Name: Przygotowanie peptydu argininowo-glicynowego asparaginianu (RGD) znakowanego 68Ga do angiogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę przygotowania peptydów RGD znakowanych izotopem galu-68 do badań angiogenezy i obrazowania onkologicznego. Protokół obejmuje elucję, oczyszczanie chromatograficzne oraz ocenę biologiczną analogów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Program Badań i Rozwoju Nuklearnego Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) grant ufundowany przez rząd koreański (nr 2017M2A2A6A02019904).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt badawczych zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Badań nad Zwierzętami Koreańskiego Instytutu Nauk Radiologicznych i Medycznych. Wszystkie odczynniki i rozpuszczalniki zostały zakupione i używane bez dalszego oczyszczania. Peptydy NOTA-RGD przygotowano zgodnie z metodami literaturowymi15.
UWAGA: 68Ga emituje zarówno promieniowanie pozytonowe, jak i gamma. Wszystkie eksperymenty, w tym bezpośredni lub pośredni kontakt z substancjami promieniotwórczymi, muszą być przeprowadzane wyłącznie przez przeszkolony i uprawniony personel. Podczas obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi należy używać odpowiedniego sprzętu ochronnego, osłony, plakietki i pierścieni dozymetru promieniowania oraz miernika pomiarowego.
1. Radioznakowanie peptydów RGD za pomocą 68GaCl3
Uwaga: 68Ga (t1/2 = 68 min, β+ = 89%, a EC = 11%) uzyskano z generatora 68Ga/68Ge.
<ol>
	<li>Eluować 68GaCl3 z generatora za pomocą 4 ml 0,05 M HCl.</li>
	<li>Przedmywać azotem gazowym w temperaturze 80 °C przez 30 minut w celu wysuszenia 68GaCl3 (333 kBq, 1 ml) w fiolce reakcyjnej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Dodać roztwór peptydu RGD (100 μg) w 1 M octanie sodu (100 μl, pH 5-6) do fiolki reakcyjnej zawierającej 68GaCl3 z kroku 1.2.</li>
	<li>Podgrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 80 °C przez 5 minut. Następnie ostudź do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Oczyść surowy produkt za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Użyj następującego systemu: kolumna C-18, natężenie przepływu 0,5 ml/min, nachylenie gradientu acetonitrylu 1,17%/min (5% - 40% w 30 min) i składniki elucji: A = 0,1% kwas trifluorooctowy (TFA) w acetonitrylu, B = 0,1% TFA w wodzie. 
	UWAGA: HPLC jest wyposażony w detektor matrycowy fotodiodowy i detektor radioaktywności. Peptyd 68Ga-RGD zebrano w czasie retencji wynoszącym 12,5 minuty (<silna klasa="xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Oczyść powstały peptyd 68Ga-RGD za pomocą systemu ekstrakcji do fazy stałej.
	<ol>
		<li>Przepuścić roztwór przez wkład C18 z odwróconymi fazami i przemyć 2 ml soli fizjologicznej.</li>
		<li>Elute 68Ga-RGD-peptyd z 0,7 ml 95% etanolu. Usunąć rozpuszczalnik w temperaturze 80 °C w gazowym azocie przez 20 minut i rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przed użyciem.</li>
		<li>Przefiltrować produkt znakowany radioaktywnie przez sterylny filtr 0,22 μm i sporządzić w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić wydajność radiochemiczną metodą chromatografii radioaktywnej (TLC).
	<ol>
		<li>Umieścić 1 μl na natychmiastowej płytce do chromatografii cienkowarstwowej (ITLC, 10 cm długości). Rozwinąć płytkę w komorze zawierającej eluent (wodny roztwór 0,1 M kwasu cytrynowego, pH 5,0) w odległości 9 cm od plamki. 
		UWAGA: Współczynnik retencji dla peptydu 68Ga-RGD wynosi 0, a współczynnik retencji dla nieprzereagowanego 68Ga3+ wynosi 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć końcową aktywność właściwą ze stosunku promieniotwórczości odpowiadającej promieniotwórczości niepromieniowej jako MBq/nmol. 
	UWAGA: Po wstrzyknięciu 100 μl sformułowanego peptydu 68Ga-RGD do HPLC, ilość składnika nieradioaktywnego obliczono na podstawie standardowej krzywej kalibracyjnej przy użyciu nieradioaktywnego peptydu Ga-RGD.</li>
</ol>
2. Wychwyt komórkowy in vitro
Uwaga: Ludzkie komórki glejaka Uppsala 87 Malignant Glioma (U87MG) zostały wyhodowane w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny-streptomycyny. Komórki hodowano na szalkach o średnicy 150 mm w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Komórki pobrano lub podzielono przez trypsynizację: 0,25% (w/v) trypsyny i 0,02% (w/v) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 min.
<ol>
	<li>Umieść komórki U87MG w 6-dołkowych płytkach o gęstości 1 x 106 komórek / dołek.</li>
	<li>Inkubować komórki z peptydem 68Ga-RGD (111 kBq) w temperaturze 37 °C przez 30, 60, 90 i 120 minut. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Umyj komórki 2x 2 ml PBS i zbierz przez trypsynizację. Stosować 0,25% (w/v) trypsyny i 0,02% (w/v) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek (500 μl) i odmierzyć w liczniku γ.</li>
	<li>Obliczyć procentowy wychwyt związku przez komórki w procentach (liczby w komórkach/całkowita liczba).</li>
</ol>
3. Stabilność surowicy in vitro
<ol>
	<li>Dodaj 500 μl świeżo przygotowanej surowicy mysiej, 500 μl surowicy ludzkiej i 500 μl PBS. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Ocena za pomocą ITLC w określonych odstępach czasu (30, 60, 90 i 120 min). Umieścić 1 - 2 μL podwielokrotności mieszaniny na płytce ITLC (faza ruchoma: 0,1 M kwas cytrynowy). Rozwinąć płytkę jak w kroku 1.7. 
	UWAGA: Oczekuje się, że 68Ga3+ będzie przemieszczał się wraz z czołem rozpuszczalnika, podczas gdy znakowany związek pozostanie w punkcie początkowym.</li>
</ol>
4. Oznaczanie lipofilowości
<ol>
	<li>Dodać 68peptydów Ga-RGD (3,7 MBq, 3,7 μL) do układu oktanol-PBS (1:1, v/v, łącznie 1 ml).</li>
	<li>Mieszać fiolki energicznie przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać 100 μl próbek z każdej warstwy i zmierzyć radioaktywność za pomocą licznika γ. Podana wartość logarytmu P opiera się na średniej z trzech próbek.</li>
</ol>
5. Model guza
Uwaga: Do tego badania użyto nagich myszy BALB/c (6 - 8 tygodni, samica, n = 23). Myszy wykorzystano następnie do badań PET (n = 3) i biodystrybucji (n = 20), gdy objętość guza osiągnęła 200 - 300 mm3 3 (1 - 2 tygodnie po implantacji).
<ol>
	<li>Załaduj komórki nowotworowe do strzykawek insulinowych o pojemności 28 G, 1/2 cala.</li>
	<li>Wstrzyknij komórki U87MG (5 x 106) w 100 μl PBS w obszar lewego ramienia.</li>
	<li>Znieczulij mysz 2% izofluranem w gazowym tlenie podczas wstrzykiwania komórek.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że mysz została znieczulona przez utratę odruchu wycofania pedału po uszczypnięciu kleszczami między palcami prawej tylnej stopy. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja in vivo integryny αvβ3 za pomocą PET
<ol>
	<li>Znieczulij myszy 2% izofluranem w tlenie.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że mysz została znieczulona przez utratę odruchu wycofania pedału po uszczypnięciu kleszczami między palcami prawej tylnej stopy. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść głowicę na środku suwnicy PET.</li>
	<li>Podawać dożylnie roztwór peptydu 68Ga-RGD (7,4 MBq, 200 μL) do mysiego modelu ksenoprzeszczepu przez żyłę ogonową przez 1 minutę.</li>
	<li>W tym samym czasie wykonaj skanowanie PET w trybie listy (skanowanie dynamiczne) przez 150 min. 
	UWAGA: Surowe dane PET zostały zrekonstruowane w zdefiniowanym przez użytkownika przedziale czasowym (tj. co 30 minut). Po badaniu PET wykonano badanie mikrotomografią komputerową (CT) (50 kVp promieniowania rentgenowskiego, 0,16 mA) w celu korekcji tłumienia.</li>
</ol>
7. Biodystrybucja ex vivo
<ol>
	<li>Wstrzyknąć peptyd 68Ga-RGD (0,37 MBq, 200 μL) do żyły ogonowej mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Podczas wstrzyknięć znieczulić mysz 2% izofluranem w gazowym tlenie. 
	Uwaga: Nagie myszy BALB/c, jak opisano w sekcji 5, podzielono na cztery grupy i uśmiercono w różnych punktach czasowych (n = 5 na grupę).</li>
	<li>Obudź myszy natychmiast po podaniu peptydu 68Ga-RGD i poświęć je po 30, 60, 90 i 120 minutach po wstrzyknięciu z eutanazją dwutlenku węgla. 
	UWAGA: Interesujące tkanki zostały pobrane. Wybrane cele to krew, mięśnie, serce, płuca, wątroba, śledziona, żołądek, jelita, nerki, kości i guz.</li>
	<li>Zważyć tkankę i zmierzyć radioaktywność za pomocą licznika γ. 
	UWAGA: Wyniki wyrażono jako procentową dawkę wstrzykniętej na gram tkanki (% ID/g).</li>
</ol>

<ol><li>Friedlander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Two+Angiogenic+Pathways+by+Distinct+alpha+v+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins.</a> Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).</li>
<li>Janssen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Targeting+with+Radiolabeled+alpha+v+beta+3+Integrin+Binding+Peptides+in+a+Nude+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model.</a> Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).</li>
<li>Kok, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+%CE%B1v%CE%B23+integrin+directed+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).</li>
<li>Garanger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+multifunctional+molecular+conjugate+vector+for+targeting%2C+imaging%2C+and+therapy+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors.</a> Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).</li>
<li>Dijkgraaf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+%CE%B1v%CE%B23+integrin+expression+in+tumours+with+68Ga-labelled+mono-%2C+di-+and+tetrameric+RGD+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((68Ga-labeled+cyclic+RGD+dimers+with+Gly3and+PEG4linkers%3A+Promising+agents+for+tumor+integrin+%CE%B1v%CE%B23+PET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).</li>
<li>Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((68Ga-labeled+multimeric+RGD+peptides+for+microPET+imaging+of+integrin+%CE%B1v%CE%B23expression%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomerism+and+solution+dynamics+of+90Y-labeled+DTPA-biomolecule+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).</li>
<li>Haubner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylated+RGD-containing+peptides%3A+tracer+for+tumor+targeting+and+angiogenesis+imaging+with+improved+biokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics.</a> Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).</li>
<li>Sivolapenko, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+metastatic+melanoma+utilising+a+technetium-99m+labelled+RGD-containing+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Euroean+Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide.</a> Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).</li>
<li>Haubner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Imaging+of+%CE%B1v%CE%B23+Integrin+Expression+Using+18+F-labeled+RGD-containing+Glycopeptide+and+Positron+Emission+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography.</a> Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).</li>
<li>Clarke, E. T., Martell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilities+of+trivalent+metal+ion+complexes+of+the+tetraacetate+derivatives+of+12-%2C+13-+and+14-membered+tetraazamacrocycles%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles.</a> Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).</li>
<li>Clarke, E. T., Martell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilities+of+the+Fe%28III%29%2C+Ga%28III%29+and+In%28III%29+chelates+of+N%2CN%E2%80%B2%2CN%E2%80%B3-triazacyclononanetriacetic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid.</a> Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).</li>
<li>Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((68Ga-labeled+radiopharmaceuticals+for+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography.</a> Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).</li>
<li>Shin, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Preliminary+Evaluation+of+68Ga-NOTA-Biphenyl-c%28RGDyK%29+for+the+Quantification+of+Integrin+%CE%B1v%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Korean+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3.</a> Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).</li>
<li>Cai, W., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis.</a> Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu wprowadziliśmy protokół przygotowania radiopeptydu ukierunkowanego na integrynę αvβ3 oraz jej ocenę biologiczną. Tradycyjne opracowywanie leków wiąże się ze skomplikowaną procedurą. Wymaga to dużej ilości materiału referencyjnego i stosunkowo długiego czasu oceny. Chociaż proponowana metodyka nie może zastąpić delikatnego procesu oceny, system ten może być stosowany do celów przesiewowych. Proponowany system znacznie skróciłby czas i obniżył koszty.
W...

Angiogeneza to proces biologiczny, który charakteryzuje się rozwojem nowych naczyń krwionośnych. Wśród wielu czynników angiogenetycznych, integryna αvβ3 jest związana z inwazyjnością, ponieważ integryna jest silnie eksprymowana w angiogennych naczyniach nowotworowych, ale nie występuje w normalnych tkankach1.
Znakowane radioaktywnie peptydy wiążące receptory z domeną asparaginianu glicyny argininy (RGD), która ma wysokie powinowactwo do receptorów integryny αvβ 3, są uważane za obiecujące środki do obrazowania angiogenezy2,3,4,5,6,7. Stworzono kilka radiofarmaceutyków dla PET, a ich właściwości biologiczne zostały potwierdzone w różnych modelach zwierzęcych8,9,10,11. Jeśli chodzi o radionuklidy, 68Ga ma kilka zalet w porównaniu z innymi izotopami promieniotwórczymi. Po pierwsze, jest łatwo dostępny dla użytkowników i jest korzystny ekonomicznie, ponieważ cyklotron nie jest wymagany. Po drugie, 68radiofarmaceutyków na bazie Ga zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną w porównaniu z tomografią komputerową z emisją pojedynczych fotonów (SPECT), co pozwala na dokładniejszą kwantyfikację. Wreszcie, okres półtrwania wynoszący 67,71 minut wynoszący 68Ga może być wystarczający do przygotowania małych peptydów lub białek.
Aby wytworzyć stabilny kompleks z 68Ga, opracowano wiele chelatorów. Reprezentatywnymi chelatorami są: kwas 1,4,8,11-tetraazacyklotetradekantetraoctowy (TETA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowy (DOTA), kwas 1,4,7-triazacyklonono-1,4,7-trioctowy (NOTA), kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) i kwas N,N'-di(2-hydroksybenzylo)etylenodiamino-N,N'-diacenowy (HBED). Doniesiono, że NOTA tworzy wysoce stabilny kompleks o 68Ga (stała stabilności logarytmicznej 30,98)12,13,14.
Celem niniejszego badania jest dostarczenie zwięzłego protokołu do opracowania nowego radiopeptydu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Jako przykład przygotowujemy 68peptydów RGD znakowanych Ga i przedstawiamy metody biologicznej oceny tych analogów w modelu ksenoprzeszczepu.

<table><tbody><tr><td>68Ga/68Ge generator</td><td>ITG</td> <td>Company-10</td> <td>mCi&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodoru</td><td>Sigma-aldrich</td><td>84429</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>C18 wkład z odwróconymi fazami</td><td>Wody</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>0,22-&mu; m sterylny filtr</td><td>Milllipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Skaner Radio-TLC</td><td>Bioscan</td><td>AR2000</td><td></td></tr><tr><td>ITLC papier</td><td>Agilent</td><td>SGI001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters-Waters</td><td></td> <td>1525 system zawierający pompę binarną, matrycę fotodiodową (Waters 2998), detektor radioaktywności (Raytest, Gabi)</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>J.T. Baker</td><td>14-650-359</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle media&nbsp;</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Termo fisher scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>T175 kolby&nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS431080</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-counter</td><td>Perkin</td> Elmer-1480 <td></td><td>Wizard 3</td></tr><tr><td>Insunlin</td><td>Becton Dickinson</td><td>326105</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Synringe</td><td>Harvard Aparatura</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>mikro-PET/CT</td><td>Siemens Inveon</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie peptydu argininowo-glicynowego asparaginianu (rgd) znakowanego 68ga do angiogenezy

Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate (RGD)-peptide for Angiogenesis

Integrynaα vβ3 jest heterodimeryczną cząsteczką adhezyjną biorącą udział w migracji komórek nowotworowych i angiogenezie. Integryna ulega nadekspresji w angiogennych komórkach śródbłonka guza, gdzie zwykle ma niskie stężenie. Ta specyficzna ekspresja αvβ3 sprawia, że jest to ważny biomarker dla leków antyangiogennych i obrazowych. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) jako metoda obrazowania funkcjonalnego dostarcza informacji o zmianach biochemicznych i fizjologicznych in vivo, ze względu na wyjątkową wysoką czułość w skali nanomolowej. W związku z tym radiofarmaceutyki PET na bazie radiometali spotkały się z dużym zainteresowaniem ze względu na nieinwazyjną ocenę ilościową angiogenezy guza. W artykule przedstawiono ogólnoustrojowy protokół przygotowania nowego peptydu znakowanego radiometalem do oceny angiogenezy. Protokół ten zawiera informacje o wiarygodności radiochemicznej, lipofilowości, wychwytie komórek, stabilności surowicy i właściwościach farmakokinetycznych . Peptyd 68Ga-RGD jest jednym z reprezentatywnych ligandów PET w kierunku integryny αvβ3. W tym miejscu przedstawiamy protokół przygotowania peptydu 68Ga-RGD i oceny jego skuteczności biologicznej.

Chelatowanie 68GaCl3 z peptydem NOTA-RGD przebiegło sprawnie, a wydajność znakowania radiochemicznego wyniosła 99%. Zanieczyszczenia reakcji zostały skutecznie usunięte, co przedstawiono na Rysunku 2. Czystość radiochemiczna 68Ga-RGD-peptydu była wyższa niż 99%, a aktywność właściwa na koniec syntezy wynosiła 90 - 130 MBq/nmol (Rysunek 3).
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

Integrynaα vβ3 jest rodzajem białka adhezyjnego, które ulega silnej ekspresji na aktywowanych komórkach śródbłonka przechodzących angiogenezę. W związku z tym ocena integralności integryny jest bardzo interesująca w onkologii. W tym miejscu przedstawiamy metodę otrzymywania 68radiopeptydów znakowanych Ga oraz metodę oceny jej skuteczności biologicznej.

Przygotowanie peptydu argininowo-glicynowego asparaginianu (RGD) znakowanego 68Ga do angiogenezy

The &#945;v&#946;3 integrin is a heterodimeric adhesion molecule involved in tumor cell migration and angiogenesis. The integrin is overexpressed in ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące przygotowania peptydu RGD znakowanego galem 68 oraz metody biologicznej oceny jego analogów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty protokół systemowy do opracowania nowego peptydu znakowanego radiometalem. Procedurę zademonstruje Ki-Hye Jung, post-doc z naszego instytutu.Zacznij od użycia 0,5 molowego kwasu solnego do wymycia znakowanego radioaktywnie trichlorku galu z radioznakowanego generatora galu germanu. Przedmuchnąć związek w pięciomililitrowej fiolce reakcyjnej azotem gazowym o temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnie dodaje się 100 mikrogramów argininy, octanu glicyny lub peptydu RGD w jednym molowym octanie sodu do wysuszonego związku.Podgrzej mieszaninę reakcyjną w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej. Aby oczyścić surowy produkt za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, należy dodać roztwór do kolumny C18 i przepuścić roztwór przez wkład C18 z odwróconymi fazami. Umyj wkład dwoma mililitrami soli fizjologicznej i wymyj znakowany radioaktywnie peptyd 0,7 mililitra 95% etanolu, a następnie usuń rozpuszcz

preparing-68ga-labeled-arginine-glycine-aspartate-rgd-peptide-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Aby zademonstrować obrazowanie molekularne raka MR za pomocą środka kontrastowego MRI z małym peptydem specyficznym dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza w modelu raka prostaty u myszy.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Przedstawiono tu procedurę izolacji EOB-DTPA i późniejszej kompleksacji z naturalnym Ga(III) i 68Ga, a także dokładną analizę wszystkich związków i badania nad skutecznością znakowania, stabilnością in vitro i współczynnikiem dystrybucji n-oktanol/woda w radioznakowanym kompleksie.

Badania kompleksu Ga(III) EOB-DTPA i jego analogu znakowanego radioizotopowo o masie 68Ga

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Przedstawiono protokół syntezy guanidyn modyfikowanych alkilem oparty na użyciu odpowiednich prekursorów.

Modyfikacja i funkcjonalizacja grupy guanidyny przez prekursory dostosowane do potrzeb klienta

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

To badanie opracowało nieinwazyjną metodę oceny rozkładu programowanego ligandu śmierci 1 w całym ciele, na podstawie obrazowania tomograficznego emisji pozytonów antagonisty D-dodekapeptydu [68Ga]. Technika ta ma przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią i poprawia skuteczność identyfikacji odpowiednich pacjentów, którzy odniosą korzyści z terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne.

Opracowanie znacznika PET znakowanego 68galem peptydu D do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1

To badanie opisuje zautomatyzowany proces produkcji [68Ga]Ga-3BP-3940 za pomocą syntezatora GAIA V2, do obrazowania PET białka aktywującego fibroblasty. Przedstawiono również wyniki badań kontroli jakości przeprowadzonych na trzech seriach testowych.

Automatyczne przygotowanie [68Ga]GA-3BP-3940 na module syntezy do obrazowania PET mikrośrodowiska guza

Poznaj metodę przygotowania peptydów RGD znakowanych izotopem galu-68 do badań angiogenezy i obrazowania onkologicznego. Protokół obejmuje elucję, oczyszczanie chromatograficzne oraz ocenę biologiczną analogów.

Przygotowanie peptydu argininowo-glicynowego asparaginianu (RGD) znakowanego ⁶⁸Ga do angiogenezy

Przeglądaj więcej filmów