Name: Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę kontroli ekspresji genów poprzez przekierowanie maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny i odwracalny. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regulacji genów w komórkach mysich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratoriów Hathaway i Jin za ich pomocne dyskusje. Autorzy dziękują również Danowi Cronie i Ianowi MacDonaldowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były częściowo wspierane przez Granta R01GM118653 z Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych (dla N.A.H.); oraz przez Granty R01GM122749, R01CA218600 i R01HD088626 z Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych (do J.J.). Prace te były również wspierane przez poziom 3 i grant studencki z UNC Eshelman Institute for Innovation (odpowiednio dla N.A.H i A.M.C). Dodatkowe fundusze z GM007092 T-32 (dla A.M.C.) wsparły te prace. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano w UNC Flow Cytometry Core Facility, finansowanym z grantu P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant dla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

1) Hodowla linii komórkowej do produkcji lentiwirusa
<ol>
	<li>Hoduj świeże, niskopasażowe (mniej niż pasaż 30) ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK) 293T w zmodyfikowanym podłożu bazowym Eagle's Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy Dulbecco uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 mM HEPES, 1x aminokwasami endogennymi (NEAA), Pen/Strep, 2-merkaptoenthanolem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Dziel komórki co 3 - 5 dni i zanim staną się > 95% zlewające.</li>
	<li>Pasaż komórek 293T HEK z 18 x 106 na 15-centymetrową płytkę (jedna 15-centymetrowa płytka na każdy wyprodukowany wirus).
	<ol>
		<li>W przypadku formatu 15 cm odessaj stare podłoże, dodaj 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odessaj PBS i dodaj 3 ml 0,05% trypsyny. Inkubować komórki w trypsynie przez 8 minut w temperaturze 37 °C, kołysząc i stukając w komórki w połowie inkubacji. 
		UWAGA: Celem tego kroku jest wprowadzenie komórek do zawiesiny jednokomórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy następnego dnia komórki osiągną zbieżność 60% - 80%, wykonaj transfekcję polietyleneniminy (PEI) z 13,5 μg plazmidu psPAX2, 4,5 μg plazmidu pMD2.G, 18 μg wektora dostarczania zgodnego z lentiwirusem z genem będącym przedmiotem zainteresowania (tj. FKBP-Gal4), 108 μl PEI i 1,8 ml pożywki do transfekcji.
	<ol>
		<li>Delikatnie wymieszaj DNA, PEI i pożywkę do transfekcji w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut i dodawaj ją kroplami do 15-centymetrowej płytki. 
		UWAGA: Po tym kroku należy stosować odpowiednie środki bezpieczeństwa i przestrzegać wszystkich instytucjonalnych i laboratoryjnych procedur bezpieczeństwa, ponieważ wszystkie odczynniki będą zawierały żywego wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 16 godzinach transfekcji i inkubacji w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 należy odessać pożywkę i delikatnie dodać świeżą pożywkę o temperaturze 293 HEK (podgrzaną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) do płytek o średnicy 15 cm. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin po zmianie pożywki. Wirus jest wtedy gotowy do zbioru.</li>
</ol>
2) Zakażenie embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) lentiwirusem
<ol>
	<li>Hoduj niskopasażowe (mniej niż pasaż 35), przystosowane do karmienia mESC CiA w pożywkach bazowych DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionych 20% FBS klasy ESC, 10 mM HEPES, 1x NEAA, Pen/Strep, 2-merkaptoenthanol i czynnik inhibitora białaczki 1:500 (LIF) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: LIF otrzymuje się z supernatantu komórek wytwarzających COS LIF, które są zbierane w partii i zamrażane w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki na płytkach, które były wstępnie inkubowane przez 1 - 3 godziny z 0,1% żelatyny w 1x PBS, a następnie przemyte 1x PBS. Karmić komórki codziennie i dzielić je co 2 - 3 dni, w zależności od ich gęstości. 
		UWAGA: Pod względem morfologicznym kolonie embrionalnych komórek macierzystych (ES) powinny być małe, okrągłe i różnić się od siebie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście mESC do 12-dołkowej płytki (100 000 komórek/dołek) 1 dzień przed zakażeniem.
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. W przypadku komórek hodowanych w formacie 10 cm odessać stare podłoże, dodać 5 ml 1x PBS, odessać PBS i dodać 1 ml 0,25% trypsyny. Inkubować komórki w trypsynie przez 8 minut w temperaturze 37 °C, kołysząc i stukając w komórki w połowie inkubacji. Celem tego etapu jest wprowadzenie komórek do zawiesiny jednokomórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>48 godzin po zmianie pożywki z komórek opakowania wirusa 293T15 cm z kroku 1.4 należy usunąć i przenieść supernatant do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować supernatant o sile 300 x g przez 5 minut, aby osadzać resztki komórek.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant przez membranę 0,45 μm. 
	UWAGA: Upewnij się, że używasz membran z octanu celulozy (SFCA) niezawierających środków powierzchniowo czynnych, ponieważ niektóre inne materiały mogą zatrzymywać wirusa i znacznie zmniejszać wydajność.</li>
	<li>Zagęścić wirusa za pomocą ultrawirowania, używając wirówki z wirnikiem SW32 i wirować z prędkością 20 000 obr./min (~72 000 x g) przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas gdy wirus koncentruje się w ultrawirowaniu, należy potraktować mESC CiA na płytce 12-dołkowej świeżą pożywką ES zawierającą 5 μg/ml polibrenu.</li>
	<li>Po osiągnięciu stężenia wirusa ostrożnie odessać supernatant i zawiesić osad wirusa w 100 μl 1x PBS (unikać nadmiaru pęcherzyków).</li>
	<li>Dodaj wirusa i 1x PBS do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Odwiruj/potrząśnij probówką o gramaturze 300 x g (lub przy najniższym ustawieniu), aby całkowicie zawiesić wirusa. Wiruj probówkę w mini wirówce stołowej przez 5 - 10 sekund, aby usunąć pęcherzyki.</li>
	<li>Dodać 30 μl wirusa do każdego dołka na płytce 12-dołkowej. Zamieszać płytkę, a następnie odwirować płytkę przy 1 000 x g przez 20 min. 
	UWAGA: Ilość dodawanego wirusa może się różnić w zależności od miana wirusa, które jest odwrotnie proporcjonalne do wielkości konstruktu dostarczającego.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, wirus należy błyskawicznie zamrozić ciekłym azotem i przechowywać go w temperaturze -80 °C. Jednak zamrożenie wirusa obniży miano wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i zmienić pożywkę następnego ranka (~16 godzin później) na świeżą pożywkę ES (jak opisano w kroku 2.1).</li>
	<li>Po 48 godzinach od zakażenia należy wybrać komórki, które integrowały plazmid wirusa, dodając odpowiedni antybiotyk (tj. 1,5 μg/ml puromycyny, 10 μg/ml blasticydyny itp.). Zmieniaj pożywkę codziennie i myj komórki 1x PBS, jeśli większość komórek jest pływająca/martwa. Przechowywać pożywkę selekcyjną na komórkach przez 72 - 96 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
3) Przygotowanie i leczenie chemicznych modyfikatorów epigenetycznych (CEM)
<ol>
	<li>Zawiesić sproszkowany CEM w dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia podstawowego 1 mM i stężenia roboczego 100 μM.</li>
	<li>Po poddaniu komórek selekcji przez 72 - 96 godzin, podziel mESC na format 12-dołkowy ze 100 000 komórek/dołek. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny. Następnie przygotuj roztwór pożywki o stężeniu 100 nM CEM z pożywką ES. Użyj tej pożywki do zasilania mESC CiA 1 ml / studzienkę. Aby służyć jako kontrola, utrzymuj studnię komórek bez żadnych dodatkowych CEM-ów.
	<ol>
		<li>Zmienić pożywkę, odsysając stare pożywki i dodając 1 ml/studzienkę świeżo przygotowanej pożywki ES zawierającej CEM lub wolnej od CEM co 24 godziny przez czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4) Analiza ekspresji za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Po 48 godzinach leczenia CEM należy zobrazować komórki bez leczenia CEM i komórki potraktowane 100 nM CEM za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wykonaj reprezentatywne zdjęcia za pomocą fazy lub jasnego pola, aby zarejestrować morfologię mESC przy 20-krotnym powiększeniu; Komórki powinny uformować okrągłe kolonie z kilkoma zróżnicowanymi komórkami. W kanale fluorescencyjnym FITC zobrazuj oba warunki komórki.</li>
	<li>Wyizoluj komórki kontrolne i poddane działaniu CEM do cytometrii przepływowej, odsysając pożywkę, przemłukując komórki 1 ml 1x PBS, odsysając PBS i dodając 0,25 ml 0,25% trypsyny z EDTA przez 8 - 10 min.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki nie są już w dużych kępach, patrząc w mikroskop. Użyj 20-krotnego powiększenia. Jeśli wydaje się, że komórki nie znajdują się w zawiesinie jednokomórkowej, delikatnie pipetuj w górę i w dół pipetą P1000, aby w pełni trypsynizować komórki.</li>
	<li>Ugasić trypsynę 1 ml świeżej pożywki i ponownie zawiesić komórki z dużą prędkością za pomocą pipety serologicznej (lub pipety i końcówki P1000), aż komórki znajdą się w zawiesinie jednokomórkowej.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant. Przemyć 1x PBS i ponownie odwirować komórki. Odessać supernatant PBS.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 200 ml buforu FACS (1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA], 1x PBS i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]).
	<ol>
		<li>Całkowita objętość bufora FACS będzie zależała od liczby obecnych komórek, ale stężenie powinno wynosić 1,000 - 3,000 komórek/μL. Policz liczbę komórek w 3 próbkach i uśrednij stężenie komórek. W razie potrzeby dodaj więcej bufora FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj cytometrię przepływową na > 50 000 komórek z zawieszonymi komórkami, utrzymując komórki na lodzie, gdy nie są analizowane. Użyj filtra 530/40 (FITC, AF488, GFP itp.) do rejestrowania zmian w wyrażeniu. Określ odpowiednie napięcie fluorescencyjne za pomocą niepoddanej działaniu substancji próbki ogniwa kontrolnego i ustaw napięcie tak, aby pik fluorescencyjny znajdował się w środku zarejestrowanego widma intensywności. Próbki należy uruchamiać z prędkością osłony około 5 000 komórek/s.</li>
	<li>Wyeksportuj dane i przeanalizuj pliki FCS w programie do cytometrii przepływowej (tj. FlowJo), bramkując najpierw na rozproszeniu do przodu i rozrzuceniu bocznym dla żywych komórek, a następnie na wysokości rozproszenia do przodu w zależności od obszaru dla singletów. Następnie zwizualizuj dane kanału GFP na histogramie, aby określić względne wyrażenie GFP w populacji docelowej i kontrolnej.</li>
</ol>
5) Analiza chromatyny za pomocą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie qPCR
<ol>
	<li>Podzielić mESC na 10-centymetrową płytkę z 3 milionami komórek i 10 ml pożywki ES (jedna 10-centymetrowa płytka na każdy warunek eksperymentalny lub kontrolny). Następnego dnia dodaj 10 ml pożywki zawierającej CEM lub wolnej od CEM. Po 48 godzinach leczenia CEM odessać stare podłoże. Umyj i odessaj komórki 5 ml 1x PBS. Następnie zdysocjuj komórki za pomocą 0,25% trypsyny i wygadź trypsynę za pomocą 10 ml pożywki ES. Policz i wyizoluj próbkę 10 milionów komórek na warunek.</li>
	<li>Odwiruj każdą z 10 milionów próbek komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić każdą osadkę w 10 ml 1x PBS i ponownie odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić każdą osadkę w 10 ml buforu CiA Fix (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM glikolu etylenowego-bis[ß-aminoetylowego eter]-N,N,N',N'-tetraoctowego [EGTA] pH 8 i 100 mM chlorku sodu [NaCl]). Dodać 1 ml 11% roztworu formaldehydu i natychmiast odwrócić próbki 5x - 10x. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml 2,5 M glicyny. Natychmiast odwrócić próbki i inkubować próbkę na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować próbkę o sile 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml CiA Rinse 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% glicerol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] i 0,25% Triton X100). Inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut. Odwirować przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml CiA Rinse 2 (10 mM tris[hydroksymetylo]aminometan [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 i 200 mM NaCl). Odwirować próbkę o sile 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 5 ml buforu ścinającego CiA (0,1% SDS, 1 mM EDTA i 10 mM Tris pH 8) wzdłuż boków stożkowej probówki, aby zmyć sól bez naruszania osadu. Odwirować próbkę o masie 1 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap płukania.</li>
	<li>Zawiesić osad w 90 μl buforu ścinającego CiA i świeżych inhibitorów proteazy (użyć mieszaniny leupeptyny, chymostatyny i pepstatyny A rozpuszczonych razem w ilości 10 mg / ml każdy w DMSO, aby uzyskać 1,000x roztwór podstawowy, co daje końcowe stężenie 10 μg / ml). Dodaj 10 μl nanokropelek wzmacniających sonikację, utrzymując wszystko na lodzie13,14.</li>
	<li>Przenieść 100 μl roztworu do szklanej probówki i zamknąć probówkę.</li>
	<li>Sonikować próbki przez 3,5 minuty (oznaczone na podstawie linii komórkowej i liczby komórek). Aby uniknąć przegrzania próbek, należy je przetwarzać w maksymalnym czasie cyklu 2 minuty, jeśli całkowity czas sonikacji przekracza 2 min. 
	Uwaga: Zastosowany tutaj skoncentrowany ultradźwięki działa na wysokiej częstotliwości (500 kHz). Uruchom maszynę z mocą akustyczną 55 W. Czas trwania sonikacji powinien być z góry określony przez każde laboratorium z osobna.</li>
	<li>Przenieś każdą sonifikowaną próbkę chromatyny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować probówki o sile 8 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby przeanalizować wydajność ścinania i określić ilościowo względną ilość chromatyny, postępuj zgodnie z protokołem producenta zestawu ChIP. 
	UWAGA: Określ stężenie DNA spektrofotometrycznie (np. za pomocą przyrządu do nanokropli DNA) i uruchom ~ 200 ng DNA na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy chromatyna jest sonikowana do około 200 - 500 par zasad (bp).</li>
	<li>Aby przeprowadzić immunoprecypitację i wyizolować chromatynę, postępuj zgodnie z protokołem producenta zestawu ChIP. 
	UWAGA: W celu immunoprecypitacji próbek o wyższych stężeniach DNA należy ogrzać bufor elucyjny w temperaturze 37 °C i wymyć próbki 2x za pomocą 30 μl buforu elucyjnego (wirując za każdym razem przez 1 minutę).</li>
	<li>Aby wykonać qPCR, załaduj odczynniki do płytki 384-dołkowej. Dodać 5 μl 2x asymetrycznej cyjaninowej mieszanki barwników, 2,5 μM każdego startera, wodę i 0,1 - 10 ng DNA do każdej reakcji.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji amplikonów 50 - 100 pz, a wartości CT są znormalizowane do genu utrzymania domu, intracisternalnych cząstek typu A (IAP). 
		UWAGA: Więcej informacji na temat metod qPCR można znaleźć w protokole producenta zestawu. Zestaw starterów użyty do namierzenia locus Oct4 był następujący: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGCC. Zestaw starterów kontrolnych używany do kierowania na IAP był następujący: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.</li>
		<li>W oparciu o podkłady i pożądany produkt uruchomić qPCR z 40 cyklami wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 1 min. 
		UWAGA: Uzyskane dane określono ilościowo przy użyciu porównań delta-delta Ct między próbkami, przy czym CiA:Oct4 znormalizowane przez IAP. Końcowe wyniki analizy są przedstawiane jako średnie z trzech próbek doświadczalnych, przy czym błąd jest reprezentowany jako odchylenie standardowe od średniej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22358331">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li>
<li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+exchange%2C+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Gräff, J., Tsai, L. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+molecular+mnemonics+on+the+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li>
<li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li>
<li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li>
<li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li>
<li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li>
<li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560(2017).</li>
<li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li>
<li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014(2015).</li>
<li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy niedawno opracowany system CEM stosowany do regulacji ekspresji genów i środowiska chromatyny w określonym genie w sposób zależny od dawki. Zapewniamy dokładną metodę badania dynamiki związanej z regulacją ekspresji genów poprzez selektywną rekrutację określonych endogennych białek regulatorowych chromatyny. Jest to wysoce modułowa technologia, którą można zastosować do zbadania, w jaki sposób różne kompleksy modyfikujące białka i chromatynę współpracują ze sobą, aby prawidłowo regulować środowis...

Chromatyna składa się z DNA owiniętego wokół białek oktameru histonowego, które tworzą cząstkę rdzenia nukleosomu. Regulacja zagęszczenia chromatyny jest podstawowym mechanizmem prawidłowej naprawy, replikacji i ekspresji DNA1,2,3. Jednym ze sposobów, w jaki komórki kontrolują poziom zagęszczenia, jest dodawanie lub usuwanie różnych potranslacyjnych modyfikacji ogona histonowego. Dwie takie modyfikacje obejmują (1) acetylację lizyny, która jest najczęściej związana z aktywacją genów, oraz (2) metylację lizyny, która może być związana z aktywacją lub represją genu, w zależności od kontekstu aminokwasowego. Dodanie znaczników acetylacji i metylacji jest katalizowane odpowiednio przez acetylotransferazy histonowe (HAT) i metylotransferazy histonowe (HMT), podczas gdy usuwanie znaku odbywa się odpowiednio przez deacetylazy histonowe (HDAC) i demetylazy histonowe (HDM)4,5. Chociaż istnienie tych białek jest znane od dziesięcioleci, wiele mechanizmów działania maszynerii modyfikującej chromatynę w celu prawidłowej regulacji ekspresji genów pozostaje do zdefiniowania. Ponieważ procesy regulacyjne chromatyny są rozregulowane w wielu chorobach ludzkich, nowe informacje mechanistyczne mogą prowadzić do przyszłych zastosowań terapeutycznych.
Test chromatyny in vivo (CiA) to niedawno opisana technika, która wykorzystuje chemiczny induktor bliskości () do kontrolowania rekrutacji maszynerii modyfikującej chromatynę do określonego locus6. Technologia ta została wykorzystana do zbadania rosnącej listy dynamiki chromatyny, w tym białek modyfikujących histony, remodelerów chromatyny i czynników transkrypcyjnych6,7,8,9. Wiązanie chromatyny oparte na białek o ekspresji egzogennej zostało również rozszerzone poza CiA w celu modulacji niezmodyfikowanych loci genetycznych poprzez zastosowanie z dezaktywowanym białkiem związanym z Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) (dCas9)10,11. W systemie CiA mESC zostały zmodyfikowane w celu ekspresji genu reporterowego GFP w locus Oct4, wysoce eksprymowanym i ściśle regulowanym obszarze genomu mESC. Wcześniej system ten był stosowany do opisu zależnej od dawki i odwracalnej rekrutacji egzogennego białka heterochromatyny 1 (HP1), enzymu, który wiąże H3K9me3 i propaguje znaczniki represyjne (np. H3K9me3) i metylację DNA6. Aby zrealizować ten rodzaj strategii rekrutacji, mESC są zakażone plazmidem, który wyraża białko wiążące FK506 (FKBP) połączone z Gal4, który jest kotwicą DNA-białko, która wiąże się z macierzą wiążącą Gal4 przed reporterem GFP. Komórki są również zakażone domeną wiążącą FKBP-rapamycynę (FRB) połączoną z HP1. Gdy mESC są wystawione na działanie niskich nanomolowych stężeń, rapamycyna, zarówno FRB, jak i FKBP, są łączone w miejscu docelowym. W ciągu kilku dni po leczeniu rapamycyną ekspresja genu docelowego zostaje stłumiona, o czym świadczy mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa, a acetylacja histonów jest zmniejszona, co wykazano za pomocą sekwencjonowania ChIP i wodorosiarczynu. Chociaż rozwój i walidacja tego podejścia były znaczącymi postępami w dziedzinie badań i regulacji chromatyny, jedną z wad jest wymagana egzogenna ekspresja maszynerii modyfikującej chromatynę.
Aby technologia opierała się na rekrutacji tylko endogennych fizjologicznie istotnych enzymów i stworzyć bardziej modułowy system, zaprojektowaliśmy i scharakteryzowaliśmy nowe dwufunkcyjne cząsteczki, zwane CEMs (Rysunek 1)12. Jednym ze składników CEM jest FK506, który, podobnie jak rapamycyna, ściśle i specyficznie wiąże się z FKBP. W związku z tym CEM będą nadal rekrutowane do locus Oct4 w mESC CiA. Drugim składnikiem CEM-ów jest ugrupowanie, które wiąże endogenną maszynerię modyfikującą chromatynę. W badaniu pilotażowym przetestowaliśmy CEM, które zawierają inhibitory HDAC. Chociaż koncepcja użycia inhibitora do rekrutacji HDAC wydaje się sprzeczna z intuicją, inhibitor jest jednak w stanie zrekrutować aktywność HDAC do genu będącego przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez (1) przekierowanie HDAC do locus, uwolnienie enzymu i zwiększenie gęstości niehamowanych HDAC w tym obszarze oraz (2) utrzymanie hamowania HDAC w locus, ale rekrutację kompleksów represyjnych, które wiążą się z hamowanymi HDAC, lub (3) kombinację obu. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że CEM były w stanie skutecznie stłumić reportera GFP w sposób zależny od dawki i czasu, a także w sposób, który był szybko odwracalny (tj. w ciągu 24 godzin)12. Scharakteryzowaliśmy zdolność przedstawionej tutaj technologii CEM do kontrolowania ekspresji genów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej oraz zdolność do kontrolowania środowiska chromatyny za pomocą ChIP-qPCR6. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystania i charakterystyki CEM, która ułatwi adaptację tego systemu do odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z biologią chromatyny.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013CV</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (do hodowli tkankowych)</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>BME (2-merkaptoetanol)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11550</td><td>Indywidualne partie przetestowane pod kątem jakości</td></tr><tr><td>probówek</td> <td>CovarisThermoScientific</td><td>C4008-632R</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki Covaris</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-2A</td><td></td></tr><tr><td>PEI (polietylenimina)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Media transfekcyjne (Opti-mem)</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe do wirusów</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtrująca wirusy</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>z EDTA</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25400-054</td><td>z EDTA</td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix (asymetryczny barwnik cyjaninowy)</td> <td>Przeciwciało</td><td></td> Roche 4913914001 <td></td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr> <tr><td>(zestaw ChIP) Zestaw o wysokiej czułości ChIP-IT</td><td>Active Motif</td><td>53040</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E110</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Optima</td><td>XPN-80</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 wirnik wirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>14U4354</td><td></td></tr><tr><td>Wiadra wirówkowe SW-32 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>130.2</td><td></td></tr><tr><td>LentiX 293 Ludzka embrionalna nerka</td><td>Clontech</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9700</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>MP Biomedicals</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TE</td><td>Fisher</td><td>BP2474-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (dla ChIP)</td><td>Fisher</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy, Attune NxT</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid FKBP-Gal4</td><td>Addgene</td><td>44245</td><td></td></tr><tr><td>plazmid psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nanokropelki</td><td>MegaShear</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy (Leupeptin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy (Chymostatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>230790</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy (pepstatyna)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>516481</td><td></td></tr><tr><td>CiA:Oct4 mESC</td><td>Miły dar G. Crabtree</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lif-1C-alfa - wytwarzanie komórek Cos</td><td>Miły dar J. Wysockiej</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulacja zagęszczenia chromatyny jest ważnym procesem, który reguluje ekspresję genów u wyższych eukariontów. Chociaż zagęszczenie chromatyny i regulacja ekspresji genów są powszechnie zakłócone w wielu chorobach, brakowało specyficznej dla locus, endogennej i odwracalnej metody badania i kontrolowania tych mechanizmów działania. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy i scharakteryzowaliśmy nowe dwufunkcyjne cząsteczki regulujące geny. Jeden składnik dwufunkcyjnej cząsteczki wiąże się z kotwicą DNA-białko, dzięki czemu zostanie zrekrutowany do locus specyficznego dla alleli. Drugi składnik angażuje endogenną maszynerię modyfikującą chromatynę komórkową, rekrutując te białka do interesującego genu. Te małe cząsteczki, zwane chemicznymi modyfikatorami epigenetycznymi (CEM), są zdolne do kontrolowania ekspresji genów i środowiska chromatyny w sposób zależny od dawki i odwracalny. W tym miejscu szczegółowo opisujemy podejście CEM i jego zastosowanie w celu zmniejszenia ekspresji genów i acetylacji ogona histonów w reporterze białka zielonej fluorescencji (GFP) zlokalizowanym w locus Oct4 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (mESC). Charakteryzujemy wiodący CEM (CEM23) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Podczas gdy moc tego systemu została zademonstrowana w locus Oct4, koncepcyjnie technologia CEM jest modułowa i może być stosowana w innych typach komórek i w innych loci genomowych.

Niedawno opracowaliśmy CEM-y i wykazaliśmy, że technologia ta może być stosowana do regulacji ekspresji genów oraz środowiska chromatyny w locus reporterowym w sposób zależny od dawki i odwracalny. Na Rysunku 1 przedstawiono model wiodącego CEM, CEM23. Aparat HDAC jest rekrutowany do locus reporterowego przez inhibitor HDAC, którym w tym przypadku jest reporter GFP wstawiony do locus Oct4.
...

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak mechanizmy regulacji genów oraz związki przyczynowo-skutkowe między różnymi elementami regulacyjnymi chromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że po raz pierwszy możliwe jest modulowanie loci chromatyny z wykorzystaniem fizjologicznie istotnych enzymów endogennych. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ hodowla komórek ES myszy jest z natury wymagająca dla osób, które nie zostały przeszkolone w tej technice. Dalsza demonstracja tej metody jest krytyczna, gdyż etapy infekcji wirusowej komórek są trudne do opanowania. Badacz musi zsynchronizować czas dwóch oddzielnych linii hodowli komórkowych oraz zachować szczególną czujność w kwestii bezpieczeństwa podczas tych etapów.Aby rozpocząć protokół, należy przeprowadzić pasaż 18 milionów komórek 293T-HEK na płytkę o średnicy 50 centymetrów.Odssać starą pożywkę i dodać 10 mililitrów 1X soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Odssać PBS i dodać trzy mililitry 0,05% trypsyny. Inkubować komórki w trypsynie przez osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W połowie czasu inkubacji delikatnie potrząsnąć i opukać naczynie z komórkami. Następnego dnia, gdy komórki osiągną 60 do 80% konfluencji, przeprowadzić transfekcję za pomocą polietylenoiminy (PEI). Następnie delikatnie wymieszać DNA, PEI i pożywkę do transfekcji w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów.Inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji dodaj roztwór kroplami na płytkę o średnicy 15 centymetrów. Następnie inkubuj próbkę przez 16 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide.Następnego dnia odessaj pożywkę i ostrożnie zastąp ją podgrzaną wcześniej, świeżą pożywką 293T-HEK w płytkach 15 cm. Po wymianie pożywki inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ przez 48 godzin. Policz komórki za pomocą hemocytometru.Na jeden dzień przed infekcją przenieś wcześniej przygotowane mESC do płytki 12-dołkowej w zagęszczeniu 100 000 komórek na dołek. W przypadku komórek hodowanych w formacie 10 cm, odessij stare medium, dodaj 5 ml 1X PBS, odessij PBS, a następnie dodaj 1 ml 0,25% trypsyny. Inkubuj komórki w trypsynie przez 8 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc i opukując naczynie w połowie czasu inkubacji.48 godzin po wymianie pożywki zebrać i przenieść nadsącz z komórek 293T-HEK do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Odwirować nadsącz przy 300 ×g przez pięć minut, aby sfragmentować i osadzić szczątki komórkowe. Następnie przefiltrować nadsącz przez membranę o rozmiarze porów 0,45 µm. Skoncentrować wirusa za pomocą ultrawirowarki z rotorem SW32, wirując próbkę przy 72 000 ×g przez dwie i pół godziny w temperaturze 4 °C. Podczas koncentrowania wirusa w ultrawirowarce, potraktować komórki CiA mESC na płytce 12-dołkowej świeżą pożywką dla embrionalnych komórek macierzystych (ES media) zawierającą 5 µg/ml Polybrene. Po zakończeniu koncentracji wirusa ostrożnie odpompować nadsącz i uważnie zawiesić osad wirusowy w 100 µl 1X PBS, unikając tworzenia nadmiaru pęcherzyków powietrza.Dodać wirusa i 1X PBS do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Wymieszać zawartość probówki w wortexerze na najniższym ustawieniu, aby całkowicie zawiesić wirusa. Odwirować probówkę w miniwirówce stołowej przez 5 do 10 sekund w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.Do każdej studzienki płytki 12-dołkowej dodaj 30 µL wirusa. Zakręć płytką, a następnie odwiruj próbki przy 1000 ×g przez 20 minut. Umieść płytkę 12-dołkową z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.Następnego ranka wymień pożywkę na świeżą pożywkę ES i pozostaw komórki do infekcji na 48 godzin. Po 48 godzinach infekcji przeprowadź selekcję komórek, które zintegrowały plazmid wirusowy, dodając odpowiedni antybiotyk. Wymieniaj pożywkę codziennie. Utrzymuj pożywkę selekcyjną na komórkach przez 72 do 96 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide. Przejdź do przygotowania i podawania chemicznego modyfikatora epigenetycznego, lub CEM, poprzez zawieszenie sproszkowanego CEM w dimetylosulfoksydzie, lub DMSO, do stężenia zapasu 1 mM i stężenia roboczego 100 µM. Po tym, jak komórki przeszły selekcję przez 72 do 96 godzin, przenieś mESC do formatu 12-dołkowego, zachowując gęstość 100 000 komórek na dołek.Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 24 godziny. Po inkubacji przygotuj roztwór pożywki zawierający 100 nM CEM w pożywce ES. Użyj pożywki do nakarmienia CiA mESC w studzience o pojemności 1 ml.Pozostaw studzienkę z komórkami bez dodatku CEM, która będzie służyć jako kontrola. Następnie wymieniaj pożywkę, odsysając starą pożywkę i dodając jeden mililitr na studzienkę świeżo przygotowanej pożywki ES zawierającej CEM lub wolnej od CEM co 24 godziny przez cały czas trwania eksperymentu. Po 48 godzinach traktowania CEM wykonaj obrazowanie komórek nietraktowanych CEM oraz komórek traktowanych 100 nanomolar CEM przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.Wykonaj reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym lub w jasnym polu, aby zarejestrować morfologię mESC przy powiększeniu od 10- do 40-krotnego. Komórki powinny utworzyć okrągłe kolonie z niewielką liczbą zróżnicowanych komórek. W kanale fluorescencji FITC wykonaj obrazowanie obu warunków hodowli komórek. Następnie wyizoluj komórki kontrolne oraz komórki traktowane CEM do cytometrii przepływowej poprzez odessanie medium, przemycie komórek 1 ml 1X PBS, odessanie PBS i dodanie 0,25 ml 0,25% trypsyny z EDTA na 8 do 10 minut. Pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu upewnij się, że komórki nie tworzą już dużych skupisk. Jeśli komórki nie tworzą zawiesiny pojedynczych komórek, delikatnie pipetuj je w górę i w dół za pomocą pipety P1000, aby całkowicie utrypsynizować komórki.Zneutralizuj trypsynę za pomocą jednego mililitra świeżej pożywki i resuspenderuj komórki przy wysokiej prędkości za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie odwiruj komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessaj supernatant, przemyj komórki 1X PBS i poddaj je odśrodkowaniu.Odssać supernatant PBS i resuspendować osad komórkowy w 200 µL buforu FACS. Przeprowadzić analizę cytometryczną na zawiesinie obejmującej ponad 50 000 komórek, analizując próbki przy prędkości przepływu około 5 000 komórek na sekundę. Na koniec wyeksportować dane do dalszej analizy.Obrazy fazokontrastowe systemu CEM w locus Oct4 w mESC CiA wykonane po 48 godzinach traktowania 100 nM CEM23 lub w komórkach nietraktowanych wskazują na specyficzną represję GFP. Obrazy fluorescencyjne wykazują silną ekspresję GFP w komórkach kontrolnych oraz zmniejszoną ekspresję GFP w mESC traktowanych CEM23. Cytometria przepływowa konsekwentnie wykazała spadek ekspresji GFP o ponad 30% w mESC CiA traktowanych 100 nM CEM23 przez 48 godzin.Immunoprecypitacja chromatyny, czyli ChIP, wykazała, że 48-godzinna inkubacja z 100 nanomolar CEM23 obniżyła poziom H3K27ac w locus docelowym w porównaniu z komórkami kontrolnymi.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności w obchodzeniu się z embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy. Jeśli ulegną one różnicowaniu w trakcie protokołu, wyniki zostaną unieważnione. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie biologii syntetycznej do badania mechanizmów in vivo w genomie ssaków.

repressing-gene-transcription-redirecting-cellular-machinery-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj prezentowana jest nowa metoda, która pozwala na przekształcenie dorosłych fibroblastów skóry w komórki wydzielające insulinę. Technika ta opiera się na konwersji epigenetycznej, nie wiąże się z użyciem wektorów retrowirusowych ani nabyciem stabilnego stanu pluripotencjalnego. Jest zatem bardzo obiecujący w zastosowaniach medycyny translacyjnej.

Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

Przedstawiono szczegółowe protokoły wprowadzania zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 (CiDER) do komórek ssaków w celu indukowania chemicznie indukowanego DNA hydroksymetylacji i epigenetycznej przebudowy.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Protokół ten opisuje nieintegracyjny, episomalny system oparty na CRISPR/dCas9 do celowanej edycji epigenetycznej w komórkach K562, łączący efektory dCas9-DNMT3A i dCas9-HDAC1 ze specyficznymi sgRNA, aby precyzyjnie indukować metylację DNA specyficzną dla locus, z ograniczoną efektem pozacelową.

Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Poznaj metodę kontroli ekspresji genów poprzez przekierowanie maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny i odwracalny. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów regulacji genów w komórkach mysich.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Przeglądaj więcej filmów