Name: Immunizacja alpak (Lama pacos) antygenami białkowymi i wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania przeciwciał jednodomenowych u alpak Lama pacos poprzez immunizację antygenami i selekcję fagową. Technika umożliwia generowanie przeciwciał przeciwko pięciu różnym białkom z jednego zwierzęcia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (P30GM103486).

<ol><li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopharmacology+and+Immunotoxicology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li>
<li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li>
<li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpaca+%28Lama+pacos%29+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+%28VHHs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li>
<li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+M13+phage+display%3A+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li>
<li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685(2014).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li>
<li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23495938">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li>
<li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li>
<li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19460638">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li>
<li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li>
<li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li>
<li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li>
<li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li>
<li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies%3A+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li>
</ol>

Doktorzy Whiteheart i Hersh pracują na Uniwersytecie Kentucky i prowadzą rdzeń w Centrum Medycyny Molekularnej, który wytwarza przeciwciała jednodomenowe u alpak jako opłatę za usługę.

Jak wspomniano, wysokie powinowactwo i swoistość przeciwciał jednodomenowych, w połączeniu z ich łatwą ekspresją i stabilnością, sprawiają, że są one idealnymi odczynnikami do zastosowań w badaniach biomedycznych, jako krytyczne odczynniki biochemiczne, narzędzia diagnostyczne lub środki terapeutyczne18. W przypadku zastosowań komercyjnych należy wziąć pod uwagę pewne kwestie związane z własnością intelektualną. Ponadto przeciwciała jednodomenowe mogą być modyfikowane tak, aby zawierały określone markery lub znaczniki, które mogą być używane jako reportery w testach komórkowych lub w diagnostyce. Kluczem do tych zastosowań jest zdolność do wytwarzania specyficznych przeciwciał jednodomenowych przeciwko antygenom będącym przedmiotem zainteresowania. Opisano tutaj metodę wytwarzania przeciwciał jednodomenowych przy użyciu alpak, które wytwarzają silną odpowiedź immunologiczną przeciwko szerokiej gamie antygenów białkowych. Opisano zagadnienia dotyczące obchodzenia się ze zwierzętami i zgodności z przepisami. Są one kluczowe dla sukcesu w tej części procesu.
Istnieją inne strategie wytwarzania przeciwciał jednodomenowych, które nie wymagają immunizacji, ale zamiast tego wykorzystują biblioteki półsyntetyczne z różnymi systemami do selekcji i iteracyjnej optymalizacji powinowactwa19,20. Jednak zaletą korzystania z bibliotek pochodzących od uodpornionych zwierząt jest możliwość niezawodnego izolowania wysoce wzbogaconych, zróżnicowanych i wysoce powinowactwa przeciwciał jednodomenowych. Ponadto nie tylko obserwuje się znaczące różnice w sekwencji, ale znaczna większość wyizolowanych specyficznych przeciwciał jednodomenowych miała unikalne insercje i delecje, szczególnie w CDR3.
Co więcej, przeciwciała jednodomenowe mogą być wytwarzane w prostym procesie, który wymaga jedynie niewielkich wstrzyknięć antygenu, a po tym procesie zwierzęta mogą zostać zwrócone do stada. Warto zauważyć, że zwierzę może być swobodnie wykorzystywane do produkcji błonnika, ale musi być wykluczone z wykorzystania jako mięso (łańcuch pokarmowy dla ludzi) ze względu na stosowanie antygenów testowych i adiuwanta niezatwierdzonego przez FDA do produkcji przeciwciał w jednej domenie. Po zakończeniu procedury zwierzęta powinny być monitorowane przez tydzień, poddawane końcowemu badaniu weterynaryjnemu, a następnie mogą zostać zwrócone do swojego gospodarstwa macierzystego lub odpoczywać przez sześć miesięcy przed kolejną rundą produkcji przeciwciał jednodomenowych.

Alpaki i inni członkowie rodziny wielbłądowatych stały się popularnym źródłem do generowania przeciwciał do badań biomedycznych1,2,3. Wielbłądowate mają unikalny układ odpornościowy, ponieważ wytwarzają zarówno normalne przeciwciała, jak i przeciwciała tylko łańcucha ciężkiego, które umożliwiają wytwarzanie znacznie mniejszych przeciwciał jednodomenowych, zachowując przy tym wysoką swoistość i wysokie powinowactwo. W ten sposób przeciwciała wielbłądowatych stanowią wszechstronny odczynnik przydatny do różnych celów. Opisano tutaj metodę immunizacji alpaki i wytwarzania jednodomenowych przeciwciał przeciwko różnym antygenom białkowym. Przeciwciała te mogą być wytwarzane u wielbłądowatych w stosunkowo prostym procesie, który wymaga jedynie immunizacji poprzez małe wstrzyknięcia docelowego białka (antygenu) i pobranie krwi4. Następnie, budowa biblioteki, wyświetlanie faga M13 5 i panoramowanie w stosunku do rekombinowanego antygenu6 służy do izolowania i wytwarzania przeciwciał jednodomenowych o pożądanych cechach. Ponieważ proces ten wykorzystuje moc technologii wyświetlania fagów, pięć lub więcej antygenów może być jednocześnie wykorzystywanych na zwierzę, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt i związane z tym koszty.
Typowe dla ssaków przeciwciała lub immunoglobuliny to duże cząsteczki składające się z dwóch typów łańcuchów (2 ciężkie łańcuchy i 2 lekkie łańcuchy), które są połączone ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi. Przeciwciała te są stosunkowo duże, wykazując masę cząsteczkową ~ 140-190 kDa dla liczniejszych gatunków IgG od ludzi, myszy, kóz i królików. Ze względu na ich wielocząsteczkową strukturę, wysoką masę cząsteczkową i wiązania dwusiarczkowe, immunoglobuliny mogą być dość trudne do wyprodukowania w dużych ilościach, co sprawia, że ich koszt jest wysoki. W latach dziewięćdziesiątych odkryto, że wielbłądowate, do których należą wielbłądy, lamy i alpaki, wytwarzają, oprócz typowej immunoglobuliny typu ssaków, nową formę immunoglobuliny, która jest prostsza w budowie, posiadając tylko ciężkie łańcuchy7. Te unikalne przeciwciała wielbłądowate mają taką samą zdolność do specyficznego wiązania obcych substancji o wysokim powinowactwie, ale składają się tylko z jednego łańcucha białkowego8. Co więcej, przeciwciała wielbłądowate mogą być eksperymentalnie skrócone do jeszcze mniejszej jednostki fragmentu VHH, zwanego również przeciwciałem jednodomenowym9. Ze względu na swój niewielki rozmiar, przeciwciała jednodomenowe są przydatne w szerokim zakresie zastosowań w badaniach biomedycznych i są dostępne w różnych źródłach akademickich i komercyjnych1,10. Wyjątkiem wydaje się być Western blot, ponieważ przeciwciała jednodomenowe są częściej skierowane przeciwko epitopom zależnym od konformacji, które zwykle są tracone w warunkach denaturacji stosowanych w zachodnich blotach.
Ponieważ składają się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego, specyficzne przeciwciała jednodomenowe mogą być łatwo wybierane i łatwo wytwarzane w dużych ilościach jako białka rekombinowane u bakterii. Przeciwciała jednodomenowe mogą być również genetycznie modyfikowane tak, aby zawierały określone markery lub znaczniki, które mogą być używane jako "grupy reporterowe" do diagnozowania chorób11. Ta łatwość manipulacji w połączeniu z elastycznością ich stosowania sprawia, że przeciwciała jednodomenowe są ważnym zasobem dla naukowców na uniwersytetach i w innych miejscach.
Jako część rdzenia wspieranego przez National Institutes of Health, istniejące metody zostały dostosowane do produkcji przeciwciał jednodomenowych z alpak3,4. Alpaki mają znaczące zalety zarówno pod względem łatwości obsługi w porównaniu z większymi członkami rodziny wielbłądowatych, jak i dostępności. Alpaki są powszechnie hodowane na włókno i mięso, dzięki czemu można je pozyskać regionalnie od lokalnych hodowców alpak, których można zidentyfikować za pośrednictwem ich stron internetowych lub stanowych stowarzyszeń hodowców. Dostępne są dwie rasy alpak, Suri i Huacaya. Huacaya są bardziej powszechne i były używane w tym protokole, ale protokół ma ogólne zastosowanie do obu ras, a także szerzej do innych wielbłądowatych.

<table><tbody><tr><td>GERBU FAMA adijuwant</td><td>Biotechnik, Heidelberg, Niemcy&nbsp;</td><td>3003,6001</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do pobierania surowicy</td><td>Becton Dickinson</td><td>367983</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do pobierania krwi</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pobierania krwi Vacutainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>368652</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp Płytki immunologiczne</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG przeciwko lamom kozi sprzężone z HRP&nbsp;</td><td>Bethyl Labs</td><td>A160-100P</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże peroksydazy chromogennej TMB&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-03</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Spectramax</td><td>M5</td><td>Dopuszczalny jest dowolny czytnik obsługujący UV/VIS</td></tr><tr><td>Probówka do separacji lifocytów Uni-SepMAXI+</td><td>Novamed</td><td>U-17</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>kolumna Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny IV odwrotna transkrypcja&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>roztwór AEBSF</td><td>Biosynth</td><td>A-5440</td><td></td></tr><tr><td>TG1 wyświetla kompetentne komórki</td><td>Lucigen</td><td>60502</td><td></td></tr></tbody></table>

immunizacja alpak (lama pacos) antygenami białkowymi i wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

W tym manuskrypcie opisano i zademonstrowano metodę immunizacji alpaki oraz wykorzystanie metod biologii molekularnej do produkcji przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu. Wielbłądy, takie jak alpaki i lamy, stały się cennym zasobem dla badań biomedycznych, ponieważ wytwarzają nowy rodzaj przeciwciała opartego wyłącznie na łańcuchach ciężkich, które można wykorzystać do produkcji przeciwciał jednodomenowych. Ponieważ układ odpornościowy jest bardzo elastyczny, przeciwciała jednodomenowe mogą być wytwarzane przeciwko wielu różnym antygenom białkowym, a nawet różnym konformacjom antygenu, z bardzo wysokim stopniem swoistości. Te cechy, między innymi, sprawiają, że przeciwciała jednodomenowe są nieocenionym narzędziem w badaniach biomedycznych. Podano metodę wytwarzania przeciwciał jednodomenowych z alpak. Opisano protokół szczepień, pobierania krwi i izolacji komórek B. Limfocyty B są wykorzystywane do budowy immunizowanej biblioteki, która jest wykorzystywana do selekcji specyficznych przeciwciał jednodomenowych poprzez panoramowanie. Przypuszczalnie specyficzne przeciwciała jednodomenowe uzyskane przez panoramowanie są potwierdzane za pomocą testów pull-down, ELISA lub gel-shift. Powstałe przeciwciała jednodomenowe mogą być następnie używane bezpośrednio lub jako część zmodyfikowanego odczynnika. Zastosowania przeciwciał jednodomenowych i regentów opartych na przeciwciałach jednodomenowych obejmują zastosowania strukturalne, biochemiczne, komórkowe, in vivo i terapeutyczne. Przeciwciała jednodomenowe mogą być wytwarzane w dużych ilościach jako białka rekombinowane w prokariotycznych systemach ekspresyjnych, oczyszczane i stosowane bezpośrednio lub mogą być modyfikowane tak, aby zawierały specyficzne markery lub znaczniki, które mogą być używane jako reportery w badaniach komórkowych lub w diagnostyce.

Przedstawiony tutaj protokół został wykorzystany do generowania przeciwciał jednodomenowych przeciwko szeregowi antygenów białkowych. Na jedną alpaka wykorzystano pięć antygenów. Monitorowanie odpowiedzi immunologicznej wykazało, że większość antygenów wywoła silną odpowiedź zaczynającą się w trzecim tygodniu (Rycina 1). Pobranie krwi do produkcji i konstrukcja biblioteki po około sześciu tygodniach zapewnia optymalną równowagę w przypadku zwierząt, którym wstrzyknięto wiele antygenów. W przypadku każdego antygenu przeprowadzono dwie rundy panowania, a następnie przesiewano wyizolowane kolonie (Rycina 2). Sekwencjonowanie pozytywnych kolonii pozwoliło zidentyfikować zróżnicowane sekwencje przeciwciał jednodomenowych dla różnych antygenów. Przykładowo, w odniesieniu do antygenu referencyjnego, białka wiążącego maltozę (MBP), wyizolowano trzy unikalne klony (Rycina 3A). Jak często się obserwuje, przeciwciała jednodomenowe wykazują znaczną różnorodność sekwencji i bardzo zmienną długość CDR3 (Rycina 3). Cechy te są szczególnie istotne w oddziaływaniach przeciwciało jednodomenowe/antygen, co widoczne jest w przypadku kompleksu referencyjnego przeciwciało jednodomenowe/CX3CL117 (Rycina 3B).
Większość pełnych sekwencji przeciwciał jednodomenowych może zostać wyekspresjonowana i oczyszczona z wydajnością 1-10 mg/L hodowli (Rysunek 4A). Ze względu na różnorodność długości CDR3, różne przeciwciała jednodomenowe wykazują niewielkie różnice w masie cząsteczkowej. Potwierdzenie bezpośredniego wiązania oraz wydajności specyficznej dla danej aplikacji jest kluczowe. Na przykład, po dwóch rundach selekcji przeciwko Antygenowi B, zidentyfikowano panel przeciwciał jednodomenowych (Rysunek 2). Zidentyfikowano wiele identycznych sekwencji, a następnie przeciwciało jednodomenowe zostało wyprodukowane i oczyszczone. Przetestowano je następnie za pomocą bezpośredniego pull-downu z wykorzystaniem żywicy powinowactwa do antygenu, co wykazało silne wiązanie zależne od dawki (Rysunek 4B). Co istotne, przeciwciało jednodomenowe nie wykazało wiązania z żywicą kontrolną. Dane te wykazują bezpośrednią interakcję wiązania, która jest dobrze dostosowana do wychwytu powinowactwa zarówno w formacie pull-down, jak i ELISA.
<img alt="Wykres wyników testu ELISA, Absorbancja vs. rozcieńczenie surowicy, Antygen A/B, Przed uodpornieniem/Uodpornione, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Reprezentatywne monitorowanie odpowiedzi immunologicznej w odniesieniu do dwóch różnych antygenów, wykazujące znaczną specyficzną odpowiedź immunologiczną na odrębne antygeny u tego samego zwierzęcia. Wiele antygenów wykazuje silną odpowiedź już trzy tygodnie po rozpoczęciu immunizacji, przy czym większość z nich osiąga maksymalną odpowiedź po sześciu tygodniach. Okres sześciu tygodni pozwala również na dojrzewanie powinowactwa i jest rekomendowanym czasem dla pobrania krwi do produkcji oraz izolacji limfocytów B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy DNA, żel PCR wykazujący analizę klonów, prążki o wielkości 10-50 bp w celu walidacji genetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Potwierdzenie pozytywnych klonów metodą PCR. Startery obejmują MCS wektora pMES4, a pozytywny klon nanociała daje amplikon o długości ~50 bp (oznaczony gwiazdką *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza struktury białek; dopasowanie sekwencji, trójwymiarowy schemat białka, regiony CDR1-3, bioinformatyka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Sekwencje swoiste dla antygenu podkreślają różnorodność przeciwciał jednodomenowych alpaki. (A) Dopasowanie wybranych sekwencji przeciwciał jednodomenowych wyizolowanych do MBP do referencyjnego przeciwciała jednodomenowego 4XT1, z zaznaczonymi poniżej regionami szkieletowymi oraz regionami determinującymi komplementarność (Kabat). (BStruktura jednodomenowego przeciwciała alpaki 4XT1 związanego z CX3CL1 (PDB 4XT1), z podkreśleniem kluczowej roli zmiennych pętli CDR w specyficznym wiązaniu antygenu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy SDS-PAGE wykazujące prążki białkowe; analiza z gradientem stężeń antygenu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4Oczyszczanie i walidacja przeciwciał jednodomenowych. (A) SDS-PAGE oczyszczonych metodą IMAC przeciwciał jednodomenowych, porównująca różnorodne przeciwciała jednodomenowe. Różnice w masach cząsteczkowych wynikają przede wszystkim z różnej długości pętli CDR3. Obserwowane są również różnice w poziomach ekspresji, przy czym w przypadku mniejszości przeciwciał jednodomenowych odnotowano niską wydajność oczyszczonego białka. (B) Weryfikacja bezpośredniego wiązania za pomocą metody pull-down z wykorzystaniem powinowactwa do antygenu. Obserwuje się silne, zależne od dawki wiązanie przeciwciała jednodomenowego z żywicą sprzężoną z antygenem, czego nie stwierdzono w przypadku żywicy kontrolnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisano metodę produkcji przeciwciał jednodomenowych od alpak, w tym immunizację, pobieranie krwi, izolację komórek B i selekcję.

Immunizacja alpak (Lama pacos) antygenami białkowymi i wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Metody, które tutaj opisujemy, zostały przyjęte przez nasz sponsorowany przez NIH COBRE, University of Kentucky Protein Core Facility, aby pomóc naukowcom w wytwarzaniu przeciwciał jednodomenowych u alpak. Przeciwciała jednodomenowe są ważnym narzędziem wykorzystywanym do odpowiadania na kluczowe pytania w badaniach biomedycznych. Główną zaletą demonstrowanych przez nas technik jest to, że umożliwiają one wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych do maksymalnie pięciu różnych białek w jednej alpace.Implikacje tej techniki rozciągają się na zdrowie ludzkie i leczenie chorób, ponieważ te przeciwciała jednodomenowe mogą być stosowane jako terapia, szczepionki i diagnostyka. Najważniejszą przeszkodą dla większości uznanych badaczy biomedycznych jest zajmowanie się dużymi zwierzętami, takimi jak alpaki. Wizualna demonstracja obchodzenia się z alpaką, wstrzykiwania antygenów i pobierania krwi ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytworzenia przeciwciał jednodomenowych u tych wielbłądowatych.Procedurę zademonstrują doktor Jeff Smiley, lekarz weterynarii uniwersytetu, pani Kathy Boaz, technik weterynarii i pani Erin Jones, technik zwierząt laboratoryjnych. Postępowanie z krwią zostanie zademonstrowane przez doktora Martina Chao, pracownika naukowego. Prawdziwe historie tej produkcji to Blue Eyes, Big Boy, czyli pieszczotliwie zwany Gorylem, oraz Freddie, nasze alpaki z Kentucky.Na początek przykręj zwierzę kantarem i ołowiem. Następnie przytnij włosy alpaki za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia w kształcie półksiężyca wzdłuż podstawy szyi, od ramienia do ramienia. Ostrożnie chwyć alpakę za głowę i szyję i powoli wstrzykuj antygeny podskórnie za pomocą igły o rozmiarze 22 wzdłuż podstawy szyi, w pobliżu węzłów chłonnych łuku.Wykonaj pięć wstrzyknięć po około 200 mikrolitrów każde, w odległości około pięciu centymetrów od siebie. Następnie monitoruj zwierzę przez około 20 minut pod kątem oznak anafilaksji. Co tydzień należy sprawdzać miejsce wstrzyknięcia pod kątem zlokalizowanego stanu zapalnego w miejscach wstrzyknięcia.Aby pobrać krew, obetnij sierść alpaki i zdezynfekuj miejsce pobrania wacikami nasączonymi alkoholem. Delikatnie unieruchamiaj alpakę, upewniając się, że szyja jest wyprostowana i prosta. Używając występów brzusznych wyrostka poprzecznego kręgów jako punktu orientacyjnego, zamknij żyłę, wywierając nacisk tylko przyśrodkowo na wyrostek brzuszny.Następnie wbij igłę pod kątem 45 stopni, lekko przyśrodkowo do występu, w kierunku środka szyi. Manipuluj igłą, aż zacznie płynąć krew. Najpierw rozcieńczyć 15 mililitrów pobranej krwi pięcioma mililitrami PBS.Następnie pipetować krew do probówki do separacji limfocytów w celu wyizolowania limfocytów krwi obwodowej lub PBL poprzez wirowanie w gradiacji gęstości. Delikatnie usuń górną warstwę plazmy, zapisując ją w osobnej tubie. Następnie delikatnie usuń warstwę PBL i przenieś ją do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów.Dodaj 45 mililitrów wstępnie schłodzonego PBS do PBL i wiruj probówkę przez 20 minut w temperaturze 800 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant za pomocą pipety, pozostawiając osad zawierający limfocyty. Umyj osad jeszcze dwa razy pięcioma mililitrami wstępnie schłodzonego PBS, aby przygotować PBL do izolacji RNA.Korzystając z tego protokołu, wygenerowano przeciwciała jednodomenowe przeciwko szeregowi antygenów białkowych. Monitorowanie immunologiczne wykazało, że większość antygenów wykazywała silną odpowiedź rozpoczynającą się po trzech tygodniach, a optymalny czas na pobranie krwi to sześć tygodni. Sekwencjonowanie dodatnich kolonii pozwoliło zidentyfikować różne sekwencje przeciwciał jednodomenowych dla różnych antygenów.Na przykład wyizolowano trzy unikalne kolonie białka wiążącego maltozę antygenu referencyjnego. Ogólnie rzecz biorąc, przeciwciała jednodomenowe zawierały znaczną różnorodność sekwencji i bardzo zmienną długość pętli wiążących antygen. Cechy te są szczególnie ważne w jednodomenowych oddziaływaniach antygenu przeciwciała.Procedura ta pozwala na wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych dla maksymalnie pięciu antygenów na zwierzę. Dla każdego zwierzęcia wykorzystywana jest pojedyncza kolekcja krwi i budowa biblioteki. Selekcja oparta na wyświetlaniu fagów jest wykorzystywana do identyfikacji specyficznych dla antygenu, jednołańcuchowych przeciwciał.Podczas wykonywania zastrzyków antygenu i pobierania próbek krwi ważne jest, aby alpaki były w grupie, co zapewnia im spokój. Można to zrobić za pomocą kantarów i smyczy oraz wiązania ich w bliskiej odległości podczas zabiegów.

immunization-alpacas-lama-pacos-with-protein-antigens-production

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.

Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu

Test opsono-adherencji jest alternatywną metodą do oceny opsono-fagocytarnych metod zabijania, aby ocenić opsoniczne funkcje przeciwciał w procesie opracowywania szczepionek.

Test opsono-adherencji w celu oceny funkcjonalnych przeciwciał w procesie opracowywania szczepionki przeciwko Bacillus anthracis i innym otoczkowanym patogenom

Ten artykuł opisuje i demonstruje podawanie szczepionek donosowych oraz pobieranie mleka od królików w okresie laktacji (Oryctolagus cuniculus) jako sposób oceny odporności błony śluzowej w translacyjnie odpowiednim modelu immunizacji matki.

Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus)

Białko rekombinowanego przeciwciała wyrażone w komórkach pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO oraz przeciwciała monoklonalne wytworzone przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma mogą rozpoznawać i wiązać się z białkiem N (APN) aminopeptydazy świni.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko aminopeptydazie N w nabłonku błony śluzowej jelit świń

Tutaj prezentujemy alternatywny protokół aktywnego wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy C57BL/6, przy użyciu immunogennej epitopowej oligodendrocytów glikoproteiny mielinowej (MOG)35-55 zawieszonej w niekompletnym adiuwancie Freunda zawierającym zabity termicznie Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Poznaj metodę wytwarzania przeciwciał jednodomenowych u alpak Lama pacos poprzez immunizację antygenami i selekcję fagową. Technika umożliwia generowanie przeciwciał przeciwko pięciu różnym białkom z jednego zwierzęcia.

Immunizacja alpak (Lama pacos) antygenami białkowymi i wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu

Przeglądaj więcej filmów