Name: Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu spektroskopii fluorystycznej. Technika ta umożliwia badanie interakcji białkowych przy niskich stężeniach z wykorzystaniem minimalnych ilości oznaczonych białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez grant Wellcome Trust 105278/Z/14/2 dla R.N. Wellcome Trust Centre for Human Genetics jest finansowane przez Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2. Prace w grupie C.S. są wspierane przez Cancer Research UK (C20724/A14414) oraz Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantu Unii Europejskiej w ramach programu badań naukowych i innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 647278.

1. FKBP12 F36V -mVenus Oczyszczanie
<ol>
	<li>Przekształć (DE3) komórki pLysS za pomocą wektora pET22b zawierającego monomeryzowane ludzkie FKBP12F36V12 oraz N-końcowe znaczniki His6 i mVenus (wektor dostępny na życzenie). Płytki na agarze LB uzupełnione 50 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu.</li>
	<li>Przenieść przekształcone kolonie do 100 ml kultury starterowej LB i rosnąć przez 16 - 20 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
	<li>Rozcieńczyć gęstą kulturę starterową (OD600 >1) w stosunku 1:100 w podłożu LB (2 x 500 ml partie) i rosnąć przez 2 - 3 godziny do OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 obr./min).</li>
	<li>Fajne kultury na lodzie. Indukować za pomocą 250 μM IPTG i rosnąć przez 16 - 20 godzin w temperaturze 21 °C, 200 obr./min.</li>
	<li>Zbieraj komórki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 20 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad w 40 ml buforu A IMAC (20 mM fosforanu sodu o pH 7,5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazolu, 1 mM β-merkaptoetanolu) uzupełnionego inhibitorami proteazy wolnymi od EDTA (1 tabletka na komórkę).</li>
	<li>Sonikować komórki (500 watów, 20 kHz, amplituda 40%, 9 s wł., 11 s wyłączone na 15 min) na lodzie i zebrać rozpuszczalny materiał przez odwirowanie przy 20 000 x g.</li>
	<li>Przenieść rozpuszczalny lizat do kolby stożkowej i dodać 2 ml żywicy (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 1 godzinę z obrotem 105 obr./min 
	UWAGA: Sefaroza niklu może być również użyta do tego etapu IMAC.</li>
	<li>Zebrać żywicę i przemyć 250 ml buforu A IMAC, a następnie 500 ml buforu B IMAC (20 mM fosforanu sodu pH 7,5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazolu, 1 mM β-merkaptoetanolu). 
	UWAGA: Zwiększ do 50 mM imidazolu, jeśli używasz żywicy sefarozy niklowej.</li>
	<li>Elute białko znakowane His6 za pomocą buforu C IMAC (20 mM fosforan sodu pH 7,5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol).</li>
	<li>Wstrzyknąć do kolumny wykluczającej wielkość (patrz tabela materiałów) zrównoważonej w 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V ma swoją szczytową elucję przy 87,71 ml na użytej przez nas kolumnie.</li>
	<li>Oceń czystość za pomocą SDS-PAGE i połącz i skoncentruj zgodnie z wymaganiami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tablicy płyt wielodołkowych
<ol>
	<li>Rozmrozić oczyszczony FKBP12F36V (lub znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania) w temperaturze od -80 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór 100 nM oczyszczonego FKBP12F36V (pożywka, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonikacja i wirowanie (szybkie wirowanie 13 000 obr./min), aby zapobiec tworzeniu się agregatów.</li>
	<li>Pipetę 100 - 200 μL do 8-dołkowej komory obserwacyjnej ze szklanym dnem.</li>
	<li>Dodaj dimeryzator BB do końcowych stężeń 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 i 500 nM12,13.</li>
	<li>Jako odniesienie przygotuj roztwór 100 nM samego mVenus, aby ocenić potencjalne efekty agregacji i opadów oraz odzyskać wartość jasności monomeru przy tych samych ustawieniach akwizycji.</li>
</ol>
3. Akwizycja konfokalna bez kalibracji
<ol>
	<li>Uruchom system konfokalny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Działałby dowolny system konfokalny mikroskopu skaningowego ze światłem wyposażony w detektory cyfrowe lub dobrze scharakteryzowane detektory analogowe8 i zdolny do utrzymywania stałego czasu przebywania dla każdego uzyskanego piksela.</li>
	<li>Ustaw ścieżkę wiązki wzbudzenia:
	<ol>
		<li>Włącz laser 514 nm i ustaw go na moc 20 - 100 nW na wyjściu z obiektywu (dla FKBP12F36V-mVenus).</li>
		<li>Wybierz obiektyw 63X1.4NA lub obiektyw z korekcją kołnierza do zanurzenia w wodzie przeznaczony do FCS.</li>
		<li>Włącz jeden detektor HyD, APD lub skalibrowany PMT. Preferowane są detektory zdolne do zliczania fotonów, ponieważ w tym przypadku obliczanie S, przesunięcia i σ02 nie jest konieczne.</li>
		<li>Wybierz okno emisji od 520 do 560 nm</li>
		<li>Ustawić otwór na 1 jednostkę Airy dla odpowiedniej emisji ~545 nm.</li>
		<li>Ustaw tryb akwizycji na 16 x 16 pikseli</li>
		<li>Ustaw czas zatrzymania piksela tw taki sposób, aby spełniał tklatki >> TD >> t zatrzymania, gdzie D jest czasem przebywania białka dyfuzyjnego, a tklatka jest liczbą klatek na sekundę. Odpowiadało to ustawieniu czasu przebywania na ~13 μs. 
		Uwaga: Niektórzy producenci komercyjni mieli skanery, które nie utrzymywały stałego czasu przebywania na pikselu. Ta stałość jest kluczowa, aby metoda działała.</li>
		<li>Ustaw rozmiar piksela na ~120 nm.</li>
		<li>Wybierz tryb akwizycji xyt i wybierz liczbę klatek, które mają zostać pozyskane na akwizycję i studnię (na przykład 5,000).</li>
		<li>Jeśli system jest wyposażony w tryb wysokiej przepustowości, wprowadź współrzędne każdego odwiertu i liczbę akwizycji na odwiert, aby zautomatyzować proces. 
		Uwaga: Uważaj, aby upewnić się, że jest dostępny dystrybutor wody w przypadku korzystania z obiektywu zanurzeniowego.</li>
		<li>Jeśli system jest wyposażony w system perfuzyjny, załaduj roztwór BB i zaprogramuj perfuzję tak, aby rozpoczynała się zaraz po 5000klatce, aby ocenić kinetykę dimeryzacji podczas uzyskiwania np. 10 000 obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj kroplę oleju do obiektywu zanurzeniowego w oleju / wody, jeśli używasz obiektywu do zanurzenia w wodzie z korekcją kołnierza przeznaczonego do FCS.</li>
	<li>Zamontuj 8-dołkową komorę obserwacyjną w scenie.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią studnię i skup się na rozwiązaniu. 
	Uwaga: WAŻNE: Unikaj ustawiania ostrości blisko dolnej szyby, aby uniknąć odbicia i rozproszenia. Podczas ustawiania ostrości głębiej na rozwiązaniu odłącz opcję automatycznego ustawiania ostrości.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie i zapisz wynikowy stos obrazów w formacie TIFF.</li>
</ol>
4. Detrend i analiza jasności przy użyciu pakietu R nandb
<ol>
	<li>W ramach wstępnego sprawdzania jakości przetwarzania użyj ImageJ14, aby przyjrzeć się obrazom i odzyskać profil intensywności, jak pokazano w Rysunek 2a. Jest to przydatne do określenia, czy wystąpiło zbyt dużo fotowybielania. Jeśli bielenie jest zbyt duże, dane nie nadają się do dalszej analizy. 
	Uwaga: ImageJ może być również przydatny do konwersji obrazów do formatu TIFF z formatów komercyjnych. Opisane poniżej oprogramowanie nandb może pracować tylko z plikami TIFF.</li>
	<li>Pobierz i zainstaluj R i RStudio15,16. Najlepiej jest najpierw pobrać i zainstalować R, a następnie RStudio. 
	UWAGA: Poniżej znajduje się opis sposobu korzystania z pakietu nandb R. Znajomość języka R nie jest wymagana do korzystania z nandb, jednak ułatwi życie.</li>
	<li>Zainstaluj pakiet nandb.
	<ol>
		<li>Otwórz program RStudio i w konsoli wpisz install.packages("nandb") i poczekaj na instalację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poznaj nandb
	<ol>
		<li>Przejrzyj instrukcję17.</li>
		<li>Zapoznaj się z wbudowaną pomocą programu RStudio, aby uzyskać informacje o różnych funkcjach. Najbardziej prawdopodobną funkcją, która zostanie użyta, będzie brightness(). Wyświetl plik pomocy dla tej funkcji, wpisując ? brightness() na konsoli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie jasności
	<ol>
		<li>Powiedzmy, że na pulpicie znajduje się plik obrazu o nazwie img001.tif (zauważ, że "nandb" działa tylko z plikami TIFF). Można obliczyć jasność tego obrazu: 
		b <- jasność("~/Pulpit/img001.tif", tau = "auto")
		<ol>
			<li>Spowoduje to przypisanie jasności obrazu do zmiennej b w R. Tau = "auto" zapewnia, że obraz jest prawidłowo detrendowany przed obliczeniem jasności. Najczęstszą czynnością, którą należy wykonać z tego miejsca, jest obliczenie średniej lub mediany jasności obrazu. Można to zrobić, wpisując średnią(b) lub medianę(b). Można również zapisać obraz jasności na pulpicie za pomocą 
			ijtiff::write_tif(b, "~/Pulpit/whatever_img_name")</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powiedzmy, że na pulpicie znajduje się folder pełen obrazów, images_folder i trzeba obliczyć jasność tych obrazów i zapisać obrazy jasności jako pliki TIFF. Następnie zobacz ?brightness_folder(). Ta funkcja przetwarza cały folder jednocześnie: 
		brightness_folder("~/Pulpit/images_folder", tau = "auto") 
		Jest to szczególnie dobre dla tych, którzy mają oprogramowanie, które wolą od R, ponieważ wszystkie pliki są przetwarzane w jednym poleceniu, a następnie można kontynuować pracę z obrazami TIFF o jasności wyjściowej w wybranym przez siebie oprogramowaniu, czy to ImageJ14, Python czy coś innego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+fluorescence+lifetime+correlation+spectroscopy+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell.</a> Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Tramier, M., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+imaging+microscopy+for+homo-FRET+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).</li>
<li>Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein+aggregation+and+interaction+in+live+cells%3A+A+guide+to+number+and+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. , (2017).</li>
<li>Hur, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Brightness+from+Living+Cells+in+the+Presence+of+Photodepletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Amara, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+dimerizer+for+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).</li>
<li>Rollins, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-reversible+dimerization+system+for+controlling+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).</li>
<li>R: A Language and Environment for Statistical Computing. <a target="_blank" href="NULL">R Core</a>. , (2017).</li>
<li>RStudio: Integrated Development Environment for R. <a target="_blank" href="http://web.warwick.ac.uk/statsdept/useR-2011/abstracts/180111-allairejj.pdf">R Team</a>. , (2016).</li>
<li>Nolan, R. nandb R package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=nandb">https://CRAN.R-project.org/package=nandb</a> (2017).</li>
<li>Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysics+of+green+fluorescent+protein%3A+influence+of+the+key+amino+acids+at+positions+65%2C+203%2C+and+222%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222.</a> Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

N&B to technika wykrywania multimeryzacji przy użyciu komercyjnych skaningowych mikroskopów konfokalnych wyposażonych w detektory cyfrowe. To podejście jest dość atrakcyjne w porównaniu z jednopunktowymi FCS, FCCS i smFRET, ponieważ nie wymaga kalibracji, a obliczanie jasności jest proste i niezależne od stężenia6. Niezwykle ważne jest jednak, aby przed wykonaniem obliczeń jasności skorygować bielenie i długotrwałe wahania intensywności9; Niewielki wzrost jasności spowodowa...

Interakcje białko-białko IIn Vitro
Tradycyjnie krystalografia i eksperymenty z wykorzystaniem magnetycznego rezonansu jądrowego w połączeniu z kriomikroskopią elektronową (cryoEM) są technologiami wybieranymi do dokładnego opisania trójwymiarowej architektury białek oraz wnioskowania o ich funkcji poprzez analizę szczegółów strukturalnych o wysokiej rozdzielczości. Białka nie są jednak strukturami statycznymi i mogą ulegać różnorodnym zmianom konformacyjnym oraz wibracjom w czasie i przestrzeni. Właśnie dlatego informacje strukturalne z danych krystalograficznych lub cryoEM muszą być uzupełnione innymi technikami (np. symulacjami dynamiki molekularnej i technikami pojedynczych cząsteczek): funkcja białka jest powiązana z jego zmianami konformacyjnymi i oddziaływaniami, a informacje te nie są zawarte w strukturze statycznej. W celu zbadania dynamiki wewnątrzmolekularnej bardzo skuteczne są techniki oparte na transferze energii przez rezonans Förstera z pojedynczych cząsteczek (smFRET)1. Podejścia te pozwalają ocenić różne subpopulacje cząsteczek w złożonych środowiskach. Jest to niezwykle istotne, ponieważ zmiany te są szybkie i następują podczas pozyskiwania danych (tzn. w zakresie od nanosekund do sekund).
Do wykrywania i kwantyfikacji tych zmian powszechnie stosuje się dwa główne podejścia: analizę białek w roztworze oraz unieruchomienie powierzchniowe. W przypadku wykrywania oddziaływań międzycząsteczkowych, a w szczególności procesu dimeryzacji indukowanej przez ligandy, smFRET nie zawsze jest najlepszym narzędziem. Rzeczywiście, FRET zależy nie tylko odległości (≈10 nm), ale także od orientacji dwóch dipoli (donora i akceptora, χ2) oraz od nakładania się widma emisji donora z widmem absorpcji akceptora2, choć ten ostatni warunek może być mniej istotny, o ile badacz dobierze odpowiednią parę FRET. Szczególną wadą smFRET w badaniu homodimeryzacji jest znakowanie analizowanego białka: w przypadku hetero-smFRET dimeryzację można wykryć jedynie do 50% (tj. hetero-FRET pozwoli na wykrycie jedynie homodimerów donor-akceptor i akceptor-donor, ale nie donor-donor ani akceptor-akceptor, które stanowią pozostałe 50% dimerów). Inną alternatywą jest zastosowanie spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS) i jej pochodnych (FCCS, itp.3) w celu ustalenia stałych dyfuzji i stałych wiązania białek in vitro. Podejścia te również nie pozwalają na pełną kwantyfikację homodimeryzacji, ponieważ w FCS mierzy się stężenie i dyfuzję, a promień i współczynnik dyfuzji dyfundującej cząstki są w bardzo niewielkim stopniu zależne od masy cząsteczkowej; na przykład dziesięciokrotny wzrost masy cząsteczkowej spowoduje jedynie 2,15-krotną zmianę współczynnika dyfuzji4. W przypadku dwukolorowego FCS lub FCCS tylko 50% homodimerów zostanie wykrytych z tego samego powodu, o którym wspomniano powyżej. Najbardziej praktycznymi i ilościowymi metodami wykrywania homodimeryzacji in vitro i in vivo są homo-FRET5 oraz metoda liczby i jasności (number and brightness, N&amp;B)6. Biorąc pod uwagę, że homo-FRET wymaga specjalistycznej aparatury do odzyskania wartości anizotropii (tj. elementów optycznych/analizatorów do odzyskania polaryzacji równoległej i prostopadłej), N&amp;B jest tutaj przedstawione jako korzystna technika wykrywania homodimeryzacji i agregacji białek. Może być ona stosowana zarówno in vitro, jak i in vivo przy użyciu komercyjnego zestawu aparatury.
Liczba i jasność
Metoda N&amp;B została niedawno omówiona w przeglądzie literatury7. Przegląd ten skupiał się na zastosowaniu tej techniki w żywych komórkach. Warto tutaj powtórzyć formalizm matematyczny, ponieważ równania te zostaną zastosowane do danych zebranych in vitro. Najpierw należy zdefiniować niektóre pojęcia i wielkości matematyczne:
<ul>
	<li>Podmiot jest zbiorem cząsteczek, które są ze sobą związane.</li>
	<li>Jasność ε podmiotu to liczba emitowanych przez niego fotonów w jednostce czasu (na klatkę).</li>
	<li>n to liczba obecnych podmiotów.</li>
	<li>Dla danego piksela w serii obrazów, &lt;I&gt; jest jego średnią intensywnością, a σ2 to wariancja jego intensywności.</li>
</ul>
Następnie, przy zastosowaniu detektorów zliczających fotony i przy założeniu ruchomości obiektów oraz braku tła,
<img alt="Równanie równowagi statycznej N=〈I〉²/σ²; wzór do analizy wariancji w pomiarach danych." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
<img alt="Równanie równowagi statycznej B=σ^2/⟨I⟩=1+ε; koncepcja analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
gdzie N to liczba pozorna, a B to jasność pozorna. Przynosi to następujący wynik
<img alt="Mechanika statystyczna; wzór, wariancja; równanie; badanie, analiza, średnia, fluktuacje." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> 
<img alt="Wzór na równowagę statyczną, ϵ=σ²/⟨I⟩−1, równania wariancji i średniej, odniesienie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4">
Dalal i inni8 wykazano, że przy zastosowaniu aparatury analogowej konieczne są trzy człony korekcyjne: the czynnik Stło przesunięcieoraz i szum odczytu σ02Następnie, ponownie zakładając istnienie obiektów mobilnych,
<img alt="Wzór matematyczny dla liczenia fotonów z przesunięciem i wariancją w analizie spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> 
<img alt="Równanie ilustrujące wzór na wariancję statystyczną; schemat matematyczny do analizy danych." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6">
podawanie
<img alt="Równanie do obliczania parametrów statystycznych; wzór matematyczny, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 7"> 
<img alt="Równanie przedstawiające obliczanie odkształcenia materiału; wzór ε=(σ²−σ₀²)/(S(l)−offset)−1." src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 8">
Należy zauważyć, że powyższe równanie dla jest inne niż podane w pracy Dalala i wsp.8 or a późniejsza recenzja.7 W Dalal i wsp. ten S w mianowniku pominięto ze względu na literówkę i błąd ten powtórzono w recenzji. Powyższe równanie jest poprawne. Instrukcje pomiaru S, przesunięcie i σ02 - wraz z wyjaśnieniem ich znaczenia - zostały przedstawione przez Dalala i wsp.8
Jasność ε jest proporcjonalna do stanu oligomerycznego dyfundujących jednostek: ε będzie dwukrotnie większa dla dimerów niż dla monomerów, trzykrotnie większa dla trimerów niż dla monomerów, dwukrotnie większa dla heksamerów niż dla trimerów i tak dalej. W ten sposób, mierząc jasność ε, można określić ilość każdego typu multimeryzacji.
W przypadku obecności mieszaniny stanów oligomerycznych, analiza liczby i jasności nie pozwala na odzyskanie informacji o poszczególnych stanach oligomerycznych. Jest to ograniczenie tej techniki.
Algorytm detrend oraz oprogramowanie nandb
Znaczenie korekcji fotobleachingu było wcześniej podkreślane9. Fotobleaching nieuchronnie występuje podczas eksperymentów z mikroskopią świetlną w trybie poklatkowym, zarówno w żywych komórkach, jak i in vitro. W literaturze opisano wiele podejść do korekcji bleachingu7. Obecnie najlepszą metodą jest technika filtrowania wykładniczego z automatycznym doborem parametru detrendingu T. Jest ona zintegrowana z darmowym oprogramowaniem o otwartym kodzie źródłowym nandb9. W rzeczywistości oprogramowanie wymagające od użytkownika ręcznego wyboru parametru detrendingu może prowadzić do błędnych wyników, ponieważ wybór tego parametru będzie prawdopodobnie arbitralny i nieprawidłowy. Algorytm automatyczny analizuje dane i określa dla nich odpowiedni parametr bez konieczności interwencji użytkownika9. Nawet przy najlepszym wyborze parametru wygładzania, detrending ma swoje ograniczenia i działa dobrze jedynie przy wartościach fotobleachingu niższych niż 25%, co wykazano w symulacjach9. Co ciekawe, przy zastosowaniu automatycznej procedury detrendingu jej dokładność jest taka, że można pracować z niskimi wartościami jasności (nawet B &lt;1,01), a tym samym niskimi intensywnościami, i nadal zachować precyzję wystarczającą do kwantyfikacji homodimeryzacji.
Fotowybielanie powoduje również inny problem: obecność fotowybielonych fluoroforów w kompleksie multymerycznym. Sprawia to, że np. trimer wydaje się być dimerem, gdy jedna z trzech jednostek w trimerze nie wykazuje fluorescencji. Hur i Mueller10 pokazali, jak skorygować ten błąd, a korekta ta została również podkreślona w późniejszym przeglądzie7. Oprogramowanie nandb uwzględnia tę korektę9.
System FKBP12F36V
FKBP12F36V jest białkiem, które nie oligomeryzuje w sposób naturalny, lecz wiadomo, że dimeryzuje po dodaniu leku AP20187 (potocznie nazywanego ligandem dimeryzującym BB)1,12. Czyni to go idealnym przypadkiem testowym dla określania liczby i jasności: w przypadku znakowanego FKBP12F36V, po dodaniu BB powinno zostać zaobserwowane podwojenie stanu oligomerycznego.

<table><tbody><tr><td>Komórki pLysS RosettaTM (DE3)</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>Aldrich PubChem Identyfikator substancji 329824407</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Identyfikator substancji: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB kultura starterowa</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB podłoże</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Identyfikator substancji 329815691</td><td></td></tr><tr><td>bufor IMAC</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy wolne od EDTA&nbsp;</td><td>Żywica Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sefaroza niklowa</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 kolumna</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie obserwacyjne 8-dołkowe ze szklanym dnem</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Liczba i jasność to technika spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) bez kalibracji do wykrywania homooligomeryzacji białek. Może być stosowany przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektory cyfrowe. Protokół stosowania tej techniki in vitro przedstawiono za pomocą przypadku użycia, w którym można zobaczyć liczbę i jasność w celu dokładnego ilościowego określenia stanu oligomerycznego FKBP12F36V znakowanych mVenus przed i po dodaniu AP20187 leku dimeryzującego. Omówiono znaczenie stosowania prawidłowych parametrów akwizycji mikroskopowej oraz prawidłowych metod wstępnego przetwarzania i analizy danych. W szczególności podkreślono znaczenie wyboru korekcji fotowybielania. Ta niedroga metoda może być stosowana do badania interakcji białko-białko w wielu kontekstach biologicznych.

Usuwanie trendu i jasność monomerów
Po pozyskaniu danych można rozpocząć obliczenia jasności w celu określenia stanu oligomerycznego analizowanego białka w roztworze. Nawet jeśli efekt blaknięcia w roztworze może nie być tak drastyczny, jak ma to miejsce in vivo, ślad intensywności prawdopodobnie nadal nie będzie miał stacjonarnej średniej, co może wynikać z efektów fotofizycznych związanych z fluorofor...

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań przesiewowych leków, takie jak wyjaśnienie wpływu małocząsteczkowych inhibitorów na bardzo niskie stężenia interakcji białko-białko. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga kalibracji, można ją zastosować w dowolnym mikroskopie konfokalnym i wykorzystuje bardzo małe ilości znakowanych białek. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku rozwoju leków przeciwnowotworowych, inhibitorów małocząsteczkowych i różnych inhibitorów fuzji, ponieważ dostarcza ona ilościowych informacji na temat interakcji białko-białko.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje i agregacje białek in vitro, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak dynamika żywych białek komórkowych i interakcje komórka-komórka. Na początek przekształć komórki pLysS za pomocą wektora pET-22b zawierającego monomeryzowane ludzkie znaczniki FKBP12 i N-końcowe His6 i mVenus. Po tym, jak komórki dojdą do siebie po inkubacji i szoku cieplnym, połóż je na agarze LB uzupełnionym antybiotykami.Przenieś przekształcone kolonie do 100-mililitrowej kultury starterowej LB i hoduj przez 16 do 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Po inkubacji rozcieńczyć gęstą kulturę starterową od jednego do 100 w pożywce LB w dwóch partiach po 500 mililitrów. Następnie rosnąć przez dwie do trzech godzin do gęstości optycznej 600 nanometrów od 0,6 do 0,8.Po schłodzeniu kultur na lodzie indukuj produkcję białka za pomocą 250-mikromolowego IPTG. Hoduj kultury przez 16 do 20 godzin w temperaturze 21 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Następnie zbierać komórki przez odwirowanie w ilości 2 000 g przez 20 minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach buforu A IMAC uzupełnionego inhibitorami proteazy wolnymi od EDTA. Teraz poddaj ogniwa sonikacji przy 500 watach, 20 kilohercach i amplitudzie 40% przy dziewięciu sekundach włączenia, 11 sekund przerwy przez 15 minut na lodzie. Po sonikacji należy zebrać rozpuszczalny materiał przez odwirowanie w temperaturze 20 000 g przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś rozpuszczalny lizat do kolby stożkowej i dodaj dwa mililitry żywicy TALON. Pozostawić zawiesinę do inkubacji przez godzinę z obrotem 105 obr./min. Teraz zbierz żywicę i umyj ją 250 mililitrami buforu A IMAC, a następnie 500 mililitrami buforu IMAC B.Usuń białko znakowane His6 za pomocą buforu IMAC C. Wstrzyknij eluat do wstępnie zrównoważonej kolumny wykluczającej wielkość i zbierz pik FKBP12, który eluuje przy około 87,7 mililitrach.Oceń czystość białka za pomocą SDS-PAGE, a następnie połącz i zagęść zgodnie z wymaganiami. Aby skonfigurować wielodołkową matrycę płytkową, należy najpierw przygotować roztwór 100-nanomolowego oczyszczonego FKBP12 w tym samym buforze, który jest używany do chromatografii wykluczania wielkości. Sonikować i odwirowywać z szybkim wirowaniem 13 000 obr./min, aby zapobiec tworzeniu się agregatów.Teraz odpipetuj od 100 do 200 mikrolitrów rozcieńczonego białka do ośmiodołkowej komory obserwacyjnej ze szklanym dnem. Dodaj dimeryzator BB do końcowych stężeń 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 i 500 nanomolowych. Jako odniesienie przygotuj roztwór samego 100-nanomolowego mVenus, aby ocenić potencjalne efekty agregacji i wytrącania oraz odzyskać wartość jasności monomeru przy tych samych ustawieniach akwizycji.Można zastosować dowolny system konfokalny mikroskopu skaningowego światła wyposażony w detektory cyfrowe lub dobrze scharakteryzowane detektory analogowe i zdolny do utrzymania stałego czasu przebywania dla każdego uzyskanego piksela. Wybierz obiektyw zanurzeniowy z korekcją kołnierza przeznaczony do spektroskopii korelacji fluorescencji. Teraz dodaj kroplę wody do celu korekcyjnego zanurzenia w wodzie kołnierza.Zamontuj ośmiodołkową komorę obserwacyjną w scenie. Ustaw ścieżkę wiązki wzbudzenia, włączając laser 514 nm i ustawiając go na moc od 20 do 100 nanowatów na wyjściu obiektywu. Włącz jeden detektor HyD.Preferowane są detektory zdolne do zliczania fotonów. Wybierz okno emisji od 520 do 560 nanometrów. W trybie akwizycji użyj 16 na 16 pikseli.Ustaw czas przebywania pikseli tak, aby czas przebywania w klatce był dłuższy niż dyfuzja białek, a czas przebywania pikseli był znacznie krótszy. Odpowiadało to ustawieniu czasu przebywania na około 13 mikrosekund dla systemu użytego w tej demonstracji. Ustaw otwór w jednej jednostce Airy, aby uzyskać odpowiednią emisję około 545 nanometrów.Wybierz tryb akwizycji czasu xy i wybierz liczbę klatek, które mają zostać pobrane na akwizycję i dobrze. Teraz ustaw rozmiar piksela na około 120 nanometrów. Jeśli system jest wyposażony w tryb wysokiej przepustowości, wprowadź współrzędne każdego odwiertu i liczbę akwizycji na odwiert, aby zautomatyzować proces.Jeśli system jest wyposażony w system perfuzyjny, załaduj roztwór BB i zaprogramuj perfuzję tak, aby rozpoczynała się zaraz po 5 000. klatce, aby ocenić kinetykę dimeryzacji podczas uzyskiwania 10 000 obrazów. Wybierz odpowiednią studnię i skup się na rozwiązaniu. Następnie rozpocznij pobieranie i zapisz wynikowy stos obrazów w formacie TIFF.Uzyskano sekwencje 20 000 obrazów oczyszczonej FKBP12 mVenus w 100-nanometrowym roztworze, jak określono w sekcji protokołu. Intensywność pierwszej klatki jest pokazywana wraz ze średnim profilem intensywności obrazu zdetrendowanego. Pokazana jest również jasność bez i z płynnym filtrowaniem.Po pobraniu 10 000 ramek, homodimeryzator BB został dodany do roztworu podczas pozyskiwania. Analizowana była każda kolejna seria po 5 000 klatek. Średnia jasność pięć minut po dodaniu BB wynosiła 1,010, co oznacza dwukrotny wzrost, wskazujący na ściemniacz FKBP12.Kinetyka procesu wykazuje opóźnienie między dodaniem BB a pełną dimeryzacją FKBP12 wynoszące około dwóch minut. Kluczowym aspektem oceny interakcji białko-białko in vitro jest produkcja i oczyszczanie znakowanego białka. Upewnij się, że masz niewielkie ilości znakowanego białka, które Cię interesuje, i że Twoje białko nie agreguje się zgodnie z analizą.Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy lub spektroskopia korelacji fluorescencji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak stałe dysocjacji lub współczynniki dyfuzji. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biofizyki do szczegółowego zbadania interakcji białko-białko w żywych komórkach. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do oczyszczania białek może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak okulary ochronne, rękawice.

calibration-free-vitro-quantification-protein-homo-oligomerization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN).  Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Poznaj metodę kwantyfikacji homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu spektroskopii fluorystycznej. Technika ta umożliwia badanie interakcji białkowych przy niskich stężeniach z wykorzystaniem minimalnych ilości oznaczonych białek.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Przeglądaj więcej filmów