Name: Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę CLEM do wizualizacji struktur indukowanych przez wirusy w komórkach unieruchomionych kriogenicznie. Technika łączy mikroskopię świetlną z elektronową, umożliwiając badanie interakcji wirus-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni pracownikom Electron Microscopy Core Facilities (EMCF) w EMBL (Heidelberg) oraz na Uniwersytecie w Heidelbergu. Chcielibyśmy również podziękować Ulrike Herian, Stephanie Kallis i Andrei Hellwig (Uniwersytet w Heidelbergu), a także Eberhardtowi Schmidtowi i Renate Kunz (Uniwersytet w Ulm) za fachową pomoc techniczną. Prace R.B. i jego zespołu (U.H. i I.R.-B.) były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 i TRR83, TP13.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metodologia CLEM w celu zbadania wpływu ekspresji białka wirusa na błony komórkowe była już z powodzeniem stosowana do wyjaśnienia struktur związanych z replikacją HCV, głównie pęcherzyków z podwójną błoną (DMV)21, a także do określenia krytycznych elementów budulcowych wymaganych do utworzenia tych struktur indukowanych przez HCV23. Należy zauważyć, że w naszej pierwszej pracy z wykorzystaniem CLEM do badania replikacji HCV21 zastosowano nieco zmodyfikowaną wersję opisanego tutaj protokołu. W tym badaniu użyto konwencjonalnych krążków szafirowych o grubości 0,05 mm, bez wzoru alfanumerycznego, w których wzór referencyjny został utworzony poprzez pokrycie ich węglem z siatką szukacza na górze (patrz tabela materiałów). Ta wersja obecnego protokołu może być ostatecznie zastosowana, z tą zaletą, że nośnik "A" dla HPF może być używany bezpośrednio, bez konieczności jego skracania, jak na rysunku 3A. Alternatywnie, jak wspomniano w protokole, można zastosować grubszy nośnik "A" (patrz tabela materiałów) z wzorzystymi dyskami szafirowymi, bez potrzeby stosowania nośnika "B".
Co ciekawe, protokół ten może być stosowany nie tylko do badania próbek BSL-1, takich jak komórki transfekowane białkami wirusowymi, jak opisano tutaj i gdzie indziej19,23, ale także do badania komórek zakażonych wirusem. Chociaż praca z ludzkimi patogenami jest zwykle ograniczona do laboratoriów BSL-2 i BSL-3, w niektórych krajach nadal możliwe jest przeprowadzenie krioimmobilizacji w tych warunkach bezpieczeństwa biologicznego. W laboratoriach BSL-2 i BSL-3, w których witryfikacja nie jest możliwa ze względu na lokalne przepisy lub brak maszyny HPF, komórki zakażone wirusem można nadal przygotować tą metodą, jeśli chemiczne wiązanie aldehydami zostanie przeprowadzone wcześniej, a mianowicie przed opuszczeniem obiektów BSL-2 lub BSL-3. Co więcej, aldehydy muszą być schładzane natychmiast po utrwaleniu, aby utrzymać fluorescencję, podczas gdy reszta protokołu jest identyczna z opisaną tutaj. Technikę tę można uznać za zbędną, ponieważ komórki są utrwalane dwukrotnie, chemicznie i poprzez witryfikację. Jednak ten protokół podwójnej fiksacji prowadzi rzeczywiście do znacznie lepszego zachowania DMV indukowanych przez HCV w porównaniu z DMV znajdującymi się w komórkach poddanych samej fiksacji chemicznej21.
W celu dalszych modyfikacji i rozwiązywania problemów czytelnik jest odsyłany do notatek w całej części protokołu tego rękopisu. Uwagi te opisują pułapki, których należy unikać, a także alternatywy pozwalające przezwyciężyć przypuszczalne trudności, które mogą pojawić się podczas wykonywania tej metody.
Głównym warunkiem zastosowania tej techniki jest maszyna HPF. Gdy krioimmobilizacja komórek za pomocą HPF nie jest możliwa (z powodu braku maszyny HPF) lub nie jest wymagana (gdy konserwacja membrany nie musi być optymalna), komórki można chemicznie utrwalić, a następnie przygotować i przeanalizować za pomocą EM 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,Rozdział 18,19. Ta opcja nie wymaga użycia szafirowych krążków, ale naczyń do hodowli komórkowych z wzorami w siatkę do przenoszenia komórek lub klastrów komórek. Główną zaletą zastosowania tych szalek jest ich większa średnica w porównaniu do krążków szafirowych, pozwalająca na przesiewanie większych powierzchni. W związku z tym zastosowanie tego protokołu CLEM zostało z powodzeniem zastosowane do badania wpływu związku przeciwwirusowego przeciwko HCV15 lub do wizualizacji przegrupowań błon indukowanych przez niestrukturalne białka norowirusów19. Innym problemem, który może ograniczać wydajność tej metody, jest brak komercyjnego urządzenia FS. W takim przypadku zamiast tego można wykorzystać podstawowe domowe systemy FS. Chociaż automatyczne urządzenia FS mogą zmniejszyć liczbę nieszczęśliwych wypadków, urządzenia domowej roboty są z powodzeniem używane, na przykład w laboratoriach Kent McDonald's30 i Paul Walther.
Jeśli chodzi o wiązanie chemiczne, opisany tutaj protokół zapewnia optymalne zachowanie struktur wewnątrzkomórkowych20. W związku z tym, w przypadku, gdy dostępne są wyżej wymienione urządzenia HPF i FS, preferowane byłoby witryfikowanie interesujących komórek.
Przyszłe alternatywy dla tego podejścia CLEM obejmują możliwość wykorzystania tej metody nie tylko do pozyskiwania informacji 2D na poziomie ultrastrukturalnym, ale także do uzyskiwania informacji 3D na temat architektury zmian błon i organelli spowodowanych przez wirusy. Metody 3D-EM, w tym tomografia elektronowa (ET) i mikroskopia elektronowa ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM) (obszernie opisane w29), mogą być również stosowane do komórek, które zostały przygotowane zgodnie z tym obecnym protokołem21,31. Ponadto informacje 3D można było również uzyskać na poziomie LM, przy użyciu mikroskopu konfokalnego, który pozwala na akwizycję stosów z. W rzeczywistości ta opcja jest wysoce zalecana, gdy pożądana jest precyzyjna korelacja między zestawami danych LM i EM (patrz przykład17). Informacje zawarte w stosach z 3D pomagają poprawić korelację z obrazami TEM 2D. Tak więc w takim scenariuszu można wybrać najlepiej pasujące obrazy LM i EM, a następnie poddać je jednemu z dostępnych programów do korelacji, takich jak wtyczka ec-CLEM ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 lub wtyczka Landmark Correspondences Image J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), co skutkuje generowaniem nakładających się obrazów LM-EM.
Gdy informacje czasowe są potrzebne do zrozumienia kinetyki określonego zdarzenia, obrazowanie poklatkowe może być wykorzystane do monitorowania dynamiki żywych komórek w połączeniu z EM. Podczas interesującego zdarzenia komórki są natychmiast naprawiane, generując "zamrożoną migawkę", która może być następnie analizowana przez EM, dostarczając szczegółowych informacji ultrastrukturalnych o tym konkretnym momencie w momencie unieruchomienia. Aby uzyskać tę "zamrożoną migawkę", po obserwacji w czasie rzeczywistym, komórki mogą być albo chemicznie utrwalone33, albo unieruchomionekriologicznie6. Ponieważ wiele procesów komórkowych zachodzi szybciej niż procesy dyfuzji wiązania chemicznego, jeśli to możliwe, należy przeprowadzić ultraszybkie zamrażanie. Należy jednak wziąć pod uwagę, że maszyny HPF różnią się efektywną rozdzielczością czasową34.
Ponadto, chociaż protokół ten został opracowany do osadzania komórek w żywicy epoksydowej, ogniwa mogą być również zatopione w żywicach o niskiej lepkości, takich jak Lowicryls, LR White lub LR Gold. Zastosowanie tych pożywek do zatapiania pozwala na zachowanie antygenowości 35,36, a także fluorescencji37,38 i dlatego są one najczęściej stosowane do poosadzania w sekcjiznakowania immunologicznego 39,40 i CLEMw sekcji 41,42,43,44, gdzie LM jest wykonywany po osadzeniu. Oba podejścia (immuno-EM i CLEM w sekcji) muszą być kluczowe dla tych doświadczeń, w których niecharakterystyczne struktury można łatwo znaleźć za pomocą TEM i/lub jako kontrolę przeciwko błędnej korelacji między sygnałami LM i EM. Podobnie, znakowanie przeciwciałami, które można uwidocznić za pomocą obu metod obrazowania (LM i EM), można przeprowadzić45 w celu, na przykład, identyfikacji transfekowanych komórek w LM (etap wstępnego osadzania) i uzyskania znacznie dokładniejszej lokalizacji sygnału GFP poprzez jego specyficzne znakowanie przez immuno-EM (etap po osadzeniu). Należy jednak wziąć pod uwagę, że przepuszczalność jest przeprowadzana przed LM, aby umożliwić dostęp przeciwciał do przestrzeni wewnątrzkomórkowej, co może skutkować nieoptymalnym zachowaniem architektury komórki na poziomie EM. Co ciekawe, protokół ten doskonale nadaje się również do eksperymentów wielokolorowych, które można osiągnąć przy użyciu innych znaczników fluorescencyjnych, innych niż GFP (jak pokazano tutaj). Podsumowując, istnieje wiele przypuszczalnych możliwości dostosowania tego protokołu, zarówno po stronie LM, jak i po stronie EM, w zależności od pytań, które są poruszane. W celu uzyskania wyczerpującego opisu innych alternatywnych protokołów czytelnik jest odsyłany do 5,46. Niezależnie od tego, w jaki sposób połączone zostaną metody mikroskopii, razem uzyskamy informacje, które pozwolą nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób wirusy i ich białka oddziałują ze swoimi gospodarzami w prawdziwym życiu.
Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest zebranie odcinków szeregowych z interesujących komórek. Jak podkreślono w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników, wymaga to doświadczonego personelu, a także dużej cierpliwości. Co ważne, ten krok jest niezbędny, aby znaleźć ogniwa z powrotem na poziomie EM z dwóch powodów. Po pierwsze, w tego rodzaju protokole CLEM wykorzystującym wstępne zatapianie LM, współrzędne są widoczne tylko na poziomie LM i na powierzchni bloku żywicy po osadzeniu. Nie będą one jednak widoczne na sekcjach TEM. Dlatego ukierunkowane przycinanie bloku zadrukowaną stroną do dołu do obszarów zainteresowania (ROI) musi być wykonywane ostrożnie za pomocą żyletki, aby upewnić się, że uzyskane następnie sekcje zawierają komórki wyrażające daną FP. Po drugie, konieczne jest "przeskanowanie" kilku sekcji, aby znaleźć najlepszą nakładkę między LM a akwizycjami EM. W przeciwieństwie do metod, w których LM jest wykonywany na etapie po zasadzeniu, w tym przypadku nakładka LM-EM nie jest tak precyzyjna. Niska dokładność nakładania wynika z różnic w rozdzielczości osiowej między LM i EM, skurczu podczas przetwarzania próbki EM i ściskania podczas cięcia42. Niemniej jednak skuteczne metody śledzenia, takie jak wykorzystanie punktów orientacyjnych, pomagają odzyskać komórki. Obejmuje to położenie jednej komórki względem drugiej, a także kształt komórek i ich jądra. W związku z tym, jak wyjaśniono w protokole, obrazy DIC dostarczają "anatomicznych" informacji o komórkach, które mają kluczowe znaczenie dla poprawy korelacji. Alternatywnie, jądra lub inne dobrze rozpoznawalne organelle komórkowe (takie jak mitochondria lub kropelki lipidów) mogą być barwione przed LM i wykorzystywane jako punkty orientacyjne.
Na koniec warto wspomnieć, że chociaż manuskrypt ten koncentruje się na wykorzystaniu tej techniki do badań wirusologicznych, zakres tego projektu eksperymentalnego może zostać rozszerzony, aby zająć się bardziej ogólnymi kwestiami biologicznymi.

Koncepcja łączenia dwóch metod mikroskopii w celu uzyskania lepszego obrazu konkretnego procesu biologicznego jest dość stara. Pierwsze badanie nad wirusami z wykorzystaniem „mikroskopii korelacyjnej” zostało opublikowane w 1960 roku w formie dwóch oddzielnych publikacji1,2. W badaniu tym autorzy analizowali zmiany w morfologii jądra wywołane przez adenowirusy za pomocą dwóch technik mikroskopowych. W pierwszej publikacji przedstawiono obserwacje z mikroskopii elektronowej (EM), opisujące szczegóły morfologiczne związane z infekcją adenowirusami1. W drugiej publikacji różne struktury zaobserwowane w EM skorelowano z obrazami z mikroskopii świetlnej (LM) przedstawiającymi wzory barwienia histochemicznego, aby zdefiniować naturę struktur wcześniej zaobserwowanych w EM2.
W tych wczesnych badaniach obserwacje przeprowadzano jednak na różnych zakażonych komórkach, przygotowanych w ramach niezależnych eksperymentów. „Korelacja” oznaczała w rzeczywistości połączenie informacji pochodzących z dwóch modalności obrazowania w celu zrozumienia określonego zjawiska, poprzez porównanie wszystkich wyników uzyskanych za pomocą różnych testów, aby zrozumieć dany proces biologiczny.
Obecnie termin mikroskopia korelacyjna, znana również jako korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM), jest stosowany w odniesieniu do coraz większej liczby metod (przegląd w referencjach3,4,5), których wspólną cechą jest to, że obie techniki obrazowania (LM i EM) są przeprowadzane na tym samym preparacie. Połączenie obu metod pozwala tym samym na multimodalną, wieloskalową i wielowymiarową analizę próbki3. Zaletą jest to, że LM może zapewnić szeroki przegląd wielu różnych komórek, umożliwiając identyfikację subpopulacji komórkowych wykazujących ekspresję interesującego białka lub białek w heterogenicznej populacji komórek. EM przełamuje limit rozdzielczości LM, dostarczając obraz o wyższej rozdzielczości konkretnego zdarzenia wewnątrzkomórkowego. Co więcej, EM umożliwia wizualizację niefluoryzującego kontekstu subkomórkowego, w tym wszystkich organelli ograniczonych błoną, dużych kompleksów makromolekularnych (np. rybosomów, centriolów, itd.) oraz elementów cytoszkieletu, dostarczając tym samym dodatkowych informacji przestrzennych, tzw. „przestrzeni referencyjnej”6, i nadając kontekst punktowi fluorescencyjnemu wykrytemu za pomocą LM.
W ciągu ostatnich kilku lat metoda CLEM stała się potężnym narzędziem nie tylko dla biologów komórkowych5, ale także dla wirusologów (przegląd w odniesieniu7) pragnących zrozumieć złożone oddziaływania wirus-komórka, które prowadzą do skutecznej propagacji wirusa. Zrozumienie, w jaki sposób wirusy modyfikują błony komórkowe i organelle dla własnych korzyści, jest zatem kluczowe dla opracowania leków przeciwwirusowych służących do eliminacji wirusów patogennych.
Opisano tutaj metodę CLEM, która umożliwia detekcję za pomocą mikroskopii świetlnej (LM) komórek eksponujących białka wirusowe połączone z białkiem fluorescencyjnym (FP). Komórki te są następnie kriounieruchamiane i dalej przygotowywane do analizy ultrastrukturalnej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), aby uzyskać nową wiedzę na temat tego, w jaki sposób ekspresja tych białek reorganizuje błony wewnątrzkomórkowe (Rycina 1). W większości opublikowanych do tej pory badań wirusologicznych metoda CLEM była przeprowadzana na komórkach utrwalonych chemicznie8,9,10,1,12,13,14,15,16,17,18,19. Wynika to głównie z konieczności inaktywacji materiału zakaźnego ze względów bezpieczeństwa biologicznego w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa 2 i 3 (BSL-2 i BSL-3), gdzie kriounieruchomienie komórek zazwyczaj nie jest możliwe. Jednak w przypadku zagadnień wymagających optymalnej konserwacji błon komórkowych wysoce zaleca się witryfikację za pomocą mrożenia wysokociśnieniowego (HPF)20. W takich przypadkach można zastosować opisany tutaj protokół CLEM. Co ciekawe, zwłaszcza podczas pracy z próbkami zakaźnymi, HPF można przeprowadzać na próbkach, które zostały wcześniej inaktywowane chemicznie, na przykład w laboratoriach BSL-2 i BSL-3. Połączenie utrwalania chemicznego z późniejszym HPF stanowi możliwość częściowego skorzystania z zalet metod krio-konserwacji21,2.
<img alt="Przygotowanie komórek do mikroskopii elektronowej: schemat procesu fiksacji, odwodnienia i sekcjonowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Schematyczny przebieg analizy komórek za pomocą CLEM (Korelacyjna mikroskopia elektronowa i świetlna). Komórki hodowane na wzorowanych dyskach szafirowych są najpierw analizowane za pomocą LM w celu zlokalizowania komórek wykazujących ekspresję FP przed ich przygotowaniem do EM. Po zlokalizowaniu komórki są natychmiast utrwalane metodą HPF i FS, a następnie zatapiane w żywicy. Po polimeryzacji żywicy podłoże, na którym rosły komórki (=dyski szafirowe), musi zostać usunięte z bloku żywicy. Blok zawierający zatopione komórki jest przycinany do kształtu małego trapezu, z którego pozostałe komórki wykazujące ekspresję FP są przecinane nożem diamentowym. Ultracienkie przekroje są zbierane na siatkach szczelinowych i poddawane dalszej analizie za pomocą TEM w celu uzyskania informacji o ultrastrukturze tych komórek. Rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany za zgodą autora z literatury.29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

<table><tbody><tr><td>Sieciownik UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Stratalinker 1800, 230 Vac, wyposażony w żarówki UV 254 nm, 8 Watt/każda.</td></tr><tr><td>Wzorzyste krążki szafirowe</td><td>Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria</td><td>627</td><td>Mają średnicę 0,3 mm i grubość 0,16 mm, a także wytrawiony wzór alfanumeryczny, aby umożliwić zmianę lokalizacji komórek. Można je zamawiać tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Wąska i długa pęseta</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72919-SS</td><td>"Style SS", do obsługi krążków szafirowych.</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>41965-062</td><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM) uzupełniona 2 mM L-glutaminą, aminokwasami endogennymi, 100 jednostkami penicyliny na ml, 100 i mikro; g streptomycyny na ml i 10% płodowej surowicy cielęcej (DMEM kompletne, patrz poniżej). Opakowanie zawierające 10 butelek po 500 ml każda.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>25030-123</td><td>Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11140-068</td><td>Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140-163</td><td>Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>F7524</td><td>Butelka 50 ml</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Deutschland, Hamburg, Niemcy</td><td>CKX41</td><td>Jest to mikroskop odwrócony z opcjami głowicy trójokularowej i możliwością ulepszania fluorescencji.</td></tr><tr><td>Komórki Huh7-Lunet stabilnie eksprymujące polimerazę RNA T7</td><td>Dostępne w laboratorium prof. dr Ralfa Bartenschlagera</td><td>Niedostępne</td><td>Skontaktuj się z prof. Bartenschlagerem pod adresem: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Mirus TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td><td>MIR 2304</td><td>Szerokie spektrum, niska toksyczność, odczynnik do transfekcji DNA. Fiolka 0,4 ml</td></tr><tr><td>Odwrócony szerokokątny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Niemcy</td><td>Zeiss Observer.Z1</td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny do eksperymentów z udziałem żywych kultur komórkowych.</td></tr><tr><td>1-heksadecen</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>8220640100</td><td>Butelka 100 ml</td></tr> <tr><td>Aluminiowe uchwyty "A" do obróbki wysokociśnieniowej (HPF)</td><td>Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria</td><td>241</td><td>Jest to uchwyt, który został użyty w tym protokole i ma 2 różne głębokości 0,1 i 0,2 mm. Można go zamówić tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Uchwyty aluminiowe "B" dla</td><td>Biura Inżynieryjnego HPF M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria</td><td>242</td><td>Jest to uchwyt, który został użyty w tym protokole. Ma grubość 0,3 mm. Można je zamawiać tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Aluminiowy uchwyt "A" do HPF (specjalny do pracy z wzorzystymi tarczami szafirowymi)</td><td>Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria</td><td>737</td><td>Jest to uchwyt, który może być używany samodzielnie z wzorzystym dyskiem szafirowym (jako alternatywa dla obecnego protokołu), bez potrzeby posiadania uchwytu "B" lub edycji uchwytu "A". Ma grubość 0,84 mm. Można go zamówić tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Tarcze szafirowe</td><td>Biuro Inżynieryjne M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria</td><td>405</td><td>Te szafirowe krążki są "konwencjonalne", o średnicy 0,3 mm i grubości 0,05 mm . Mogą być również używane do CLEM jako alternatywa zamiast wzorzystych krążków szafirowych.</td></tr><tr><td>Siatki szukacza</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, Filadelfia, USA</td><td>LF135-Cu</td> Te siatki o siatce <td>135 są używane do tworzenia alfanumerycznego wzoru na "konwencjonalnych" krążkach szafirowych (opisanych powyżej) poprzez powlekanie węglowe, dzięki czemu można je stosować do CLEM. 100 siatek/fiolkę.</td></tr><tr><td>Maszyna HPF</td><td>ABRA Fluid AG, Widnau, Szwajcaria HPM</td><td>010</td><td>Ta maszyna HPF została użyta do tego protokołu.</td></tr><tr><td>Maszyna HPF</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>EMPACT 2</td> <td>"EMPACT 2", jako alternatywa dla korzystania z maszyny HPM, że została ona użyta w tym protokole (opisanym powyżej).</td></tr><tr><td>Kriorurki</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Z763667-500EA</td><td>Do długotrwałego przechowywania próbek unieruchomionych kriomobilizacją w ciekłym azocie. Opakowanie zawierające 500 kriowialiów.</td></tr><tr><td>Ciekły azot dewar</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Niemcy</td><td>GZ-05094-60</td><td>Do długotrwałego przechowywania próbek unieruchomionych kriomobilizacją w ciekłym azocie, wyposażony w krio-stojaki o pojemności 1600 krioprobówek.</td></tr><tr><td>Automatyczna maszyna do substytucji przez zamrażanie (AFS)</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>EM AFS2</td><td>Ta maszyna wykonuje techniki substytucji przez zamrażanie i progresywne obniżanie temperatury (PLT) oraz umożliwia zatapianie i polimeryzację żywic w niskiej temperaturze.</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu (OsO4)Mikroskopia</td> <td>elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>19150</td><td>4% roztwór wodny, jedno pudełko zawierające 10 x 2 ml ampułek.</td></tr><tr><td>Octan uranu (UA)</td><td>Serva, Heidelberg, Niemcy</td><td>77879.01</td><td>Butelka zawierająca 25 gr (UA)-2 H2O.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin Electronic, Berlin, Niemcy</td><td>329</td><td>"Sonorex Super RK 31" to ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca o dużej mocy do wodnego roztworu czyszczącego, która jest używana w tym protokole do mieszania OsO4 i Ua podczas przygotowywania podłoża FS.</td></tr><tr><td>Aceton destylowany szkłem</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>10015</td><td>Butelka 100 ml</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>Leica M80</td><td>Rutynowy mikroskop stereoskopowy do codziennych inspekcji, wyposażony w kamerę do robienia zdjęć.</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>14120</td><td>Embed 812 to zestaw zawierający kilka składników, które należy ze sobą wymieszać w proporcjach podanych przez producentów.</td></tr><tr><td>Pierścienie przepływowe</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>16707157</td><td>Opakowanie zawierające 100 sztuk.</td></tr><tr><td>Kąpiele odczynnikowe</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>16707154</td><td>Opakowanie zawierające 100 sztuk.</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>Leica EM UC7</td><td>Ultramikrotom do przygotowywania pół- i ultracienkich przekrojów w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy Ultra 35 &deg.</td><td>Diatome Ltd., Nidau Szwajcaria</td><td>AGG339-735</td><td>Ten nóż ma krawędź o długości 3 mm.</td></tr><tr><td>Ultracienka pęseta</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>E78318</td><td>"Style 3X", do obsługi siatek EM.</td></tr><tr><td>Siatki szczelinowe EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>G2010-Cu</td><td>100 siatki / fiolkę.</td></tr><tr><td>Skrzynka do przechowywania siatki EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>71155</td><td>Ma pojemność na 100 siatek.</td></tr></tbody></table>

korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (clem) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Ze względu na swoją wysoką rozdzielczość, mikroskopia elektronowa (EM) jest niezbędnym narzędziem dla wirusologów. Jednak jedną z głównych trudności podczas analizy komórek zakażonych wirusem lub transfekowanych za pośrednictwem EM jest niska skuteczność infekcji lub transfekcji, co utrudnia badanie tych komórek. Aby przezwyciężyć tę trudność, można najpierw wykonać mikroskopię świetlną (LM) w celu przypisania subpopulacji zakażonych lub transfekowanych komórek. Tak więc, wykorzystując zastosowanie białek fluorescencyjnych (FP) połączonych z białkami wirusowymi, LM jest tutaj używany do rejestrowania pozycji komórek "transfekowanych pozytywnie", wyrażających FP i rosnących na podporze o alfanumerycznym wzorze. Następnie komórki są dalej przetwarzane na EM poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF), substytucję przez wymrażanie (FS) i zatapianie żywicy. Ultraszybki etap zamrażania zapewnia doskonałe zachowanie błony wybranych komórek, które można następnie analizować na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). W tym miejscu przedstawiono krok po kroku proces korelacyjnej mikroskopii świetlnej elektronów (CLEM), szczegółowo opisujący przygotowanie próbki, obrazowanie i korelację. Projekt eksperymentalny może być również zastosowany do odpowiedzi na wiele pytań z zakresu biologii komórki.

Stosując procedurę przedstawioną w niniejszym opracowaniu (Rysunek 1), komórki Huh7-Lunet stabilnie wykazujące ekspresję polimerazy RNA T7 wysiano na wzorcowanych dyskach szafirowych, a następnie transfectedowano plazmidem wykazującym ekspresję dwóch domen białka niestrukturalnego NS5A wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), znakowanych GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Rysunek 4). Następnego dnia wzorcowane dyski szafirowe, na których rosły komórki, wyjęto z naczyń hodowlanych i zobrazowano za pomocą LM (Rysunek 4, Rysunek 2). Komórki wykazujące ekspresję AH-D1-GFP zidentyfikowano po obecności zielonej fluorescencji w cytozolu i zarejestrowano, aby zapisać ich pozycje w układzie współrzędnych wzorca dysków szafirowych (Rysunki 5A, 5B). Bezpośrednio po badaniu LM dyski szafirowe zawierające interesujące komórki umieszczono pomiędzy dwoma aluminiowymi nośnikami (Rysunek 3) i poddano krioimmobilizacji metodą HPF. Następnie komórki poddano substytucji mrożenia, a w dalszej kolejności zatopiono w żywicy epoksydowej.
Po usunięciu dysków szafirowych z spolimeryzowanych bloków żywicznych, na powierzchni bloku widoczny był odcisk wzoru alfanumerycznego, co pozwoliło na zlokalizowanie obszarów, w których znajdowały się interesujące nas komórki. Pozostałą część bloku żywicznego odcięto, aby otrzymać mały trapez zawierający poszukiwane komórki. Z tego trapezu wykonano seryjne ultracienkie przekroje, które zebrano na siatkach do slotów EM i poddano dalszej analizie za pomocą TEM (Rycina 5C). Należy zauważyć, że uzyskanie seryjnych przekrojów metodą manualną, choć możliwe28, jest pracochłonne i wymaga dobrze przeszkolonego oraz wykwalifikowanego personelu. Istotne jest również, aby komórki miały niską konfluencję podczas stosowania tego protokołu CLEM (Rycina 5A), aby zagwarantować szybkie rozpoznanie tej samej komórki, która została wcześniej zidentyfikowana za pomocą LM. W przeciwnym razie wyższa konfluencja komórek mogłaby znacznie spowolnić proces pomyślnego lokalizowania komórek na poziomie EM.
Analiza TEM kilku ultracienkich przekrojów analizowanej komórki (Rycina 5D, 5E), wykazującej ekspresję AH-D1-GFP, ujawniła obecność w przestrzeni wewnątrzkomórkowej dużych skupisk pęcherzyków o zróżnicowanej morfologii, oddzielonych od otaczającego cytozolu pojedynczą dwuwarstwą lipidową (Rycina 5E).
<img alt="Schemat edycji genu HCV, przedstawiający ekspresję polimerazy RNA T7, proces transfekcji oraz analizę wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4Schematyczny przedstawienie przebiegu prac w celu wykonania przykładu CLEM przedstawionego w Rycina 5. Komórki Huh7-Lunet stabilnie wykazujące ekspresję polimerazy RNA T7 zostały przetransfekowane plazmidem DNA kodującym amfipatyczną helisę (AH) oraz domenę 1 (D1) białka NS5A HCV, z GFP przyłączonym do końca C-końcowego (pTM_AH-D1-GFP). Ekspresja tej części białka NS5A jest kontrolowana transkrypcyjnie przez promotor T7 (T7 Pm), a translacyjnie przez element IRES (wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu) wirusa zapalenia mięśnia sercowo-mózgowego (EMCV), wskazaną przez strukturę drugorzędową. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji (24 hpt) komórki rosnące na wzorcowanych dyskach szafirowych i wykazujące ekspresję AH-D1-GFP zostały wykryte za pomocą LM, a następnie poddane analizie HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii jądra komórkowego, schemat przedstawiający przekroje komórkowe, analiza struktur podkomórkowych, skala nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Przykład procedury CLEM. (A) Komórki Huh7-Lunet stabilnie eksponujące polimerazę T7, analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wyznaczenia komórek GFP-dodatnich hodowanych na strukturyzowanych dyskach szafirowych, 24 h po transfekcji plazmidem pTM_AH-D1-GFP. (B) Obraz o większym powiększeniu pojedynczej komórki wybranej wewnątrz białego przerywanego prostokąta do analizy metodą CLEM. (C) Obraz TEM ultracienkiego przekroju tej samej komórki po HPF, FS i zatopieniu w żywicy. (D) Schematyczne przedstawienie seryjnych ultracienkich przekrojów o grubości 70 nm na siatce EM z nacięciem, zawierających badaną komórkę. (E) Po lewej: przekroje TEM dwóch sekcji badanej komórki. Po prawej: obrazy TEM o dużym powiększeniu obszarów wewnątrzkomórkowych zaznaczonych żółtymi prostokątami po lewej stronie, ukazujące liczne pęcherzyki oddzielone od cytozolu pojedynczą błoną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii dotyczące tego, w jaki sposób biobiałka znajdujące się w błonach komórkowych tworzą środowiska sprzyjające bioreplikacji i składaniu. Dwa techniczne kamienie węgielne, które są tutaj połączone, to po pierwsze, korelacja między obrazowaniem żywych komórek a mikroskopią elektronową, a po drugie, zamrażanie pod wysokim ciśnieniem. Chociaż metoda ta została zaprojektowana i z powodzeniem wykorzystana do zwalczania interakcji ze źródłami wirusów, można ją łatwo uogólnić na szereg zastosowań w biologii komórki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje wiele etapów, które wymagają praktycznego doświadczenia z sukcesem, zwłaszcza kriounieruchomienie przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i kolejne kroki. Zacznij od umieszczenia wzorzystych krążków szafirowych z wzorem alfanumerycznym wytrawionym na jednej z ich powierzchni w 15-mililitrowej stożkowej probówce wirówkowej i dokładnego umycia krążków etanolem. Umieść umyte krążki szafiru na szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną do wysuszenia i użyj długiej, cienkiej pęsety, aby przenieść wysuszone krążki szafiru na szkiełka podstawowe. Używając odwróconego mikroskopu przy 4-krotnym powiększeniu, upewnij się, że wzór współrzędnych na każdym szafirowym krążku jest czytelny. Następnie sterylizuj krążki środkiem sieciującym w ultrafiolecie przez pięć minut. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj połowę pożywki do hodowli komórkowej do naczynia do hodowli komórkowych i użyj długiej pęsety, aby ostrożnie przenieść krążki szafiru do naczynia. Następnie wysiewaj 1x10

correlative-light-electron-microscopy-clem-for-tracking-imaging-viral

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy wykonanie niskokosztowego stopnia kriogenicznego, zaprojektowanego tak, aby pasował do większości mikroskopów światła odbitego. Ten zbudowany w laboratorium stopień kriogeniczny umożliwia efektywne i niezawodne obrazowanie korelacyjne pomiędzy kriomikroskopią świetlną a kriomikroskopią elektronową.

Budowa niskokosztowego stolika do kriomikroskopii świetlnej na potrzeby skorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Poznaj metodę CLEM do wizualizacji struktur indukowanych przez wirusy w komórkach unieruchomionych kriogenicznie. Technika łączy mikroskopię świetlną z elektronową, umożliwiając badanie interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie (Wideo) | JoVE Journal

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Przeglądaj więcej filmów