Name: Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów myszy na erytroidalne progenitory. Ta technika umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej i ma zastosowanie w medycynie transfuzjologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Evelyn Wang i Gregory'emu Hyde'owi (Whitehead Institute, Cambridge, MA) za klonowanie oraz Harveyowi Lodishowi (Whitehead Institute) za dostarczenie wielu plazmidów używanych do tworzenia biblioteki retrowirusowej. Dziękujemy Kavicie Sivie i Sofie Singbrant (Wydział Medycyny Molekularnej i Terapii Genowej, Uniwersytet w Lund), Göranowi Karlssonowi i Shamitowi Soneji (Wydział Hematologii Molekularnej, Uniwersytet w Lund) za ich rolę w opisie produkcji iEP. Chcielibyśmy również podziękować Julianowi Pulecio (Centrum Medycyny Regeneracyjnej, Park Badań Biomedycznych w Barcelonie), Violetze Rayon-Estrada (Uniwersytet Rockefellera, Nowy Jork), Carlowi Walkleyowi (Instytut Badań Medycznych i Wydział Medycyny St. Vincent's Hospital, Uniwersytet w Melbourne), Ángelowi Raya (Kataloński Instytut Badań i Studiów Zaawansowanych, Barcelona) oraz Vijayowi G. Sankaranowi (Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology i Harvard, Cambridge) za ich wcześniejszy wkład w tę pracę. Prace te były wspierane przez Fundację Ragnara Söderberga (J.F.); Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych (do J.F.); Stiftelsen olle engkvist byggmästare (do J.F.); Szwedzka Fundacja Badań Strategicznych (do J.F.); Fundacja Akego Wiberga (J.F.); stypendium integracyjne w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie" (dla J.F.).

1. Zakładanie i utrzymywanie pierwotnych kultur fibroblastów na końcach ogonów myszy
<ol>
	<li>Przygotować naczynia pokryte żelatyną (zaleca się 10-centymetrowe naczynie na jeden ogon), pokrywając powierzchnię 0,1% żelatyny i inkubując szalki przez około 20 minut w temperaturze 37 °C. Odessać roztwór żelatyny z naczynia i pozostawić do wyschnięcia przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Usuń ogon nożyczkami, przecinając u podstawy ogona. Umieść ogon w buforowanym fosforanami soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. 
	UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, ogony należy pobrać od myszy w wieku około 6 do 8 tygodni. Ogony mogą być pobierane od myszy starszych niż 8 tygodni życia, jednak wraz z wiekiem myszy zdolność do proliferacji fibroblastów i skuteczność przeprogramowania maleją11.</li>
	<li>Wszystkie kolejne etapy tego protokołu należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej w sterylnych warunkach. Przygotować rozcieńczony roztwór trypsyny 0,02% trypsyny-EDTA w DPBS i dodać 5 ml do niepowlekanego naczynia o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Umyj ogon, najpierw w 70% etanolu, a następnie w DPBS. W naczyniu połóż ogon płasko i użyj kleszczy, aby przytrzymać go na miejscu. Wykonaj nacięcie na ogonie wzdłuż jego osi podłużnej od podstawy do końca.</li>
	<li>Chwyć ogon jedną parą kleszczy i trzymaj go pionowo. Używając drugiej pary kleszczy, chwyć skórę obok nacięcia u podstawy ogona i oderwij ją z powrotem. Rób to po obu stronach nacięcia, aż skóra będzie mogła zostać oderwana, pociągając w dół w kierunku czubka ogona.</li>
	<li>Przytrzymaj obrany ogon kleszczami nad naczyniem zawierającym roztwór trypsyny i pokrój ogon na kawałki o długości około 1 cm. Trzymając kawałki ogonowe w roztworze trypsyny, użyj nożyczek, aby rozdrobnić kawałki na mniejsze kawałki. Inkubować części ogonowe w roztworze trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Preferowane są mniejsze kawałki, aby zapewnić każdemu elementowi wysoki stosunek powierzchni do objętości.</li>
	<li>Ugasić trypsynę za pomocą 2 objętości pożywki do ekspandowania fibroblastów (FEX) (pożywka Dulbecco Modified Eagle Medium o wysokiej zawartości glukozy (DMEM) z 15% FBS, 2 mM L-glutaminy, aminokwasów endogennych (NEAA) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny).</li>
	<li>Zebrać całą zawartość naczynia do probówki o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 350 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić fragmenty ogona w 10 ml świeżej pożywki FEX.</li>
	<li>Przenieść fragmenty ogona w pożywce do naczynia pokrytego żelatyną i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i 4% O2 , dodając świeże podłoże FEX co 2 dni. 
	UWAGA: Po pięciu do siedmiu dniach fragmenty ogona przyczepiły się na dnie naczynia i można zobaczyć, jak fibroblasty się od nich oddalają.</li>
	<li>Po zauważeniu skupisk fibroblastów delikatnie potrząśnij naczyniem, aby usunąć kawałki ogona i odessać pożywkę i wszystkie fragmenty kości, pozostawiając fibroblasty przyczepione do płytki. Dodaj nową pożywkę FEX i posadź fibroblasty aż do zlewania się.</li>
	<li>Aby upewnić się, że fibroblasty nie zostaną zanieczyszczone przez hematopoetyczne komórki progenitorowe, oddziel komórki od płytki za pomocą 1x trypsyny-EDTA przez 5 minut i zbierz komórki. Zubożenie komórek wykazujących ekspresję markerów hematopoetycznych (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 i Ter-119) za pomocą systemu separacji magnetycznej10.</li>
</ol>
2. Produkcja retrowirusów
<ol>
	<li>Nasiona retrowirusowych komórek pakujących w ilości około 2,5 ×10 4 komórek/cm2 (2,0 ×10 6 komórek na 10-centymetrową szalkę) na naczyniu poddanym działaniu kultury tkankowej (za pomocą plazmy próżniowo-gazowej) i hodowlę przez noc w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS, 10 mM pirogronianem sodu i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego ranka zmień pożywkę na DMEM bez dodatków, używając połowy objętości użytej do hodowli przez noc (5 ml na 10 cm naczynie). Po południu sprawdź, czy komórki są zlewające się w 70-80% i rozpocznij transfekcję.</li>
	<li>Dla każdego czynnika przeprogramowującego, Gata1, Tal1, Lmo2 i c-Myc, przygotuj mieszaninę 2:1 wektora ekspresyjnego (pMX) i wektora pomocniczego (zawierającego geny gag i pol). W przypadku 10-centymetrowej płytki z fibroblastami należy użyć 6 μg wektora ekspresyjnego i 3 μg wektora pomocniczego w końcowej objętości 100 μl w pożywce DMEM.</li>
	<li>Dla każdego czynnika przeprogramowania przygotuj 300 μl DMEM o temperaturze pokojowej (RT) w sterylnej probówce polistyrenowej i ostrożnie dodaj 27 μl dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji. 
	UWAGA: Odczynnik do transfekcji należy przed użyciem doprowadzić do RT i dodać bezpośrednio do podłoża, ponieważ właściwości elektrostatyczne związku mogą spowodować jego przyklejenie się do plastikowej ścianki probówki.</li>
	<li>Dodać mieszaninę plazmidu do probówki zawierającej odczynnik do transfekcji, krótko przemieszać i inkubować mieszaninę odczynnika do transfekcji i DNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Krótko zawirować mieszaninę i dodać ją kroplami do retrowirusowych komórek pakujących, tak aby mieszanina odczynnika do transfekcji i DNA została równomiernie rozłożona w kulturze i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>24 godziny po transfekcji zmień pożywkę na DMEM z 20% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. 48 godzin po transfekcji zebrać supernatant i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy o porach 0,22 μm. 
	UWAGA: Supernatanty wirusowe można zamrozić w temperaturze -80 °C i przechowywać do czasu, gdy będzie to wymagane, chociaż transdukcja jest bardziej wydajna, jeśli stosuje się świeży supernatant wirusa.</li>
</ol>
3. Transdukcja GTLM i zbiór iEP
<ol>
	<li>Wysiewać fibroblasty końcówki ogona w ilości 1 ×10 4 komórek/cm2 na 0,1% wstępnie pokrytych żelatyną szalkach w pożywce FEX i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj mieszaninę transdukcji w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Dodać 1 objętość supernatantu wirusa dla każdego czynnika przeprogramowującego uzupełnionego 4 μg/ml odczynnika do infekcji retrowirusowej (40%) do 6 objętości pożywki FEX (60%).</li>
		<li>Na 10-centymetrową szalkę z fibroblastami dodać 1 ml każdego supernatantu wirusa (4 × wirusów = 4 ml) uzupełnionego 4 μg/ml odczynnika do infekcji retrowirusowej do 6 ml pożywki FEX, co daje w sumie 10 ml mieszaniny transdukcyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać pożywkę FEX z kultury fibroblastów i zastąpić ją mieszaniną transdukcyjną. Inkubować transdukcję przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w warunkach niedotlenienia (5%CO2 i 4%O2).</li>
	<li>Odessać mieszaninę transdukcji i zastąpić ją świeżą pożywką przeprogramowującą (pożywka ekspandująca bez surowicy (SFEM), 100 U/mLPenicyliny/Streptomycyna, 100 ng/ml mysiego czynnika komórek macierzystych (mSCF), 10 ng/ml mysiej interleukiny-3 (IL3), 2 U/ml ludzkiej rekombinowanej erytropoetyny (hrEPO) i 100 nM deksametazonu).</li>
	<li>Inkubować przez 8 dni w temperaturze 37 °C w warunkach niedotlenienia, dodając co 2 dni świeżą pożywkę do przeprogramowywania. Po pięciu do ośmiu dniach pomyślne przeprogramowanie da klastry komórek, które odłączyły się od płytki.</li>
	<li>Aby zebrać przeprogramowane komórki do analizy, delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby pobrać je bezpośrednio z naczynia. Aby zebrać nietransdukowane fibroblasty do porównania, oddziel komórki od płytki za pomocą 1x trypsyny-EDTA i zbierz.</li>
</ol>

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+We+Really+Vastly+Outnumbered%3F+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057492">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li>
<li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversions%3A+unnatural+but+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+reprogramming%3A+a+two-way+street%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li>
<li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+couples+erythropoiesis%2C+B-lymphopoiesis%2C+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li>
<li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li>
<li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Nadekspresja czteroczynnikowego koktajlu, GATA1, TAL1, LMO2 i c-MYC (GTLM), jest wystarczająca do przeprogramowania mysich i ludzkich fibroblastów bezpośrednio na iEPs10. Przeprogramowane komórki erytroidalne bardzo przypominały bona fide erytroidalnych przodków pod względem morfologii, fenotypu, ekspresji genów i zdolności do tworzenia kolonii. Odkrycie to potwierdza zasadność stosowan...

Czerwone krwinki (RBC) są niezbędne u wszystkich kręgowców i stanowią 84% wszystkich komórek ludzkiego ciała1. Od życia embrionalnego do dorosłego nasze zdrowie jest w dużym stopniu zależne od dokładnej regulacji homeostazy RBC. Ciągła produkcja dojrzałych erytrocytów przez cały okres rozwoju do dorosłości jest znana jako erytropoeza. Głównym wyzwaniem w badaniach nad erytropoezą jest zdefiniowanie głównych regulatorów, które koordynują rozwój erytrogenów czerwonych i przełączanie między erytropoezą pierwotną i ostateczną. Bezpośrednie przeprogramowanie linii progenitorów erytroidalnych stanowi okazję do lepszego zrozumienia rozwoju erytroidalnego in vivo.
Bezpośrednie przeprogramowanie linii (DLR), znane również jako transdyferencjacja, to proces przeprogramowania jednego typu komórki bezpośrednio na inny, z pominięciem etapów progenitorowych pluripotencjalnych i multipotencjalnych. DLR był do tej pory używany do produkcji wielu typów komórek, w tym neural2, hematopoietic3,4,5, hepatic6 i nephrotic7, komórki progenitorowe. Dla biologów rozwojowych DLR stał się ważnym narzędziem do badania aspektów zaangażowania linii i końcowych procesów różnicowania8,9. DLR może uzupełniać i częściowo zastępować badania in vivo w celu zrozumienia mechanizmów czynników determinujących los komórki podczas rozwoju. Opisany w tym artykule protokół DLR do przeprogramowania na erytroidalne komórki progenitorowe zapewnia tej dziedzinie uzupełniającą metodę badań rozwojowych erytropoezy.
Wcześniej wykazaliśmy, że nadekspresja koktajlu czteroczynnikowego, GATA1, TAL1, LMO2 i c-MYC (GTLM), jest wystarczająca do przeprogramowania zarówno mysich, jak i ludzkich fibroblastów bezpośrednio na indukowane erytroidalne progenitory (iEPs)10. Przeprogramowane przez GTLM komórki erytroidalne bardzo przypominają prymitywne komórki progenitorowe erytroidalne w dobrej wierze pod względem morfologii, fenotypu i ekspresji genów10. W związku z tym iEP mają ograniczoną zdolność proliferacji i dojrzewają do jądrzastych erytrocytów podobnych do tych przejściowo wytwarzanych we wczesnym zarodku przed wystąpieniem ostatecznej erytropoezy. Dokonując zmian w warunkach przeprogramowania (np. mutacje punktowe w czynnikach przeprogramowujących lub dodanie innych czynników), można zrozumieć, w jaki sposób prowadzi to do zmian w rozwoju i różnicowaniu erytroidalnym. Wykazaliśmy na przykład, że dodanie Klf1 lub Myb do koktajlu GTLM zmienia wzorzec ekspresji globiny z głównie embrionalnego (prymitywnego) na głównie dorosłego (ostatecznego). Odkrycie to potwierdza zasadność stosowania DLR jako narzędzia do definiowania czynników rozwojowych w erytropoezie.
Tutaj opisujemy proces generowania iEP z fibroblastów na końcówkach ogona myszy (TTF). W naszych reprezentatywnych wynikach przeprowadziliśmy przeprogramowanie fibroblastów myszy śledzących linię erytroidalną (Epor-Cre R26-eYFP), które eksprymują żółte białko fluorescencyjne (eYFP) z locus Rosa26 we wszystkich komórkach, które wyraziły receptor erytropoetyny, umożliwiając łatwą wizualizację zaangażowania w linię erytroidalną. Stosując tę metodę, komórki YFP dodatnie (EpoR +) są obecne już pięć dni po transdukcji. Protokół ten oferuje zatem szybką i solidną technikę generowania erytroidalnych komórek progenitorowych in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM bez pirogronianu sodu</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Pożywki hodowlane dla komórek PhGP</td></tr><tr><td>DMEM z pirogronianem sodu</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Pożywki do hodowli fibroblastów na końcach ogona</td></tr> Pożywki do nawożenia wolnego od <tr><td>surowicy macierzystej (SFEM)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>9650</td><td>Media do przeprogramowywania&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca HyClone</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03HI</td><td>Czynnik wzrostu</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna HyClon (100x)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Przeciwboczowe</td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne (100x)</td><td>Pożywka Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td>SNL jest wzbogacona w ten</td></tr><tr><td>Hyklon trypsyny (1x)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Środek dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Mysi czynnik komórek macierzystych (mSCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Dodano do podłoża</td></tr><tr><td>rekombinowanego mysiego Il-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>Dodano do pożywki</td></tr><tr><td>rekombinowanej ludzkiej erytropoetyny (hrEPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Dodano do podłoża przeprogramowującego</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>50-02-2&nbsp; &nbsp;</td><td>Dodano do przeprogramowania nośnika</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma</td><td>9000-70-8&nbsp;</td><td>Rozpalone w dH2O i używane do powlekania płyt. Zapewnić sterylność przed użyciem.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek blasticydyny S</td><td>Sigma</td><td>3/9/3513</td><td>Antybiotyk selekcyjny. Wpływa zarówno na komórki pro-, jak i eukariotyczne</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SH30850.03</td><td>Używany do etapów mycia</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>Infekcja / Transfekcja&nbsp; Odczynnik</td></tr><tr><td>do transfekcji FuGENE HD Odczynnik do transfekcji</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Odczynnik do filtracji</td></tr><tr><td>strzykawkowej linii komórkowej PhGP Millex-GP 0,22 i mikro; m</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>Służy do filtrowania supernatantu wirusa</td></tr><tr><td>BD Szmaragdowa strzykawka podskórna</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU: 307736</td><td>Służy do filtrowania wirusa supernatant</td></tr><tr><td>100 mm Naczynie hodowlane</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Kultura komórkowa</td></tr><tr><td>Płytka</td><td>6-dołkowa</td> Falcon <td>10799541</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie #5</td><td>Sklar</td><td>66-7642</td><td>Używany do Manipulowanie małymi fragmentami ogona</td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki Sklarlite</td><td>Sklar</td><td>23-1149</td><td>Służy do cięcia ogona na małe kawałki</td></tr><tr><td>Zestaw do zmniejszania liczby komórek linii, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Do zubożania komórek krwiotwórczych w kulturach fibroblastów</td></tr><tr><td>CD117 MicroBeads, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-224</td><td>Do zubożenia komórek krwiotwórczych w hodowlach</td></tr> <tr><td>fibroblastówKomórki PheonixGP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3215</td><td>opakowanie retrowirusowe linia komórkowa</td></tr><tr><td>Wektor EcoPAC (pCL-Eco)&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-29540</td><td>retrowirusowy wektor pomocniczy zawierający geny gag i pol</td></tr><tr><td>pMX-GATA1</td><td>Klonowany w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Tal1</td><td>Klonowany w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Lmo2</td><td>Klonowany w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-cMyc</td><td>Klonowany w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CellSens Standard 1.6&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy cytospinowej</td></tr></tbody></table>

bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Zaangażowanie i różnicowanie komórek erytroidalnych przebiega poprzez aktywację ograniczonej do linii sieci transkrypcyjnej, organizowanej przez grupę czynników determinujących los i dojrzewanie komórek. Wcześniej staraliśmy się zdefiniować minimalny zestaw czynników niezbędnych do instruowania rozwoju czerwonych krwinek za pomocą bezpośredniego przeprogramowania linii fibroblastów w indukowane erytroidalne progenitory/prekursory (iEPs). Wykazaliśmy, że nadekspresja Gata1, Tal1, Lmo2 i c-Myc (GTLM) może szybko przekształcić mysie i ludzkie fibroblasty bezpośrednio w iEPs, które przypominają prawdziwe komórki erytroidalne pod względem morfologii, fenotypu i ekspresji genów. Chcemy, aby iEP stanowiły nieocenione narzędzie do badania erytropoezy i regulacji losu komórek. Tutaj opisujemy krokowy proces przekształcania mysich fibroblastów końcówki ogona w iEP poprzez bezpośrednie przeprogramowanie linii (DLR) sterowane czynnikiem transkrypcyjnym. W tym przykładzie przeprowadzamy przeprogramowanie w fibroblastach myszy śledzących linię erytroidalną, które wyrażają żółte białko fluorescencyjne (YFP) pod kontrolą promotora genu receptora erytropoetyny (EpoR), umożliwiając wizualizację indukcji losu komórek erytroidalnych po przeprogramowaniu. Zgodnie z tym protokołem fibroblasty mogą zostać przeprogramowane w iEP w ciągu pięciu do ośmiu dni. 
Chociaż nadal można wprowadzić ulepszenia do procesu, pokazujemy, że przeprogramowanie za pośrednictwem GTLM jest szybkim i bezpośrednim procesem, dając komórki o właściwościach prawdziwych erytroidalnych komórek progenitorowych i prekursorowych.

Przedstawiamy tutaj powtarzalny protokół produkcji iEP z fibroblastów dorosłych z wykorzystaniem DLR sterowanego czynnikami transkrypcyjnymi. Oceniamy przeprogramowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej, testów tworzenia kolonii oraz analizy ekspresji genów. Aby pomóc w wizualizacji konwersji w kierunku erytroidalnego losu komórkowego, przeprowadziliśmy przeprogramowanie na fibroblastach pochodzących z myszy z liniowym śledzeniem erytroidów (Epor-Cre R26-eYFP), k...

Tutaj prezentujemy nasz protokół wytwarzania indukowanych erytroidalnych progenitorów (iEPs) z dorosłych fibroblastów myszy za pomocą bezpośredniego przeprogramowania linii (DLR) sterowanego czynnikiem transkrypcyjnym.

Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Bezpośrednie przeprogramowanie linii od fibroblastów do erytroidalnych komórek progenitorowych. Jest to nowa metoda, którą opracowaliśmy w naszym laboratorium, aby lepiej badać procesy regulacji transkrypcji determinujące los komórek erytroidalnych. Główną zaletą stosowania bezpośredniego przeprogramowania linii do rozwoju badań jest to, że jest to bardzo prosta technika.Tak więc, w porównaniu z, na przykład, badaniami utraty funkcji u myszy z nokautem, tutaj możemy bardzo łatwo manipulować czynnikiem, nadmiernie go wyrażać w określonym punkcie czasowym, a następnie łatwo uzyskać wystarczającą ilość materiału do badania dalszych efektów, takich jak modyfikacje chromatyny lub zmiany ekspresji genów. Chociaż metoda ta koncentruje się na przeprogramowaniu fibroblastów na końcach ogona myszy na erytroidalne komórki progenitorowe, może być również stosowana do innych typów komórek fibroblastów oraz do innych organizmów, w tym ludzi. Implikacje tej techniki rozciągają się na medycynę transfuzjologiczną, ponieważ toruje drogę do produkcji czerwonych krwinek in vitro.Procedurę zademonstruje Alban Johansson z mojej grupy badawczej. Zacznij od pokrycia powierzchni naczyń 0,1% żelatyną. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 20 minut.Odessać roztwór żelatyny i pozostawić naczynia do wyschnięcia. Użyj nożyczek, aby przeciąć u podstawy ogona myszy poddanej eutanazji, aby go usunąć. Umieść ogon w DPBS z 2% FBS, aż będzie gotowy do użycia.W kapturze do hodowli tkankowej w sterylnych warunkach przygotuj rozcieńczony roztwór trypsyny 0,02% trypsyny EDTA w DPBS i dodaj 5 mililitrów do niepowlekanego 10-centymetrowego naczynia. W kapturze do hodowli tkankowej umyj ogon w wystarczającej ilości 70% etanolu w 15-mililitrowej tubce, aby go przykryć, a następnie w DPBS. Umieść ogon płasko w naczyniu i użyj kleszczy, aby przytrzymać go na miejscu.Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie na ogonie wzdłuż jego osi podłużnej od podstawy do czubka. Użyj kleszczy, aby chwycić ogon i przytrzymaj go pionowo, a drugiej pary chwyć skórę obok nacięcia u podstawy ogona i oderwij ją z powrotem. Wykonaj to po obu stronach nacięcia, aż skóra będzie mogła zostać oderwana, pociągając w dół w kierunku czubka ogona.Przytrzymaj obrany ogon kleszczami nad naczyniem zawierającym roztwór trypsyny. Użyj nożyczek do preparowania, aby pokroić ogon na małe kawałki. Użyj nożyczek, aby rozdrobnić te kawałki w roztworze trypsyny na jeszcze mniejsze kawałki, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Aby ugasić trypsynę, dodaj dwie objętości pożywki DEX, DMEM z suplementami i antybiotykami. Zbierz całą zawartość naczynia do 50-mililitrowej tuby. Odwirować probówkę o temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający fragmenty ogona w 10 mililitrach świeżej pożywki FEX. Przenieść zawiesinę do naczynia pokrytego żelatyną. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i 4% tlenu, dodając świeżą pożywkę FEX co dwa dni.Obserwuj kulturę po pięciu do siedmiu dniach, w których fragmenty ogona przyczepiły się na dnie naczynia, a fibroblasty oddalają się od nich. Gdy pojawią się skupiska fibroblastów, delikatnie potrząśnij naczyniem, aby usunąć kawałki ogona. Odessać podłoże ze wszystkimi fragmentami kości, pozostawiając fibroblasty przyczepione do płytki.Dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki FEX i hoduj fibroblasty aż do zlewania się. Aby upewnić się, że w hodowli fibroblastów nie ma zanieczyszczenia krwiotwórczymi ogniwami progenitorycznymi, należy oddzielić komórki od płytki za pomocą trypsyny EDTA, jak opisano w manuskrypsie. Dodaj pożywkę i zbierz komórki, a następnie dodaj kulki magnetyczne z przeciwciałami.Użyj systemu separacji magnetycznej, aby usunąć komórki wyrażające markery hematopoetyczne. Uwzględnienie tego kroku jest absolutnie niezbędne, ponieważ eliminuje wszelkie HSPC, które mogą być obecne w kulturze, a tym samym prawdopodobieństwo wystąpienia jakichkolwiek wyników fałszywie dodatnich w dniu analizy FACS. Wysiewaj retrowirusowe komórki pakujące w ilości około 25 000 komórek na centymetr kwadratowy na naczyniu poddanym działaniu kultury tkankowej.Inkubuj komórki w DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego ranka usuń pożywkę i dodaj połowę objętości użytej do hodowli DMEM przez noc bez dodatków. Po południu sprawdź, czy komórki nie mają od 70 do 80% zbieżności wymaganej do transfekcji.Rozpocznij transfekcję od przygotowania mieszaniny dwa do jednego sześciu mikrogramów wektora ekspresyjnego PMX i trzech mikrogramów wektora pomocniczego zawierającego geny Gag, Pol i otoczkę dla każdego czynnika przeprogramowującego. Następnie, dla każdego czynnika przeprogramowującego, dodaj 300 mikrolitrów DMEM o temperaturze pokojowej w sterylnej probówce polistyrenowej. Następnie ostrożnie dodaj 27 mikrolitrów komercyjnego odczynnika do transfekcji o temperaturze pokojowej bezpośrednio do pożywki, aby uniknąć kontaktu ze ścianką probówki.Dodać mieszaninę plazmidu do probówki zawierającej odczynnik do transfekcji. Krótko zwirować i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie odwiruj mieszaninę DNA odczynnika do transfekcji.Dodaj go kroplami do retrowirusowych komórek opakowaniowych, tak aby był równomiernie rozłożony na kulturze i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 24 godziny po transfekcji usuń pożywkę i dodaj DMEM z 20% FBS i 100 jednostkami na mililitr penicyliny streptomycyny. 48 godzin po transfekcji zebrać supernatant i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 mikrometra.Rozpocznij transdukcję od wysiewu fibroblastów na końcach ogona w ilości 10 000 komórek na centymetr kwadratowy na 0,1% wstępnie pokrytych żelatyną szalkach w pożywce FET. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Podczas wykonywania tego etapu ważne jest, aby dodać cztery supernatanty retrowirusowe w równych proporcjach, aby upewnić się, że wszystkie cztery transgeny w równym stopniu przyczyniają się do procesu przeprogramowywania.Następnego dnia należy przygotować mieszaninę transdukcji, dodając najpierw jedną objętość supernatantu wirusowego dla każdego czynnika przeprogramowującego, uzupełnioną czterema mikrogramami na mililitr odczynnika do infekcji retrowirusowej do sześciu objętości pożywki FEX. Następnie odessać pożywkę FEX z kultury fibroblastów i dodać mieszaninę transdukcji. Inkubuj reakcję transdukcji przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach niedotlenienia przy 5% dwutlenku węgla i 4% tlenu.Po czterech godzinach odessać mieszaninę transdukcyjną i dodać świeżą pożywkę przeprogramowującą. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach niedotlenienia przez osiem dni, dodając świeżą pożywkę przeprogramowującą co dwa dni. Obserwuj udane przeprogramowanie z uzyskanymi klastrami komórek odłączonymi od płytki.Aby pobrać przeprogramowane komórki z naczynia do dalszej analizy, delikatnie pipetuj je w górę i w dół, a następnie zbierz komórki. Po udanym przeprogramowaniu iEP, komórki YFP-dodatnie są widoczne już po pięciu dniach od transdukcji. Stają się okrągłe, unoszą się z powierzchni płytki, zaczynają tworzyć skupiska i wykazują morfologię podobną do prekursora erytroidalnego.Hemoglobinizacja niektórych komórek jest widoczna przez dodatnie barwienie benzydyną. Niewielka frakcja wyraża specyficzny dla erytroidu marker powierzchniowy TER-119. Ósmego dnia można zaobserwować duże klastry YFP-dodatnie.IEP dnia ósmego mają bardziej zróżnicowany fenotyp erytroidalny niż iEP dnia piątego. Są one znacznie mniejsze, zgromadziły więcej hemoglobiny i wykazują zwiększoną ekspresję TER-119. Analiza ekspresji genów za pomocą qPCR iEP pobranych w ósmym dniu pokazuje, że prawie zamknęły one ekspresję genów fibroblastów i zwiększyły dynamikę wielu genów erytroidalnych.Po wykonaniu testów tworzenia kolonii BFU-e na przeprogramowanych komórkach, iEP w ósmym dniu tworzą dwa typy kolonii, wyraźnie czerwone i niewidocznie czerwone. Podczas gdy komórki z czerwonych kolonii wykazywały morfologię erytroblastów, komórki z nieczerwonych kolonii nie. Około jedna na 1 000 iEP w piątym dniu tworzyła czerwone kolonie, podczas gdy tylko około jedna na 10 000 kolonii utworzyła się z ósmego dnia iEP.Na wydajność przeprogramowania fibroblastów ogonowych lub TTF ma wpływ liczba pasaży. TTF, które zostały pasażowane dziewięciokrotnie, wykazały dramatyczne zmniejszenie zdolności do wytwarzania klastrów iEP w porównaniu z komórkami, które zostały pasażowane trzy razy. Co więcej, różne warunki hodowli mogą wpływać na skuteczność przeprogramowywania.Transdukowane TTF hodowane w normoksji są znacznie wolniejsze w przeprogramowaniu, a klastry IEP obserwuje się po 10 dniach, a nie po pięciu do ośmiu dniach. Po tej procedurze można zastosować takie metody, jak testy tworzenia kolonii, analiza qPCR i FACS w celu określenia stanu różnicowania komórek. Od czasu jej opracowania, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się erytropoezą w zrozumieniu przełączania między prymitywnymi i ostatecznymi komórkami erytroidalnymi u myszy i ludzi.

direct-lineage-reprogramming-adult-mouse-fibroblast-to-erythroid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Celowanie w komórki rezydujące w mózgu w celu bezpośredniego przeprogramowania linii otwiera nowe perspektywy dla naprawy mózgu. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób przygotować kultury wzbogacone o perycyty rezydujące w mózgu z kory mózgowej dorosłego człowieka i przekształcić je w indukowane neurony przez ekspresję czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa.

Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Poznaj metodę bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów myszy na erytroidalne progenitory. Ta technika umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej i ma zastosowanie w medycynie transfuzjologicznej.

Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Przeglądaj więcej filmów