Name: System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę hodowli 3D sferoidów nowotworowych do badania inwazji raka pęcherza moczowego z wykorzystaniem kolagenu i obrazowania czasowo-rozdzielczego. Technika umożliwia testowanie związków terapeutycznych blokujących inwazję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować laboratorium dr Howarda Crawforda (University of Michigan) za wsparcie techniczne oraz dostarczenie materiałów i sprzętu do tego badania, oraz Alanowi Kelleherowi za wsparcie techniczne. 
Ta praca została sfinansowana z grantów University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

1. Rosnące sferoidy raka
<ol>
	<li>Uprawa z linii komórkowych
	<ol>
		<li>Hodować ludzkie komórki raka pęcherza moczowego w konwencjonalnych warunkach przylegającej hodowli komórkowej i utrzymywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C zasilanym 5%CO2. Utrzymuj komórki na poziomie <90% konfluencji. 
		UWAGA: Stosowane podłoża hodowlane to zmodyfikowane minimalnie niezbędne pożywki (DMEM) firmy Dulbecco zawierające 4,5 g/l D-glukozy, L-glutaminy, 110 mg/l pirogronianu sodu i dostarczane z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w całym tym protokole.</li>
		<li>Na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu trypsynizować (przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA) komórek, określić ilościowo stężenie komórek i rozprowadzić 1 x 106 komórek w 3 ml pożywki hodowlanej w każdym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu.</li>
		<li>Inkubować komórki w warunkach niskiego przyłączenia w temperaturze 37 °C przez ≥16 godzin. Powinno to zapewnić odpowiednią ilość czasu na agregację komórek w sferoidy dla większości linii komórkowych raka pęcherza moczowego. 
		UWAGA: Powstawanie sferoid można obserwować za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola. Optymalny rozmiar i liczba sferoid może zależeć od indywidualnych eksperymentów, ale okazuje się, że sferoidy o średnicach od 50 μm do 150 μm są generalnie odpowiednie do obrazowania poklatkowego przy użyciu soczewki obiektywowej 20X.</li>
		<li>Aby włączyć do sferoid dodatkowe typy komórek, takie jak fibroblasty lub komórki odpornościowe, wymieszaj pożądane komórki z komórkami rakowymi w pożądanym stosunku (1:1, 1:10 itd.) na bardzo niskiej płytce mocującej i inkubuj w temperaturze 37 °C przez ≥16 godzin, aby umożliwić utworzenie sferoid o mieszanym typie komórkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rośnie z guzów pierwotnych 
	UWAGA: Sferoidy guza mogą również pochodzić z pierwotnych źródeł guza pęcherza moczowego, takich jak guzy powstałe w wyniku rakotwórczych modeli guzów pęcherza moczowego8. Na przykład guzy pęcherza moczowego generowane przez myszy karmione N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminą (BBN) można zebrać i zmielić na małe kawałki (około 0,5 mm3) przy użyciu sterylnych narzędzi chirurgicznych. W tym systemie można również badać strawione pierwotne próbki ludzkich nowotworów pęcherza moczowego.
	<ol>
		<li>Zbierz i umyj 0,5 mm3 kawałki guza w 5 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odwirowywanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten etap mycia jeden raz.</li>
		<li>Zebrać kawałki guza przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 5 ml DMEM zawierającego 10% FBS. Przenieś mieszaninę sferoidy guza / pożywki do 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ≥16 godzin przed zatopieniem w matrycy kolagenowej (patrz krok 2.3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory hodowlanej 3D
<ol>
	<li>Rozcieńczyć kolagen typu 1 (pochodzący z ogona szczura) w DMEM zawierającym 10% FBS, aby uzyskać mieszaninę 2 mg / ml zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, wymieszaj kolagen z odpowiednią ilością 1 N roztworu NaOH i DMEM poprzez delikatne pipetowanie zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać fizjologiczne pH.</li>
		<li>Po wymieszaniu kolagenu i DMEM, przed zestaleniem (200 μl/studzienkę) szybko pokryj dołki szkiełka komorowego (w większości zastosowań optymalne są szkiełka komorowe ze szkłem nakrywkowym o liczbie 1,5) mieszaniną kolagenu i DMEM przed zestaleniem (200 μL/studzienkę). Pozwól, aby powlekane szkiełko komory było nieruchome w temperaturze pokojowej przez 15 min. 
		UWAGA: Skład matrycy na bazie kolagenu można modyfikować poprzez dodanie innych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak fibronektyna lub laminina, zgodnie z celami eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie odpipetować 500 μl pożywki zawierającej sferoidy (lub kawałki guza, jeśli używana jest pierwotna próbka guza) z 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu do pustej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odczekaj 2 minuty, aby sferoidy osiadły na dnie rurki.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant z probówki. Przygotuj kolejną tubkę kolagenu typu 1 (2 mg/ml) zmieszaną z DMEM zawierającym 10% FBS i szybko dodaj 500 μl tej mieszaniny do sferoid. Delikatnie wymieszaj sferoidy i kolagen powolnemu pipetowaniu.</li>
	<li>Dodaj 250 μl mieszaniny sferoidów i kolagenu do studzienki z szkiełkiem komorowym pokrytym kolagenem. Pozostawić matrycę kolagenową zawierającą sferoidy do całkowitego zestalenia się (około 30 minut w temperaturze 37 °C).</li>
	<li>Po zestaleniu się matrycy kolagenowej dodaj 1 ml DMEM zawierającego 10% FBS do każdej studzienki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Inkubować szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 , aż będzie gotowe do obrazowania.</li>
</ol>
3. Obrazowanie poklatkowe na żywo komórek
<ol>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny zgodnie z instrukcjami producenta i upewnij się, że komora klimatyczna osiąga temperaturę 37 °C i jest zasilana w 5% CO2, 
	UWAGA: Nasz mikroskop i komora zwykle wymagają 1 godziny, aby osiągnąć równowagę systemu.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś szkiełko komory do adaptera szkiełka dołączonego do mikroskopu.</li>
	<li>Zlokalizuj interesujące Cię sferoidy za pomocą obiektywu o małej mocy (np. 5X) i rozpocznij obrazowanie od obiektywu o większej mocy (w obecnym protokole do większości obrazowania żywych komórek używany jest obiektyw 20X, aby uzyskać lepszą jakość obrazu). 
	UWAGA: W przypadku pierwotnych próbek guza pęcherza moczowego mogą być potrzebne obiektywy 5X i 10X, aby pokryć większy obszar obrazowania. W przypadku naszego obrazowania poklatkowego interwał obrazowania jest ustawiony na 30 minut, a stos Z jest używany do obrazowania całej sferoidy. Zazwyczaj odległość między warstwami Z jest ustawiona na 4 μm dla obiektywu 20X, a całkowita odległość osi Z wynosi około 200 μm. Obrazy można uzyskać za pomocą DIC i fluorescencji, jeśli komórki/tkanki zawierają fluorescencyjne markery białkowe.</li>
	<li>Wykonywanie obrazowania poklatkowego przez 24–72 godz. 
	UWAGA: Czas trwania zależy od typu komórki i potrzeb eksperymentu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie bloku próbki zawierającego sferoidy nowotworowe do cięcia zamrożonych tkanek
<ol>
	<li>Ostrożnie podnieś blok żelu kolagenowego i sferoidy ze szkiełek komory za pomocą małych kleszczyków. Umieść blok żelu kolagenowego w plastikowej formie histologicznej.</li>
	<li>Krótko spłucz żel kolagenowy 1x PBS, a następnie utrwal go 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: PFA jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
	<li>Myj żel kolagenowy 1,5 ml 1x PBS na shakerze przez 15 min. Wymień PBS i powtórz poprzedni krok mycia 3x.</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę (około 3 mm) mieszanki o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby pokryć spód nowej plastikowej formy histologicznej. Umieść utrwalony i umyty żel kolagenowy na wierzchu związku OCT, a następnie ostrożnie zanurz cały żel, wypełniając formę związkiem OCT, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza w OCT.</li>
	<li>Pozostaw formę w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Umieścić formę zawierającą próbkę i związek OCT na 100-milimetrowej szalce Petriego unoszącej się na ciekłym azocie. Pozostawić próbkę do całkowitego zamrożenia.</li>
	<li>Zamrożony blok próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
5. Obrazowanie immunofluorescencyjne dla zamrożonych sferoidów rakowych
<ol>
	<li>Przenieść zamrożony blok próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C do komory kriostatu o temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Konwencjonalne cięcie mrożone należy wykonać, ustawiając odstęp między sekcjami na 7 μm. Pozwól, aby pokrojone próbki przymocowały się do szkiełka bez zmarszczek i uwięzionego powietrza.
	<ol>
		<li>Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C przed przystąpieniem do dalszego barwienia. 
		UWAGA: Można stosować różne interwały w celu dopasowania do potrzeb eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszyć szkiełka na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbki należy przepuszczać PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 15 minut.</li>
	<li>Umyj próbki 3x PBS przez 10 minut na pranie.</li>
	<li>Owiń próbki na szkiełku barierami hydrofobowymi za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.</li>
	<li>Próbki należy traktować roztworem blokującym (1x PBS zawierający 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nałożyć 40 μl roztworu zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe (1x PBS zawierający 5% BSA z rozcieńczeniem przeciwciała pierwszorzędowego w stosunku 1:100) do każdej próbki na szkiełku.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w przeciwciałie pierwszorzędowym w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub w temperaturze pokojowej przez noc (czas i warunki inkubacji różnią się w zależności od przeciwciała pierwszorzędowego).</li>
	<li>Myj próbki 3x PBS przez 15 minut (na pranie).</li>
	<li>Nałożyć 40 μl roztworu zawierającego przeciwciała drugorzędowe (1x PBS zawierający 5% BSA w rozcieńczeniu przeciwciał drugorzędowych w stosunku 1:300) do każdej próbki na szkiełku.</li>
	<li>Myj próbki 3x PBS przez 15 minut (na pranie).</li>
	<li>Próbki należy barwić roztworem Hoechst 33342 (1 μg/ml, rozcieńczony w PBS) w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie myj próbki PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Połączyć próbki z podłożem montażowym i przykryć je szkiełkami nakrywkowymi o odpowiedniej wielkości. Pozostaw szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej na 24 godziny, a następnie wykonaj mikroskopię konfokalną.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Society%22">The Society</a>. , Atlanta, GA. (2018).</li>
<li>Knowles, M. A., Hurst, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+bladder+cancer%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+clinical+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).</li>
<li>DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+Cancer%3A+Diagnosis+and+Treatment.+American+Family+Physician%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician.</a> American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).</li>
<li>Repesh, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro.+assay+for+quantitating+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion.</a> Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+system+as+a+model+for+studying+cancer+cell+invasion+capacity+and+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity.</a> Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro.+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Expermintal+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion.</a> International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).</li>
<li>Rebelo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-3-culture%3A+A+tool+to+unveil+macrophage+plasticity+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment.</a> Biomaterials. , 185-197 (2018).</li>
<li>Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+BBN+as+an+urothelial+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Review: BBN as an urothelial carcinogen.</a> In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).</li>
<li>Palmbos, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC%2FTRIM29+Drives+Invasive+Bladder+Cancer+Formation+through+miRNA-Mediated+and+Epigenetic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms.</a> Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC+induces+an+invasive+switch+in+KRAS-induced+pancreatic+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis.</a> Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).</li>
<li>Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movers+and+shakers%3A+cell+cytoskeleton+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+organization+and+dynamics%3A+two+ends+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vimentin+intermediate+filaments+in+the+progression+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).</li>
<li>Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Filaments+Play+a+Pivotal+Role+in+Regulating+Cell+Architecture+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).</li>
<li>Papafotiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRT14+marks+a+subpopulation+of+bladder+basal+cells+with+pivotal+role+in+regeneration+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis.</a> Nature Communications. 7, 11914(2016).</li>
<li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).</li>
<li>Goddette, D. W., Frieden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization.+The+mechanism+of+action+of+cytochalasin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gel+three-dimensional+matrices+combined+with+adhesive+proteins+stimulate+neuronal+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).</li>
<li>LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structure and function of basement membranes.</a> Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).</li>
<li>Rakha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+in+breast+lesions%3A+the+role+of+the+epithelial-stroma+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier.</a> Histopathology. , (2017).</li>
<li>Erler, J. T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+context+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional context regulation of metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj opisujemy 3-wymiarowy model sferoidalny guza, który umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym inwazji raka pęcherza moczowego, co ma kluczowe znaczenie dla progresji raka i przerzutów. System ten jest podatny na włączenie różnych komponentów zrębowych i komórkowych, aby umożliwić badaczom lepsze odtworzenie mikrośrodowiska tkankowego, w którym zachodzi inwazja raka pęcherza moczowego. Sferoidy raka pęcherza moczowego mogą być generowane z różnych źródeł, takich jak linie komórkowe (w tym genetycznie zmodyfikowane ...

Inwazja jest krytycznym krokiem w rozwoju raka, który jest niezbędny do uzyskania przerzutów i wiąże się z niższą przeżywalnością i złym rokowaniem u pacjentów. W ludzkim raku pęcherza moczowego, najczęstszym nowotworze złośliwym dróg moczowych, który powoduje około 165 000 zgonów rocznie na całym świecie, stadium raka, leczenie i rokowanie są bezpośrednio związane z obecnością lub brakiem inwazji1. Około 75% przypadków raka pęcherza moczowego nie jest inwazyjnych i jest leczonych za pomocą miejscowej resekcji. Natomiast inwazyjne raki pęcherza moczowego (około 25% wszystkich przypadków) są agresywnymi nowotworami z wysokim wskaźnikiem przerzutów i są leczone agresywną terapią multimodalną2,3. Dlatego zrozumienie szlaków molekularnych, które wywołują inwazję, jest niezbędne do lepszego scharakteryzowania ryzyka progresji inwazyjnej i opracowania interwencji terapeutycznych, które mogą zapobiec progresji inwazyjnej.
Inwazyjna progresja nowotworu występuje w złożonym trójwymiarowym (3-D) środowisku i obejmuje interakcję komórek nowotworowych z innymi komórkami nowotworowymi, zrębem, błoną podstawną i innymi typami komórek, w tym komórkami odpornościowymi, fibroblastami, komórkami mięśniowymi i komórkami śródbłonka naczyniowego. Systemy testowe z przepuszczalnym nośnikiem (np. Transwell) są powszechnie stosowane do ilościowego oznaczania inwazji komórek rakowych4, ale systemy te są ograniczone, ponieważ nie pozwalają na mikroskopowe monitorowanie procesu inwazji w czasie rzeczywistym, a pobieranie próbek do dalszego barwienia i analizy molekularnej jest wyzwaniem. Opracowanie trójwymiarowego systemu sferoidalnego guza pęcherza moczowego do badania inwazji jest pożądane, ponieważ umożliwia włączenie zdefiniowanych składników mikrośrodowiskowych z wygodą systemów in vitro.
W tym protokole opisujemy system do badania procesów inwazyjnych ludzkich komórek raka pęcherza moczowego za pomocą trójwymiarowego testu inwazji sferoidów, obejmującego matryce żelowe na bazie kolagenu i mikroskopię konfokalną, aby umożliwić badaczom monitorowanie ruchliwości i inwazji komórek w czasie rzeczywistym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Ten system jest wszechstronny i może być modyfikowany w celu zbadania różnych ustawień zrębu / guza. Może zawierać większość linii komórkowych raka pęcherza moczowego lub pierwotne guzy pęcherza moczowego oraz dodatkowe komórki zrębu, takie jak fibroblasty związane z rakiem i komórki odpornościowe5,6,7. Protokół ten opisuje matrycę złożoną z kolagenu typu 1, ale może być zmodyfikowana w celu włączenia innych cząsteczek, takich jak fibronektyna, laminina lub inne białka kolagenowe. Procesy inwazyjne można obserwować przez 72 godziny lub dłużej, w zależności od możliwości zastosowanego mikroskopu i systemu. Utrwalenie i barwienie immunofluorescencyjne guza osadzonego w matrycy 3D przed, w trakcie i po inwazji umożliwia badanie białek regulowanych w górę w komórkach inwazyjnych, dostarczając w ten sposób kluczowych informacji, które zwykle są nieobecne lub trudne do zebrania przy użyciu innych modeli hodowli 3D. System ten może być również wykorzystany do badań przesiewowych związków, które blokują inwazję, oraz do wytyczania szlaków sygnałowych, na które wpływają takie związki.

<table><tbody><tr><td>Linie komórkowe ludzkiego raka pęcherza moczowego UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar Aparat słuchowy 6-dołkowy z ultraniską nasadką&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Konwencjonalny mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>Ogólne zastosowanie do hodowli komórkowych i sprawdzania sferoid</td></tr><tr><td>Kolagen typu 1 z ogona szczura, wysokie stężenie&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Komorowy</td> mikroskop konfokalny <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>Miskoskop konfokalny z komorą klimatyczną, obrazowaniem w wielu lokalizacjach i funkcją skanowania Z-stack&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrotomik kriostatu</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 Oprogramowanie do przetwarzania obrazu&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP</td><td>Pen Vector Laboratories&nbsp;</td><td>Związek H4000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 rozwiązanie&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ATDC (Trim29)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytokeratyny 14</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-wimentynowe</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Medium montażowe</td></tr></tbody></table>

system hodowli komórkowych 3d do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Rak pęcherza moczowego to poważny problem zdrowotny. Szacuje się, że w tym roku ponad 16 000 osób umrze w Stanach Zjednoczonych z powodu raka pęcherza moczowego. Podczas gdy 75% nowotworów pęcherza moczowego jest nieinwazyjnych i jest mało prawdopodobne, aby dawały przerzuty, około 25% rozwija się do inwazyjnego wzorca wzrostu. U nawet połowy pacjentów z nowotworami inwazyjnymi rozwinie się śmiertelny nawrót przerzutowy. Dlatego zrozumienie mechanizmu inwazyjnej progresji raka pęcherza moczowego ma kluczowe znaczenie dla przewidywania wyników leczenia pacjentów i zapobiegania śmiertelnym przerzutom. W artykule przedstawiono trójwymiarowy model inwazji nowotworu, który umożliwia włączenie komórek nowotworowych i składników zrębu w celu naśladowania warunków in vivo występujących w mikrośrodowisku guza pęcherza moczowego. Model ten daje możliwość obserwacji procesu inwazyjnego w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania poklatkowego, badania zaangażowanych szlaków molekularnych za pomocą konfokalnego obrazowania immunofluorescencyjnego i badań przesiewowych związków o potencjale blokowania inwazji. Chociaż protokół ten koncentruje się na raku pęcherza moczowego, jest prawdopodobne, że podobne metody mogą być stosowane do badania inwazji i ruchliwości również w innych typach nowotworów.

Pomyślne stworzenie sferoidu nowotworowego inwazyjnego raka pęcherza moczowego wymaga uformowania odpowiednio wielkich sferoidów nowotworowych z linii komórkowych lub guzów pierwotnych. Rysunek 2A przedstawia sferoidy o odpowiedniej wielkości opracowane z czterech linii komórkowych ludzkiego raka pęcherza moczowego (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J oraz UM-UC18). Rysunek 2B przedstawia sferoid nowo...

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Progresja inwazyjna jest kluczowym wyznacznikiem wyniku klinicznego u pacjentów z rakiem pęcherza moczowego. Tutaj opiszemy prostą metodę in vitro, która wykorzystuje sferoidy guza generowane przy użyciu linii komórkowych lub guzów pierwotnych do badania inwazji. Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie monitorować proces inwazji raka w czasie rzeczywistym, a także używać barwienia immunofluorescencyjnego do badania próbek pod koniec eksperymentu.Technikę tę można dostosować do włączenia innych typów komórek, takich jak fibro blasty lub komórki odpornościowe. Może być również używany do testowania związków, które mogą być przydatne do blokowania inwazji. Kluczowymi czynnikami sukcesu są optymalizacja tworzenia sferoidów guza i osadzanie w kolagenie, zastosowanie odpowiedniej mikroskopii z odpowiednią odległością roboczą i odpowiednimi procedurami barwienia immunologicznego.Aby rozpocząć generowanie sferoid z linii komórkowych, należy hodować ludzkie komórki raka pęcherza moczowego w konwencjonalnych warunkach hodowli komórek przylegających. Na dzień przed eksperymentem trypsynizuj komórki i rozprowadź 1 000 000 komórek w trzech mililitrach pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki na sześciodołkowej płytce. Następnie inkubuj komórki w warunkach niskiego przyłączenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 16 godzin.Aby wygenerować sferoidy z guzów pierwotnych, zbierz i umyj 0,5 milimetra sześciennych kawałków guza w pięciu mililitrach lodowatego PBS. Odwiruj kawałki guza w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie zbierz kawałki guza przez wirowanie w temperaturze 200 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie usuń supernatant i dodaj pięć mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS. Przenieś mieszaninę sferoidalnych pożywek nowotworowych na sześciodołkową płytkę o bardzo niskim przyłączeniu. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 16 godzin.Po pierwsze, rozcieńczyć kolagen typu pierwszego w DMEM uzupełniony 10% FBS, aby uzyskać mieszaninę dwóch miligramów na mililitr. Następnie szybko pokryj mieszaniną studzienki szkiełka komorowego. Utrzymuj szkiełko komory nieruchomo w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie delikatnie odpipetuj 500 mikrolitrów sferoidalnego podłoża z bardzo niskiej płytki mocującej do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie pozwól sferoidom osiąść na dnie rurki przez dwie minuty. Ostrożnie usunąć supernatant z probówki.Następnie szybko dodaj 500 mililitrów świeżej mieszanki kolagenu DMEM do sferoidów. Pipetuj w górę i w dół, aby delikatnie wymieszać sferoidy i kolagen. Następnie dodaj 250 mikrolitrów mieszaniny kolagenu sferoidalnego do studzienek szkiełka komorowego pokrytego kolagenem.Pozwól, aby macierz kolagenowa zawierająca sferoidę całkowicie się zestaliła. Po zestaleniu się matrycy kolagenowej dodaj jeden mililitr DMEM uzupełnionego FBS do każdego dołka szkiełek komory. Następnie inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Przygotuj mikroskop konfokalny zgodnie z instrukcjami producenta i upewnij się, że komora klimatyczna osiąga 37 stopni Celsjusza i jest zasilana 5% CO2. Następnie przenieś szkiełko komory do adaptera szkiełka mikroskopu. Korzystając z obiektywu o małej mocy, zlokalizuj interesujące Cię sferoidy, a następnie rozpocznij obrazowanie za pomocą obiektywu o dużej mocy i wykonuj obrazowanie poklatkowe przez 24 do 72 godzin.Najpierw użyj małych kleszczyków, aby podnieść blok żelu kolagenowego i sferoidy ze szkiełka komory. Następnie umieść blok żelu kolagenowego w plastikowej formie histologicznej. Krótko spłucz blok żelu kolagenowego 1x PBS.I napraw to za pomocą 4% PFA i PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj blok żelu kolagenowego 1,5 mililitra 1x PBS na shakerze przez 15 minut. Nałóż cienką warstwę związku OTC na dno nowej plastikowej formy histologicznej.Następnie umieść utrwalony i umyty blok żelu kolagenowego na wierzchu związku OTC, a następnie ostrożnie wypełnij resztę formy związkiem OTC. Trzymaj formę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie błyskawicznie zamroź formę na 100-milimetrowej szalce Petriego unoszącej się na ciekłym azocie i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Przenieść zamrożony blok próbki do komory kriostatu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj konwencjonalne sekcjonowanie mrożone z odstępem siedmiu mikrometrów. Następnie suszyć szkiełka na powietrzu przez godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie przepuszczaj próbki przez 15 minut za pomocą PBS zawierającego 0,5% Triton X-100. Następnie przemyj próbki PBS trzy razy przez 10 minut każda. Następnie otoczyć próbki hydrofobowym pisakiem barierowym.Próbki należy traktować roztworem blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie nanieść 40 mikrolitrów roztworu zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe na każdą próbkę. Inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie przemyć próbkę trzykrotnie PBS przez 15 minut na pranie. Następnie nanieść 40 mikrolitrów roztworu zawierającego przeciwciało wtórne na każdą próbkę. Następnie przemyć próbki trzykrotnie PBS przez 15 minut na pranie.Wybarwić próbkę roztworem Hoechst 33342 w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie przemywać próbki PBS przez pięć minut. Zamontuj próbki za pomocą podłoża montażowego i przykryj je szkiełkami nakrywkowymi.Na koniec pozostaw szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej na 24 godziny przed wykonaniem mikroskopii konfokalnej. W tym protokole inwazyjne sferoidy guza raka pęcherza moczowego zostały utworzone z linii komórkowych i guzów pierwotnych. Reprezentatywny film poklatkowy pokazuje inwazję sferoidalną guza raka pęcherza moczowego do macierzy kolagenowej.Reprezentatywny film poklatkowy pokazuje inwazyjne zachowanie sferoid guza raka pęcherza moczowego znakowanych GFP samodzielnie lub współhodowanych z fibroblastami znakowanymi RFP. Aby zademonstrować możliwość zastosowania barwienia immunofluorescencyjnego markerów białkowych, sferoidy utrwalono, pocięto na sekcje i wybarwiono po 24 lub 72 godzinach. Widok sferoid UM-UC-14 w większym powiększeniu pokazuje nitkowate barwienie białka związanego z ataksją-teleangiektazją grupy D.Wysoce inwazyjne komórki rozsiane ze sferoid UM-UC-18 po 24 godzinach inwazji wyrażają wysoki poziom wimentyny, markera przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego. Ten test jest przydatny w ograniczonych badaniach przesiewowych farmakologicznych inhibitorów inwazji raka pęcherza moczowego. Cytochalazyna D jest tutaj stosowana w celu przedstawienia farmakologicznego hamowania inwazji.W tym miejscu opisujemy model, który pozwala na obserwację inwazji raka pęcherza moczowego w czasie rzeczywistym. System ten jest podatny na włączenie różnych składników zrębu i komórek, co pozwala badaczom lepiej odtworzyć mikrośrodowisko tkankowe, w którym zachodzi inwazja raka pęcherza moczowego. System ten nie tylko stanowi użyteczne narzędzie do badania inwazji w środowisku 3D, ale także nadaje się do ograniczonych badań przesiewowych związków farmaceutycznych, które mają potencjał do blokowania inwazji komórek rakowych.

3-d-cell-culture-system-for-studying-invasion-evaluating-therapeutics

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Ten film przedstawia szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi w matrycy białkowej błony podstawnej 3D, ilustrując potencjał hodowli 3D w ocenie inwazji komórek do otaczającego środowiska.

Test błony podstawnej hodowli 3D: hodowla komórek rakowych na matrycy białkowej błony podstawnej 3D w celu zbadania inwazji komórek

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Ten protokół dostarcza szczegółowych kroków eksperymentalnych w celu ustanowienia trójwymiarowej hodowli in vitro organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego raka pęcherza moczowego. Opisano metody hodowli, w tym pasażowanie, inżynierię genetyczną i ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych.

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są potężnym narzędziem w translacyjnych badaniach nad rakiem, odzwierciedlając zarówno genetyczną i fenotypową heterogeniczność choroby, jak i odpowiedź na spersonalizowane terapie przeciwnowotworowe. W tym miejscu szczegółowo omówiono skonsolidowany protokół generowania PDO ludzkiego pierwotnego raka pęcherza moczowego w ramach przygotowań do oceny analiz fenotypowych i odpowiedzi na leki.

Hodowla organoidów raka pęcherza moczowego jako narzędzia medycyny precyzyjnej

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj metodę hodowli 3D sferoidów nowotworowych do badania inwazji raka pęcherza moczowego z wykorzystaniem kolagenu i obrazowania czasowo-rozdzielczego. Technika umożliwia testowanie związków terapeutycznych blokujących inwazję.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Przeglądaj więcej filmów