Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań przesiewowych leków, takie jak wyjaśnienie wpływu małocząsteczkowych inhibitorów na bardzo niskie stężenia interakcji białko-białko. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga kalibracji, można ją zastosować w dowolnym mikroskopie konfokalnym i wykorzystuje bardzo małe ilości znakowanych białek. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku rozwoju leków przeciwnowotworowych, inhibitorów małocząsteczkowych i różnych inhibitorów fuzji, ponieważ dostarcza ona ilościowych informacji na temat interakcji białko-białko.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje i agregacje białek in vitro, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak dynamika żywych białek komórkowych i interakcje komórka-komórka. Na początek przekształć komórki pLysS za pomocą wektora pET-22b zawierającego monomeryzowane ludzkie znaczniki FKBP12 i N-końcowe His6 i mVenus. Po tym, jak komórki dojdą do siebie po inkubacji i szoku cieplnym, połóż je na agarze LB uzupełnionym antybiotykami.

Przenieś przekształcone kolonie do 100-mililitrowej kultury starterowej LB i hoduj przez 16 do 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Po inkubacji rozcieńczyć gęstą kulturę starterową od jednego do 100 w pożywce LB w dwóch partiach po 500 mililitrów. Następnie rosnąć przez dwie do trzech godzin do gęstości optycznej 600 nanometrów od 0,6 do 0,8.

Po schłodzeniu kultur na lodzie indukuj produkcję białka za pomocą 250-mikromolowego IPTG. Hoduj kultury przez 16 do 20 godzin w temperaturze 21 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Następnie zbierać komórki przez odwirowanie w ilości 2 000 g przez 20 minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach buforu A IMAC uzupełnionego inhibitorami proteazy wolnymi od EDTA. Teraz poddaj ogniwa sonikacji przy 500 watach, 20 kilohercach i amplitudzie 40% przy dziewięciu sekundach włączenia, 11 sekund przerwy przez 15 minut na lodzie. Po sonikacji należy zebrać rozpuszczalny materiał przez odwirowanie w temperaturze 20 000 g przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś rozpuszczalny lizat do kolby stożkowej i dodaj dwa mililitry żywicy TALON. Pozostawić zawiesinę do inkubacji przez godzinę z obrotem 105 obr./min. Teraz zbierz żywicę i umyj ją 250 mililitrami buforu A IMAC, a następnie 500 mililitrami buforu IMAC B.Usuń białko znakowane His6 za pomocą buforu IMAC C. Wstrzyknij eluat do wstępnie zrównoważonej kolumny wykluczającej wielkość i zbierz pik FKBP12, który eluuje przy około 87,7 mililitrach.

Oceń czystość białka za pomocą SDS-PAGE, a następnie połącz i zagęść zgodnie z wymaganiami. Aby skonfigurować wielodołkową matrycę płytkową, należy najpierw przygotować roztwór 100-nanomolowego oczyszczonego FKBP12 w tym samym buforze, który jest używany do chromatografii wykluczania wielkości. Sonikować i odwirowywać z szybkim wirowaniem 13 000 obr./min, aby zapobiec tworzeniu się agregatów.

Teraz odpipetuj od 100 do 200 mikrolitrów rozcieńczonego białka do ośmiodołkowej komory obserwacyjnej ze szklanym dnem. Dodaj dimeryzator BB do końcowych stężeń 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 i 500 nanomolowych. Jako odniesienie przygotuj roztwór samego 100-nanomolowego mVenus, aby ocenić potencjalne efekty agregacji i wytrącania oraz odzyskać wartość jasności monomeru przy tych samych ustawieniach akwizycji.

Można zastosować dowolny system konfokalny mikroskopu skaningowego światła wyposażony w detektory cyfrowe lub dobrze scharakteryzowane detektory analogowe i zdolny do utrzymania stałego czasu przebywania dla każdego uzyskanego piksela. Wybierz obiektyw zanurzeniowy z korekcją kołnierza przeznaczony do spektroskopii korelacji fluorescencji. Teraz dodaj kroplę wody do celu korekcyjnego zanurzenia w wodzie kołnierza.

Zamontuj ośmiodołkową komorę obserwacyjną w scenie. Ustaw ścieżkę wiązki wzbudzenia, włączając laser 514 nm i ustawiając go na moc od 20 do 100 nanowatów na wyjściu obiektywu. Włącz jeden detektor HyD.

Preferowane są detektory zdolne do zliczania fotonów. Wybierz okno emisji od 520 do 560 nanometrów. W trybie akwizycji użyj 16 na 16 pikseli.

Ustaw czas przebywania pikseli tak, aby czas przebywania w klatce był dłuższy niż dyfuzja białek, a czas przebywania pikseli był znacznie krótszy. Odpowiadało to ustawieniu czasu przebywania na około 13 mikrosekund dla systemu użytego w tej demonstracji. Ustaw otwór w jednej jednostce Airy, aby uzyskać odpowiednią emisję około 545 nanometrów.

Wybierz tryb akwizycji czasu xy i wybierz liczbę klatek, które mają zostać pobrane na akwizycję i dobrze. Teraz ustaw rozmiar piksela na około 120 nanometrów. Jeśli system jest wyposażony w tryb wysokiej przepustowości, wprowadź współrzędne każdego odwiertu i liczbę akwizycji na odwiert, aby zautomatyzować proces.

Jeśli system jest wyposażony w system perfuzyjny, załaduj roztwór BB i zaprogramuj perfuzję tak, aby rozpoczynała się zaraz po 5 000. klatce, aby ocenić kinetykę dimeryzacji podczas uzyskiwania 10 000 obrazów. Wybierz odpowiednią studnię i skup się na rozwiązaniu. Następnie rozpocznij pobieranie i zapisz wynikowy stos obrazów w formacie TIFF.

Uzyskano sekwencje 20 000 obrazów oczyszczonej FKBP12 mVenus w 100-nanometrowym roztworze, jak określono w sekcji protokołu. Intensywność pierwszej klatki jest pokazywana wraz ze średnim profilem intensywności obrazu zdetrendowanego. Pokazana jest również jasność bez i z płynnym filtrowaniem.

Po pobraniu 10 000 ramek, homodimeryzator BB został dodany do roztworu podczas pozyskiwania. Analizowana była każda kolejna seria po 5 000 klatek. Średnia jasność pięć minut po dodaniu BB wynosiła 1,010, co oznacza dwukrotny wzrost, wskazujący na ściemniacz FKBP12.

Kinetyka procesu wykazuje opóźnienie między dodaniem BB a pełną dimeryzacją FKBP12 wynoszące około dwóch minut. Kluczowym aspektem oceny interakcji białko-białko in vitro jest produkcja i oczyszczanie znakowanego białka. Upewnij się, że masz niewielkie ilości znakowanego białka, które Cię interesuje, i że Twoje białko nie agreguje się zgodnie z analizą.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy lub spektroskopia korelacji fluorescencji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak stałe dysocjacji lub współczynniki dyfuzji. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biofizyki do szczegółowego zbadania interakcji białko-białko w żywych komórkach. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do oczyszczania białek może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak okulary ochronne, rękawice.