w dziedzinie elektrofizjologii serca. Głównymi zaletami tej technologii jest to, że pozwala ona na radykalne zwiększenie przepustowości, a także zapisy potencjału czynnościowego specyficznego dla podtypu w miocytach komorowych, takich jak miocyty, przy użyciu specyficznego dla komory elementu promotorowego. Wprowadzenie genetycznie kodowanych czujników napięcia poprzez transdukcję lentiwirusową umożliwia optyczne obrazowanie potencjałów czynnościowych kardiomiocytów pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Rozpocznij od zmieszania supernatantu z hodowli komórkowej zawierającego lentiwirusa z pożywką podtrzymującą kardiomiocyty, w stosunku jeden do jednego. Dodać bromek heksadimidyniny w końcowym stężeniu 8 mikrogramów na mililitr, aby zwiększyć skuteczność infekcji. I zastąp pożywkę podtrzymującą kardiomiocyty w naczyniu hodowlanym kardiomiocytów pochodzących z komórek IPS pożywką infekcyjną.
Hoduj zakażone kardiomiocyty przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zastąp pożywkę infekcyjną świeżą pożywką podtrzymującą kardiomiocyty. Przed obrazowaniem należy wymienić pożywkę do hodowli komórkowych na roztwór Tyrode'a, uzupełniony wapniem. Następnie umieść kardiomiocyty w komorze obrazowania na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w rozdzielacz obrazu.
Jeśli wymagana jest stymulacja elektryczna, zainstaluj elektrody stymulujące w komorze obrazowania i podłącz elektrody do generatora bodźców. Ustaw ostrość komórek i zlokalizuj komórkę wyrażającą genetycznie zakodowany wskaźnik napięcia w środku pola widzenia. Ustaw tor optyczny tak, aby emitowane światło było kierowane do rozdzielacza obrazu i przełącz kostkę filtra w mikroskopie na tę, która ma być połączona z filtrami w rozdzielaczu obrazu.
W oprogramowaniu sterującym kamerą ustaw akwizycję tak, aby możliwe było szybkie obrazowanie, a także ustaw rozdzielacz obrazu zgodnie z instrukcjami producenta. Dwa obrazy reprezentujące dwa różne pasma długości fal emisyjnych powinny przylegać do siebie, a każdy z nich powinien zajmować połowę obrazu. W razie potrzeby sprawdź i wyreguluj ostrość obrazu wytwarzanego przez aparat.
I dostosuj jasność światła oświetleniowego, aby uniknąć nasycenia pikseli. Ustaw akwizycję szeregów czasowych i przyciemnij światło w pomieszczeniu, aby światło rozproszone nie wpływało na pomiar. Następnie otwórz migawkę światła wzbudzającego i rozpocznij akwizycję serii obrazów, rozpoczynając stymulację elektryczną w odpowiednim punkcie czasowym, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami.
Po zakończeniu akwizycji zamknij w razie potrzeby migawkę światła wzbudzenia i zapisz nagranie na dysku twardym. Następnie, pozostawiając ustawienie nagrywania bez zmian, nagraj tło na obszarze szkiełka nakrywkowego bez komórek. W celu analizy zapisów potencjału błony optycznej otwórz stos tiff zawierający komórki w ImageJ i użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby narysować obszar zainteresowania nad fluorescencyjnym kardiomiocytem w kanale czerwonym, uważając, że obszar jest wystarczająco duży, aby komórka nie wysunęła się z regionu podczas kurczenia się.
Następnie wybierz pozycję Analizuj, Narzędzia, Menedżer obszaru zainteresowań i wybierz pozycję Dodaj T, aby dodać region jako Region zainteresowania 1. Przeciągnij obszar zainteresowania na tę samą komórkę w zielonym kanale i dodaj ten obszar jako Obszar zainteresowania 2. W menu Analizuj i Ustaw pomiary usuń zaznaczenie wszystkich opcji z wyjątkiem średniej wartości szarości.
W Menedżerze obszarów zainteresowania kliknij pozycję Więcej i Wiele miar, aby zaznaczyć opcje Zmierz wszystkie wycinki i Jeden wiersz na plasterek, a następnie kliknij przycisk OK. Otworzy się okno zawierające arkusz kalkulacyjny z trzema wierszami. Użyj opcji Plik i Zapisz jako, aby zapisać arkusz kalkulacyjny w pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami. Zamknij okno ze stosem obrazów i oknem arkusza kalkulacyjnego bez zamykania okna Menedżera obszarów zainteresowania, a następnie otwórz stos tiff zawierający pomiar tła.
W Menedżerze obszarów zainteresowania kliknij Więcej i Wiele miar, aby zaznaczyć opcje Zmierz wszystkie wycinki i Jeden wiersz na plasterek, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie zapisz dane w tle w osobnym pliku csv. Tutaj przedstawiono reprezentatywny kardiomiocyt pochodzący z pojedynczych komórek IPS za pomocą białych przerywanych linii oznaczających obszary zainteresowania, narysowanych podczas analizy obrazowej w kanałach RFP i GFP. Sygnał z kanału RFP wykazuje okresowy wzrost intensywności fluorescencji podczas każdego potencjału czynnościowego spowodowany rosnącym wymuszonym lub rezonansowym transferem energii spowodowanym zmianami potencjału błony.
Zgodnie z tym, sygnał GFP wykazuje okresowy spadek intensywności fluorescencji. Stosunek RFP/GFP jest sygnałem biologicznym wykorzystywanym w dalszych analizach, takich jak czas trwania potencjału czynnościowego 50 i 90 pomiarów. Na przykład, stosując tę metodę, 30-dniowe kardiomiocyty komorowe, takie jak kardiomiocyty pochodzące z komórek IPS, umieszczone na częstotliwości 0,5 Hz, wykazały średni czas trwania potencjału czynnościowego 50 wynoszący 439 milisekund i średni czas trwania potencjału czynnościowego 90 wynoszący 520 milisekund.
Elektryczna stymulacja kardiomiocytów pochodzących z komórek IPS przy rosnącym tempie stymulacji co pięć uderzeń wykazała postępujące skracanie potencjałów czynnościowych wraz ze wzrostem szybkości dudnienia. Co więcej, leczenie spontanicznie bijących kardiomiocytów pochodzących z komórek IPS izoproternolem, nieselektywnym agonistą receptora beta adreno, doprowadziło do szybkiego wzrostu szybkości dudnienia, która mogła być dalej zwiększona wraz ze wzrostem dawek agonisty. Chociaż metoda ta zapewnia lepszą przepustowość w porównaniu z klasycznymi pomiarami elektrofizjologicznymi, należy zdawać sobie sprawę z jej ograniczeń, w tym rozdzielczości czasowej, która jest ograniczona przez wewnętrzne właściwości kinetyczne fluorescencyjnego czujnika napięcia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę obrazowania optycznego potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych o fenotypie komórek komory serca. Technika ta wykorzystuje białko fluorescencyjne wrażliwe na napięcie, ekspresjonowane za pomocą promotora.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia serca
- Biologia komórek macierzystych
- Techniki obrazowania optycznego
Wprowadzenie
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (IPS) są wykorzystywane do generowania kardiomiocytów.
- Technologia ta zwiększa przepustowość rejestracji potencjałów czynnościowych.
- Elementy promotora specyficzne dla komór ventricularnych umożliwiają badania specyficzne dla danego podtypu.
- Genetycznie kodowane czujniki napięcia ułatwiają obrazowanie optyczne potencjałów czynnościowych.
Cel badania
- Opracowanie metody obrazowania potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach.
- Poprawa zrozumienia elektrofizjologii serca.
- Wykorzystanie kardiomiocytów pochodzących z iPS w zastosowaniach badawczych.
Zastosowane metody
- Transdukcja lentiwirusowa w celu wprowadzenia genetycznie kodowanych czujników napięcia.
- Mieszanie lentiwirusa z pożywką do utrzymania kardiomiocytów.
- Stosowanie bromku heksadymeteryny w celu zwiększenia wydajności infekcji.
- Wymiana pożywki hodowlanej na pożywkę do infekcji w przypadku kardiomiocytów pochodzących z iPS.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie optyczne potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach.
- Wykazanie zwiększonej przepustowości w badaniach elektrofizjologicznych.
- Umożliwienie rejestracji specyficznej dla podtypów dzięki ekspresji sterowanej promotorem.
- Walidacja zastosowania genetycznie kodowanych sensorów w obrazowaniu żywych komórek.
Wnioski
- Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania elektrofizjologii serca.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie potencjałów czynnościowych w ludzkich kardiomiocytach.
- Podejście to można zastosować w odniesieniu do różnych zagadnień biologicznych w badaniach nad sercem.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Specyficzna dla podtypu optyczna rejestracja potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach komorowych pochodzących z ludzkich iPSC rozwiązuje kluczowy problem w farmakologii bezpieczeństwa serca: heterogeniczność fenotypową maskującą sygnały zaangażowania celu. Umożliwiając pomiary selektywne dla komór, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w wczesnych etapach badań elektrofizjologicznych i wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka w przypadku modulatorów kanałów jonowych. Pozycjonuje ona iPSC-CM o charakterystyce komorowej jako system istotny dla modelowania chorób w procesie identyfikacji związków wiodących oraz walidacji modeli przedklinicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w kardiomiocytach o charakterystyce komorowej poprzez izolację sygnałów potencjału czynnościowego od zanieczyszczeń pochodzących z przedsionków lub węzłów.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów w postaci kanałów jonowych poprzez ekspresję czujników napięcia specyficznych dla podtypu, sterowaną przez promotor.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez powiązanie odczytów optycznych z fenotypami elektrofizjologicznymi specyficznymi dla komór.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Umożliwia rejestrację optycznego potencjału błonowego specyficznego dla komór komórkowych, kompatybilną z fluorescencyjną mikroskopią poklatkową w celu przesiewania związków.
- Wynik ilościowy: Pozwala na pomiary czasu trwania potencjału czynnościowego (APD50 i APD90) na podstawie zmian stosunku RFP/GFP, zapewniając skalowalne punkty końcowe elektrofizjologiczne.
- Powtarzalność: Transdukcja lentiwirusem z promotorem komórkowym zapewnia spójną ekspresję sensora w różnych partiach, co wspiera standaryzację testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Kardiomiocyty iPSC o charakterystyce komór komórkowych modelują ludzką elektrofizjologię komór, umożliwiając translacyjne dopasowanie biomarkerów do oceny ryzyka arytmii.
- Ciągłość przedkliniczna: Optyczne pomiary potencjału czynnościowego stanowią pomost między walidacją celu w fazie odkrywania a przedkliniczną oceną bezpieczeństwa w zakresie działań kardiotoksycznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dane dotyczące zależnego od częstości skracania potencjału czynnościowego oraz odpowiedzi na izoproterenol wspierają decyzje go/no-go w oparciu o istotność fizjologiczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczną ocenę kardiotoksyczności – dostarczając specyficznych dla komór komory odczytów elektrofizjologicznych, które stanowią podstawę do decyzji o dalszym rozwoju związku.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację potencjały czynnościowe komór komorowych z mieszanych populacji iPSC-CM.
- Przesiewowe badanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne sygnały optyczne z ilościowymi parametrami czasu trwania, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Generuje szeregi czasowe oparte na stosunku RFP/GFP, umożliwiając analizę czasu trwania potencjału czynnościowego oraz odpowiedzi częstotliwościowej w celu porównawczej oceny warunków.
- Badania translacyjne: Łączy specyficzne dla komór zapisy optyczne z ciągłością przedkliniczną poprzez fenotypy elektrofizjologiczne istotne dla człowieka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Lentiwirusowy konstrukt promotora komór komorowych tworzy wielokrotnego użytku platformę do przesiewowej analizy elektrofizjologii serca specyficznej dla podtypów w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej wynikającej z heterogeniczności fenotypowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność specyficznych dla komór rejestracji optycznych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne w późnych fazach programów kardiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na selektywnych dla komór profilach elektrofizjologicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu transdukcji lentiwirusowej, mikroskopii fluorescencyjnej oraz hodowli iPSC-CM.
- Wymagane instrumentarium obejmuje odwrócony mikroskop epifluorescencyjny z dzielnikiem obrazu i możliwością rejestracji obrazu za pomocą kamery wysokiej prędkości.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga spójnych protokołów ekspresji sensorów sterowanej przez promotory oraz wydajności infekcji.
- Kwestie adaptacyjne obejmują walidację specyficzności promotora w różnych liniach iPSC i partiach różnicowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rozdzielczość czasową ograniczoną przez kinetykę fluorescencyjnych sensorów napięcia, zgodnie z treścią źródłową.
