Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy
26 września 2019
Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.
Stałe ciśnienie w urządzeniu mocującym utrzymuje płuca w rozsądnie napompowanym stanie, generując histologiczną próbkę płuc odpowiednią do oceny łagodnej rozedmy płuc wywołanej dymem papierosowym. Główną zaletą tego modelu jest to, że może on naprawić wiele płuc w tym samym czasie przy użyciu tego samego stałego ciśnienia bez zapadania się płuc lub opróżniania. Procedurę zademonstruje Naoko Arano, doktorantka z mojego laboratorium.
Po potwierdzeniu braku reakcji na ruch odruchowy wykonaj nacięcie w skórze i tkance mięśniowej wzdłuż linii przyśrodkowej myszy, celując w obszar głowowy i przeciąć bocznie, aby stworzyć szerszą przestrzeń roboczą. Po odsłonięciu warstwy przepony nakłuj tkankę kleszczami i otwórz przestrzeń piersiową. Przetnij obszar mostka, umożliwiając wizualizację płuc i serca.
I przetnij lewy przedsionek i prawą komorę. Włóż kaniulę o rozmiarze 24 podłączoną do pompy perfuzyjnej do obszaru prawej komory i skieruj kaniulę do obszaru głowowego, aż dotrze do tętnicy płucnej. Następnie włącz pompę i perfunduj tkankę około 200 mililitrami PBS przez godzinę, aż cała tkanka płucna zmieni kolor na biały.
Pod koniec perfuzji przeciąć tkankę łączną otaczającą tchawicę, płuca i serce, a następnie użyć szwu, aby związać prawe oskrzela główne. Następnie należy pobrać wszystkie poszczególne płaty prawego płuca i umieścić serce i płaty lewego płuca w pojedynczych 10-mililitrowych strzykawkach zawierających odpowiedni utrwalacz. Wycofać tłok, wytwarzając podciśnienie w strzykawce w celu napełnienia płuc i wyjąć płuco ze strzykawki.
Włóż kaniulę o rozmiarze 20 do tchawicy i użyj szwu, aby zabezpieczyć kaniulę na miejscu. Podłącz jednomililitrową strzykawkę wypełnioną utrwalaczem do kaniuli i napełnij płuco dodatkowym utrwalaczem, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Upewnij się, że miejsce wprowadzenia zostało zabezpieczone, aby zapobiec oderwaniu się próbki płuc od deski płucnej podczas stabilizacji.
Następnie przenieś tkankę do ciśnieniowego sprzętu do utrwalania płuc, usuwając próbkę i wiążąc tchawicę węzłem pod koniec okresu utrwalania. Dolny element ciśnieniowego urządzenia do stabilizacji płuc, do którego wprowadzana jest próbka płuc, jest połączony za pomocą kaniuli o rozmiarze 20 z końcówką przepływu formaliny za pomocą trójdrożnego kurka. Ciśnienie jest wytwarzane z różnych poziomów powierzchni utrwalacza między dolną i górną komorą.
Różnica ciśnień wynosi 25 centymetrów wody, ale pokrętło regulacji wysokości może być użyte do regulacji ciśnienia do od 25 do 30 centymetrów wody. Pompa łączy dolny i górny pojemnik, zachowując 25-centymetrową różnicę w wysokości powierzchni utrwalacza i kieruje przepływem środka. Po 48 godzinach od utrwalenia płuca myszy z nokautem SMP30 wystawione na działanie otaczającego powietrza nie wykazują wyraźnego powiększenia przestrzeni powietrznej.
Znaczne powiększenie przestrzeni powietrznej i zniszczenie ścian wyrostka zębodołowego obserwuje się jednak u myszy z nokautem SMP30 narażonych na przewlekły dym papierosowy. Ponadto średnia liniowa penetracja i indeks destrukcyjny próbek płuc są znacznie wyższe u myszy narażonych na dym SMP30 niż u zwierząt narażonych na działanie powietrza. Nasze laboratorium używa 10% formaliny, ale naukowcy mogą używać innych środków utrwalających zgodnie ze swoimi potrzebami eksperymentalnymi.
Jak już informowaliśmy, za pomocą zademonstrowanego systemu fiksacji, próbki płuc można pobrać z różnych modeli rozedmy płuc myszy w celu ich oceny morfometrycznej. Ponieważ środki utrwalające mogą być niebezpieczne, zawsze noś odpowiedni sprzęt ochronny dla personelu i pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę utrwalania płuc, która zapewnia stabilne warunki do oceny histologicznej preparatów płuc z mysiego modelu rozedmy. Technika ta umożliwia jednoczesne utrwalenie wielu płuc bez ich zapadania się lub odpowietrzenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Histologia
Wstęp
- Rozedma jest chorobą płuc często wywoływaną przez dym tytoniowy.
- Ocena histologiczna jest kluczowa dla zrozumienia patologii płuc.
- Utrzymanie nadmuchania płuc podczas utrwalania jest niezbędne dla dokładnej oceny.
- Niniejszy protokół odnosi się do wyzwań związanych z technikami utrwalania płuc.
Cel badania
- Przedstawienie wiarygodnej metody utrwalania płuc.
- Ułatwienie oceny preparatów płuc w badaniach naukowych.
- Poprawa spójności w analizie histologicznej modeli rozedmy.
Zastosowane metody
- Stosowanie urządzenia do unieruchomienia zapewniającego stały nacisk.
- Nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej myszy w celu uzyskania dostępu do jamy klatki piersiowej.
- Przebicie przepony w celu otwarcia przestrzeni klatki piersiowej.
- Wizualizacja płuc i serca w celu pobrania próbek.
Główne wyniki
- Skuteczne utrzymanie nadmuchania płuc podczas utrwalania.
- Możliwość jednoczesnego utrwalenia wielu płuc.
- Stabilne preparaty histologiczne odpowiednie do oceny.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez studenta studiów magisterskich.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę utrwalania płuc.
- Poprawia on jakość ocen histologicznych w badaniach.
- Technikę tę można zastosować w różnych badaniach dotyczących patologii płuc.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Spójna fiksacja płuc pod stałym ciśnieniem rozwiązuje krytyczny problem w przedklinicznych modelach chorób układu oddechowego, umożliwiając powtarzalną ocenę histologiczną rozedmy u myszy. Metoda ta wspiera wiarygodną analizę morfometryczną, redukując zmienność i zwiększając pewność predykcyjną w wczesnej fazie walidacji celów terapeutycznych w badaniach nad POChP. Możliwość jednoczesnego przetwarzania wielu próbek usprawnia badania porównawcze i wspiera podejmowanie trafnych decyzji w zakresie selekcji portfolio projektów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia standaryzowaną ocenę morfometryczną stopnia zaawansowania rozedmy w modelach mysich.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych celów terapeutycznych poprzez zapewnienie powtarzalnej architektury tkankowej.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez minimalizację artefaktów wywołanych utrwalaniem.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wiązaniu punktów końcowych histologicznych z hipotezami mechanistycznymi.
Przesiew i opracowywanie testu
- Przygotowuje zwalidowane preparaty płuc do późniejszych ilościowych analiz histologicznych.
- Zapewnia powtarzalność i porównywalność między kohortami eksperymentalnymi.
- Umożliwia skalowalne przetwarzanie wielu próbek w identycznych warunkach.
- Pozwala na wiarygodną ocenę wpływu związków na strukturę płuc w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przedkliniczne modele patologii płuc do punktów końcowych istotnych dla choroby w badaniach translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez standaryzację przygotowania tkanek.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia artefaktów, które mogłyby zaburzyć ocenę biomarkerów lub skuteczności.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wiarygodne dane histologiczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda utrwalania pod stałym ciśnieniem integruje się z wczesnym etapem odkrywania i walidacji przedklinicznej, wspierając zarówno walidację celu, jak i identyfikację związku wiodącego w modelach chorób układu oddechowego.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia wiarygodną architekturę tkanek do weryfikacji hipotez i analizy szlaków w modelach rozedmy.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników histologicznych do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia pomiary morfometryczne, takie jak średni przerwa liniowa (mean linear intercept) i indeks destrukcji, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Wspiera uzgodnienie wyników przedklinicznych z kliniczną patologią rozedmy, gdy jest to właściwe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zstandaryzowaną metodę utrwalania, którą można dostosować do różnych modeli chorób płuc u myszy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i walidację celu poprzez minimalizację zmienności utrwalania.
- Wartość operacyjna: Zwiększa przepustowość i standaryzację dzięki umożliwieniu jednoczesnego utrwalania wielu preparatów.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wspieranie wiarygodnych punktów końcowych histologicznych.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację programów chorób układu oddechowego z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o rzetelne dane tkankowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu zabiegów chirurgicznych u myszy oraz w obchodzeniu się z tkanką płucną.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu do fiksacji, zdolnego do utrzymania stałego ciśnienia.
- Wymaga standaryzacji parametrów fiksacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość dostosowania do różnych utrwalaczy w zależności od wymagań eksperymentalnych.
- Konieczność przestrzegania protokołów bezpieczeństwa podczas pracy z niebezpiecznymi czynnikami utrwalającymi.
