Name: Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę przygotowania i analizy eksplantatów plastrów guza płuca myszy w badaniach przedklinicznych. Technika ta umożliwia ocenę odpowiedzi na leki w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca badawcza otrzymała wsparcie finansowe od umowy o grantna 115188 Wspólnego Przedsięwzięcia Inicjatywy Innowacyjnych Leków, stypendiów Doktoranckich Uniwersytetu Helsińskiego w dziedzinie biomedycyny (A.S.N.) oraz Fundacji Sigrid Juselius i Orion-Farmos (E.W.V.). Serdecznie dziękujemy naszym członkom konsorcjum platformy PREDECT tissue slice (www.predect.eu), a mianowicie Johnowi Hickmanowi, Heiko van der Kuipowi, Meng Dong, Emmie Davies, Simonowi Barry'emu, Wytske van Weerden i Hanneke van Zoggel, za wspólny rozwój technologii plastrów. Dziękujemy Taija af Hällström i Siv Knaappila za wsparcie w konfiguracji systemu rotatorów oraz Riku Turkki za wsparcie w analizie MATLAB. Dziękujemy Jouko Siro za wykonanie zdjęć na rysunku 1. Dziękujemy zespołowi FIMM WebMicroscope za skanowanie preparatów histologicznych oraz Centrum Zwierząt Laboratoryjnych za wsparcie w hodowli.

<ol><li>Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intratumor+heterogeneity+unravels+lung+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution.</a> Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549(2015).</li>
<li>Travis, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2015+World+Health+Organization+Classification+of+Lung+Tumors%3A+Impact+of+Genetic%2C+Clinical+and+Radiologic+Advances+Since+the+2004+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).</li>
<li>Wright, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+investigation+of+the+relation+between+the+clinical+and+tissue+culture+response+to+chemotherapeutic+agents+on+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer.</a> Cancer. 15, 284-293 (1962).</li>
<li>Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+organ+culture+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Studies on the organ culture of human tumors.</a> Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).</li>
<li>Reinbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BOrganotypic+differentiation+of+the+eye+of+the+chick+embryo+in+vitro%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+des+s%C3%A9ances+de+la+Soci%C3%A9t%C3%A9+de+biologie+et+de+ses+filiales%22%5BJournal%5D)">[Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro].</a> Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).</li>
<li>Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BOrganotypic+cultures+of+chick+embryo+lung%3B+some+histologic+and+histochemical+aspects%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Bollettino+della+Societa+Italiano+di+Biologia+Sperimentale%22%5BJournal%5D)">[Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects].</a> Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).</li>
<li>Bousquet, J., Meunier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BOrganotypic+culture%2C+on+natural+and+artificial+media%2C+of+fragments+of+the+adult+rat+hypophysis%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+des+s%C3%A9ances+de+la+Soci%C3%A9t%C3%A9+de+biologie+et+de+ses+filiales%22%5BJournal%5D)">[Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis].</a> Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).</li>
<li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Estes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+anti-death+receptor+5+%28DR5%29+antibody+%28TRA-8%29+against+primary+human+ovarian+carcinoma+using+a+novel+ex+vivo+tissue+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model.</a> Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).</li>
<li>Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> The British Journal of Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).</li>
<li>Jaamaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+recognition+via+activated+ATM+and+p53+pathway+in+nonproliferating+human+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue.</a> Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> The British Journal of Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+organotypic+slice+cultures+of+CNS+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue.</a> Current protocols in neuroscience. , Chapter 6 Unit 6.11 (2001).</li>
<li>Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+culture+method+for+following+development+of+tooth+germs+in+explant+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).</li>
<li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+In+Vitro+Culture%3A+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?</a> Stem Cells International. , 959807(2015).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li>
<li>Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+prostate+epithelium+lacks+Wee1A-mediated+DNA+damage-induced+checkpoint+enforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).</li>
<li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro%3A+histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Scientific Reports. 5, 17187(2015).</li>
<li>Narhi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+aspects+of+oncogenic+signalling+determine+the+response+to+combination+therapy+in+slice+explants+from+Kras-driven+lung+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours.</a> The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).</li>
<li>Majumder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+clinical+response+to+anticancer+drugs+using+an+ex+vivo+platform+that+captures+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity.</a> Nature Communications. 6, 6169(2015).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+Origin+Links+Histotype+Spectrum+to+Immune+Microenvironment+Diversity+in+Non-small-Cell+Lung+Cancer+Driven+by+Mutant+Kras+and+Loss+of+Lkb1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1.</a> Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).</li>
<li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li>
<li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).</li>
<li>Hoogt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+and+characterization+data+for+2D%2C+3D%2C+and+slice-based+tumor+models+from+the+PREDECT+project%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project.</a> Scientific Data. 4, 170170(2017).</li>
<li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+Impacts+the+Metabolic+Dependencies+of+Ras-Driven+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer.</a> Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opracowano różne złożone modele nowotworów in vitro, w tym hodowle 3D i organoidy, w celu podsumowania architektury i funkcji onkogennych tkanki nowotworowej in vivo 29,30. Jednak tworzenie kultur 3D lub organoidów wiąże się z dysocjacją tkanek i selektywnym wzrostem pojedynczego typu komórek lub kokulturą kilku wybranych typów komórek w sztucznym środowisku. W konsekwencji takie modele nie oddają w pełni zawiłości heterogeniczności guza i interakcji guz-zręb. Z drugiej strony organotypowe plastry guza utrzymują architekturę tkankową i złożoność biologiczną guza in situ, bez rozległych manipulacji. Ta zdolność wycinków tkanek do modelowania komórek nowotworowych w ich naturalnym mikrośrodowisku czyni je szczególnie atrakcyjnymi dla badań przedklinicznych. Wcześniej informowaliśmy o zoptymalizowanym przepływie pracy przy tworzeniu i analizie precyzyjnie ciętych plastrów guza i wykazaliśmy, że w porównaniu z podporami filtrów, obrotowa jednostka inkubacyjna poprawia żywotność krótkoterminowych mysich kultur plastrów NSCLC25,31. Jednak uprawa na jednostkach rotacyjnych jest trudna technicznie i wymaga stałego monitorowania. Przedstawiamy tutaj protokół generowania wycinków tkanki nowotworowej i praktycznego wykorzystania rotacyjnej jednostki inkubacyjnej do ich hodowli, a także towarzyszące metody monitorowania zdolności wycinków do wychwytywania biologii guza in situ, co jest warunkiem wstępnym przed testowaniem odpowiedzi na lek.
Kilka krytycznych etapów protokołu zapewnia integralność tkanek i żywotność wycinków guza. Jeśli normalna tkanka płucna otacza guz, wibratomizm może generować plastry o niespójnej grubości lub uszkadzać plastry z powodu różnic w teksturze i sztywności między tkankami normalnymi i nowotworowymi. Dlatego ważne jest, aby usunąć otaczającą normalną tkankę płucną przed pokrojeniem guza. Kolejnym krytycznym krokiem jest grubość krojenia, która powinna być starannie zoptymalizowana dla każdego rodzaju tkanki. Ponadto, po pokrojeniu, bardzo ważne jest, aby plasterek był umieszczony mniej więcej na środku siatki, aby zapewnić dokładne przerywane zanurzanie w pożywce hodowlanej i ekspozycję na tlen. Wreszcie, ważne jest, aby śledzić położenie plasterka podczas jego okresu rotacji, ponieważ plasterek może spaść do podłoża; W takim przypadku można podjąć dalsze działania, jak wyjaśniono w kroku 3.6 protokołu.
Oprócz obchodzenia się z tkanką w celu zapewnienia integralności, w analizie IHC istnieją również krytyczne etapy, które mają na celu zinterpretowanie, w jaki sposób plasterek przypomina tkankę natywną. Nasze poprzednie badanie wykazało, że mysie guzy NSCLC wykazują wyraźną heterogeniczność przestrzenną wewnątrz guza w onkogennych działaniach sygnalizacyjnych26. Oznacza to, że użycie przestrzennie odrębnych wycinków tkanek do próbek kontrolnych lub próbek poddanych działaniu leku może wpłynąć na wiarygodną interpretację danych eksperymentalnych, a zatem ściśle przylegające wycinki powinny być używane jako próbki kontrolne i testowe. Wykazaliśmy ponadto, że podczas gdy proliferacja lub onkogenna ekspresja fosfoproteiny w świeżo pokrojonych niehodowanych wycinkach 0 h była podobna do guzów in situ , hodowane plastry wykazywały zmienioną onkogenną ekspresję fosfoproteiny, specyficznie zmienione p4EBP1 i pSRC, a także zmienioną proliferację analizowaną przez Ki67 IHC. Zmieniona ekspresja p4EBP1 została podobnie wykryta w 24-godzinnych hodowlach ludzkich NSCLC i plastrów raka prostaty (Narhi i wsp., Rysunek uzupełniający S3B-S3C, S5 i S7)26. Wyniki te potwierdzają, że porównanie wycinków hodowlanych z ich najbliższym wycinkiem niehodowanym 0 h ma kluczowe znaczenie dla oceny zachowania funkcji guza in situ w wycinkach hodowanych.
Pomimo poprawy żywotności plastrów organotypowych25, system rotatorów ma ograniczenia pod względem technicznym. Umieszczanie wycinków tkanek na siatkach tytanowych jest trudniejsze w porównaniu z wkładami filtracyjnymi, a obrotowa jednostka inkubacyjna może nie być dostępna. Alternatywnie można zastosować stojące wsporniki filtrów, ale w takim przypadku należy analizować tylko stronę warstw wystawioną na działanie powietrza, ponieważ gradienty żywotności i niedotlenienia powietrza do filtra mierzone ekspresją HIF1α są szybko tworzone w kulturach warstwowych opartych na filtrze (Davies i wsp., Rysunek 5 i Rysunek 7A-7B)25. Ponadto wykazaliśmy, że kultury warstw guza mogą wykazywać zmienioną proliferację i aktywność sygnalizacji onkogennej w porównaniu z ich rodzimymi nowotworami26, prawdopodobnie z powodu reakcji gojenia się ran lub adaptacji metabolicznej plastrów do hodowli ex vivo 32. Chociaż ogólne cechy morfologiczne mysich guzów NSCLC utrzymywały się podczas 72 godzin hodowli, zmiany proliferacyjne wywołane kulturą mogą wpływać na dokładną klasyfikację uprawianych plastrów. W związku z tym plastry tkanek powinny być wykorzystywane tylko do krótkoterminowych badań funkcjonalnych.
Zastosowanie rotacyjnej jednostki inkubacyjnej przynajmniej częściowo ratuje żywotność wewnątrz plastra lub gradienty ekspresji biomarkerów, szczególnie w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli. Po walidacji pod kątem integralności i funkcjonalności dostarcza materiał tkankowy do badań funkcjonalnych, takich jak badania nad leczeniem farmakologicznym. Oprócz profilowania odpowiedzi na lek, zmieniona ekspresja docelowa po leczeniu farmakologicznym może również korzystnie wpłynąć na walidację przeciwciał. Jest to szczególnie istotne w przypadku wykrywania mysich epitopów z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi, ponieważ mają one tendencję do dawania silnie barwiącego tła. Ponadto dobrze zwalidowane przeciwciała są niezbędne do uzyskania wiarygodnych i odtwarzalnych danych w warunkach diagnostycznych i klinicznych. Tak więc modulacja obfitości lub fosforylacji odpowiednich epitopów po leczeniu farmakologicznym w wycinkach tkanek zapewnia przydatne praktyczne zastosowanie w walidacji przeciwciał. Główną zaletą kultur warstw guza jest możliwość modelowania funkcji rozmieszczonych przestrzennie, w tym onkogennych działań sygnalizacyjnych lub odpowiedzi na leki w komórkach nowotworowych lub zrębowych, co czyni je atrakcyjnym modelem ex vivo . Jednak plastry obracają się podczas uprawy, a proces uprawy może jeszcze bardziej uszkodzić tkankę, szczególnie na krawędziach. W związku z tym trudno jest precyzyjnie nałożyć na siebie wybarwione biomarkerami obrazy IHC wycinków 0 h z nekrotycznymi regionami wykrytymi w hodowanych wycinkach, co utrudnia precyzyjne powiązanie aktywności biomarkerów przestrzennych z reakcją na lek. Ponadto reakcje martwicze wywołane przez nowotwór, indukowane hodowlą i lekiem są nie do odróżnienia przynajmniej w mysich wycinkach tkanek NDRP, co utrudnia dokładną ocenę ilościową przestrzennych odpowiedzi na leki. Wreszcie, zastosowanie kultur plastrów guza pozwala badaczowi na testowanie wielu związków na tym samym guzie, bez konieczności leczenia zwierząt, udoskonalając, redukując i zastępując w ten sposób eksperymenty na zwierzętach laboratoryjnych.
Jako przyszłe zastosowanie, opisany protokół może zostać zaadaptowany do klinicznych próbek guzów litych. Prawdopodobnie konieczne będą dalsze modyfikacje lub optymalizacje w zależności od typu tkanki, począwszy od dostosowania ustawień wibratomu, w tym grubości plastra i prędkości wibracji, aby zoptymalizować je pod kątem tekstury lub sztywności guza. Ponadto zapotrzebowanie na składniki odżywcze i czynniki wzrostu może się różnić w zależności od tkanki nowotworowej. Na przykład plastry raka piersi zostały wyhodowane z insuliną uzupełnioną w pożywce13,18. Biorąc pod uwagę, że podczas operacji lub biopsji uzyskuje się ograniczoną ilość materiału tkankowego, optymalizacja kultur plastrów guza pochodzących od pacjenta może być trudna ze względu na trudności w uzyskaniu wystarczającej liczby powtórzonych próbek. Co więcej, powtarzalność danych jest również kwestionowana przez wyraźną niejednorodność próbek między pacjentami, szczególnie w odniesieniu do odsetka komórek nowotworowych w porównaniu z regionami zwłóknieniowymi lub naciekami zrębu, a także martwiczymi składnikami tkanki. Wreszcie, zastosowanie plastrów guza w warunkach diagnostycznych wymagałoby zbadania, w jakim stopniu odpowiedzi na lek w eksplantatach plastrów biopsji przed leczeniem odpowiadają odpowiedziom in vivo po leczeniu.

Tkanki guzów litych, w tym rak płuc, wykazują niejednorodność genetyczną i fenotypową oraz posiadają złożone mikrośrodowiska1,2. Wzajemne oddziaływanie między komórkami nowotworowymi a otaczającym je mikrośrodowiskiem wpływa na mechanizmy wrażliwości i oporności na leki3. Podkreśla to zapotrzebowanie na modele przedkliniczne, które mogą dokładnie modelować złożoność biologiczną i funkcje działające w rodzimych nowotworach. Precyzyjnie pokrojone plastry pochodzące bezpośrednio ze świeżych guzów stanowią unikalny zasób, ponieważ mają główną zdolność do reprezentowania biologii in vivo, przynajmniej przez krótki okres czasu, w tym fenotypów rozmieszczonych przestrzennie w pojedynczym guzie. Wycięte guzy kliniczne są jednymi z niewielu spersonalizowanych próbek, które można uzyskać od pacjenta z rakiem, a ich zastosowanie diagnostyczne zasługuje na kontrolę.
Historia kultur organotypowych sięga początkuXIX wieku, kiedy to ludzkie guzy wewnątrzczaszkowe były ręcznie cięte na kawałki tkanek i hodowane przy użyciu tak zwanej metody wiszącej kropli. Fragmenty tkanek dołączono do szkiełka nakrywkowego i pozostawiono do zanurzenia w heparynizowanym ludzkim osoczu, po czym szkiełka nakrywkowe odwrócono, zapieczętowano i hodowano przez kilka tygodni4. Od tego czasu ręcznie wycinane kawałki guza były hodowane przy użyciu wielu innych metod, takich jak skrzepy osocza5, w płynnych mediach6, lub na filtrach o wielkości porów 0,45 μm6. Termin "organotypowy" został po raz pierwszy użyty w 1954 roku, w badaniu nad różnicowaniem siatkówki zarodka pisklęcia eye7. Następnie przeprowadzono badania, w których wykorzystano eksplantaty płuc i serca pochodzące z zarodków piskląt8 oraz eksplantaty mózgu od dorosłych szczurów9.
Opisano różne metody krojenia, a mianowicie ręczne rozdrabniacze10,11, krajalnica do tkanek Krumdieck12,13, oraz vibratomes11,14,15,16. Krajalnica do tkanek Krumdieck generuje cylindryczne rdzenie tkanek, które są następnie krojone na okrągłe plastry tkanek za pomocą mikrotomu. Z drugiej strony wibratom wykorzystuje mikrotom z wibrującym ostrzem. W badaniu na wycinkach wątroby wykazano, że wibratom Leica generuje bardziej powtarzalne i spójne wycinki w porównaniu z slicerem Krumdieck15. Zastosowano grubości warstw od 250 do 500 μm, a badania wskazują na utrzymanie żywotności i cech morfologicznych nawet do 16 dni14,10,17,18. Jednak nowotwory mają zmienne profile metaboliczne, które mogą wpływać na zapotrzebowanie na składniki odżywcze, a parametry takie jak sztywność tkanek i skład macierzy mogą wpływać na napowietrzenie i przepływ składników odżywczych. Jest zatem prawdopodobne, że każdy typ tkanki wymaga optymalizacji warunków krojenia i hodowli.
Różne metody uprawy były używane do wspierania kultur warstwowych: i) stacjonarna hodowla międzyfazowa, zwana również kulturą podporową stagnacji, w której plastry są umieszczane na półporowatej wkładce membranowej zanurzonej w pożywce. W tym przypadku górna część plastrów jest wystawiona na działanie powietrza, podczas gdy spód jest uzupełniany składnikami odżywczymi za pośrednictwem porowatej wkładki14,19; ii) metoda kielni, pierwotnie opracowana do hodowli całych narządów lub wycinków tkanek embrionalnych. W tym przypadku plastry umieszcza się na bawełnianym arkuszu lub filtrze wspartym na metalowej siatce, a filtr moczy się w pożywce hodowlanej. Aby tkanki były wilgotne, na plastry nakłada się cienką warstwę podłoża 20,21,22. Te dwie pierwsze są tak zwanymi kulturami interfazowymi powietrze-ciecz; iii) kultury rolkowe, w których plastry są umieszczane wewnątrz płaskiej strony plastikowej rurki zawierającej pożywkę, a powolny obrót rurki zapewnia, że tkanka jest pokryta pożywką podczas pierwszej części cyklu lub napowietrzona podczas drugiej23; iv) obrotowe jednostki inkubacyjne, w których plastry są okresowo poddawane działaniu pożywki ze składnikami odżywczymi i napowietrzaniem. W odróżnieniu od rurek rolkowych, w tej metodzie plastry umieszcza się na porowatych siatkach tytanowych umieszczonych na 6-dołkowych płytkach z podłożem hodowlanym24.
Wycinki tkanki pochodzące z wyciętych guzów litych logicznie prezentują atrakcyjny model ex vivo, w którym można przetestować odpowiedź na leczenie środkami przeciwnowotworowymi, ponieważ pozwalają na ocenę żywotności, aktywności szlaku docelowego i profili molekularnych konkretnego guza w obecności jego natywnego mikrośrodowiska guza. Jednak, aby ocenić, czy odpowiedzi na lek mierzone w wycinkach guza są predykcyjne dla odpowiedzi in situ, ważne jest, aby ocenić, w jakim stopniu wycinki tkanki zachowują specyficzne dla nowotworu funkcje biologiczne, takie jak proliferacja komórek, różnicowanie komórek specyficzne dla histopatologii lub onkogenne aktywność sygnalizacyjne. Wpływ naprężeń mechanicznych wywołanych podczas przygotowywania plastrów, obchodzenia się z nimi lub adaptacji wywołanych hodowlą na zarówno jakość, jak i funkcje biologiczne wycinków tkanek to fundamentalne pytania, ściśle związane ze zdolnością do wdrażania plastrów pochodzących z guza do diagnostyki funkcjonalnej.
Nasz projekt konsorcjum PREDECT (http://www.predect.eu, finansowany przez IMI), postanowił systematycznie odpowiedzieć na te fundamentalne pytania, badając eksplantaty krojące z różnych źródeł. Wykorzystując wycinki pochodzące z modeli raka piersi, prostaty i płuc, w ramach wspólnego wysiłku wykorzystano odczyty jakościowe, a także ilościowe odczyty oparte na hematoksylinie i eozynie (H&E), aby wykazać zapotrzebowanie na tlen atmosferyczny i stojące nośniki filtrów, aby utrzymać żywotność hodowanych plastrów do 72 godzin. Co więcej, analizy immunohistochemiczne (IHC) na hodowanych wycinkach ujawniły gradienty żywotności wewnątrz wycinków, potwierdzone gradientami martwicy w wycinkach pochodzących z mysiego niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC), gradientów receptora estrogenowego (ER), HIF1α i γH2AX w wycinkach raka piersi lub gradientów ekspresji receptora androgenowego (AR) w wycinkach raka prostaty25. Co ciekawe, gradienty żywotności wewnątrz warstwy w 24-godzinnych kulturach mysiego NSCLC zostały uratowane przez hodowlę w rotacyjnej jednostce inkubacyjnej, a nasze ostatnie badanie wykazało, że żywotność została wydłużona do 72 h26. Szczególnie górna strona pozostała najbardziej żywotna26, co potwierdza, że analizy odpowiedzi na lek na wycinkach najlepiej przeprowadzać po tej stronie tkanki.
Chociaż pozostaje pytanie, jak daleko wycinki tkanek mogą podsumować funkcje guza in situ, były one szeroko stosowane do testowania odpowiedzi na środki przeciwnowotworowe, w tym leki celowane, przeciwciała monoklonalne i środki chemioterapeutyczne10,11,13,14,18,27. Ostatnio pokazaliśmy, że mysie plastry NSCLC wykazują dynamiczne zmiany w proliferacji i aktywności sygnalizacji onkogennej po hodowli w porównaniu do świeżo ściętych plastrów 0 h26. Wskazuje to, że ważne jest, aby zbadać, czy docelowe funkcje biologiczne in situ są odpowiednio zachowane podczas uprawy, przed badaniami perturbacji. Pomimo tych ustaleń wykazaliśmy, że plastry guza mogą modelować odpowiedź przestrzenną na terapie celowane, podczas gdy leczenie farmakologiczne pozostaje krótkie (24 godziny) i rozpoczyna się na początku hodowli26. Poniższy protokół opisuje ważne aspekty walidacji istotne dla tworzenia i analizy kultur plastrów guza, przed ich zastosowaniem w testach farmakologicznych leków.

<table><tbody><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Roztwór streptomycyny</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 medium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21765-037</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina 200mM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy (GLUture)</td><td>Abbott</td><td>32046-90-1</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200 S Wibrujące ostrze mikrotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do krojenia</td><td>VWR</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>Siatki tytanowe</td><td>Albamma Research and Development</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Inkubacja plastrów jednostka</td><td>Albamma Research and Development</td><td>MD2500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm płytka do hodowli</td><td>tkankowych Sarstedt</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Igły podskórne Neolus</td><td>Terumo Neolus</td><td>NN2525R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka sokoła</td><td>Greiner&nbsp;</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>F/1501/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Trójdzielny papier kasetowy histo</td><td>Diagnostyka nowotworów</td><td>DX26280</td><td></td></tr><tr><td>Kasety Histo</td><td>VWR</td><td>720-2199&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KOS Mikrofalowy wielofunkcyjny procesor tkanek</td><td>Milestone SRL</td><td>CAT307EN-003</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HM355S Prowadnice</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Ultra plus</td><td>VWR</td><td>631-0099</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>PT-Module</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina dla H& Barwienie E</td><td>Merck</td><td>1.09249.0500</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina do barwienia przeciwdziałającego</td><td>Dako</td><td>S3309</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>NKX2-1 przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab133638</td><td>Numer serii: GR98031-12</td></tr><tr><td>pERK 1/2</td><td>przeciwciało Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>CST 4370</td><td>Numer partii: 17</td></tr><tr><td>p4EBP1</td><td>przeciwciało Sygnalizacja komórkowa Technologie</td><td>CST 2855</td><td>Numer serii: 20</td></tr><tr><td>BrightVision poly-HRP Kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi</td><td>ImmunoLogic</td><td>VWRKDPVR-110HRP</td><td></td></tr><tr><td>Montaż medicum pertex</td><td>VWR</td><td>MEDT41-4021-00</td><td></td></tr><tr><td>DAB&nbsp;</td><td>ImmunoLogic</td><td>VWRKBSO4-110</td><td></td></tr><tr><td>Dactolisib (NVP BEZ-235)</td><td>Selleckchem</td><td>S1009</td><td></td></tr><tr><td>Selumetinib (AZD2644)</td>Skaner slajdów <td>Selleckchem</td><td>S1008</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td><a href="https://se.mathworks.com/products/matlab.html">https://se.mathworks.com/ products/matlab.html</a></td></tr><tr><td>3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER&nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s</td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu komórkowego CellProfiler</td><td>http://cellprofiler.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypowe pierwotne kultury eksplantatów tkankowych, które zawierają precyzyjnie wycięte plastry, reprezentują trójwymiarową (3-D) architekturę tkanki, jak również wielokomórkowe interakcje natywnej tkanki. Wycinki tkanek natychmiast wycięte ze świeżo wyciętych guzów zachowują przestrzenne aspekty niejednorodności wewnątrzguzowej (ITH), co czyni je użytecznymi substytutami biologii in vivo. Staranna optymalizacja przygotowania plastrów tkanek i warunków hodowli ma fundamentalne znaczenie dla predykcyjnego potencjału diagnostycznego eksplantatów plastrów guza. Pod tym względem modele mysie są cenne, ponieważ zapewniają stały przepływ materiału nowotworowego do przeprowadzania powtarzalnych i powtarzalnych eksperymentów. Protokół ten opisuje hodowlę wycinków tkanek pochodzących z mysiego guza płuc przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej, systemu, który umożliwia przerywaną ekspozycję tkanek na tlen i składniki odżywcze. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że zastosowanie obrotowych jednostek inkubacyjnych poprawia żywotność tkanek w porównaniu z innymi metodami hodowli, w szczególności pływającymi plastrami i stojącymi podporami filtrów. W tym miejscu pokazujemy ponadto, że grubość plastra wpływa na żywotność plastrów hodowanych, co sugeruje, że optymalizacja grubości plastra powinna być przeprowadzona dla różnych typów tkanek. Wyraźne ITH w odpowiednich funkcjach onkogennych, takich jak aktywność sygnalizacyjna, naciekanie komórek zrębu lub ekspresja markerów różnicowania, wymaga oceny sąsiednich wycinków tkanek pod kątem ekspresji markerów zmienionych przez leczenie farmakologiczne lub samą hodowlę. Podsumowując, protokół ten opisuje wytwarzanie mysich plastrów guza płuc i ich hodowlę na obrotowej jednostce inkubacyjnej oraz pokazuje, w jaki sposób plastry powinny być systematycznie analizowane pod kątem ekspresji heterogenicznych markerów tkankowych, jako warunek wstępny przed badaniami odpowiedzi na lek.

Rysunek 1 przedstawia schemat postępowania w zakresie generowania, hodowli i analizy precyzyjnie ciętych plastrów tkankowych pochodzących z guzów niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) myszy. W tej demonstracji wykorzystaliśmy guzy z genetycznie zmodyfikowanego modelu mysiego (GEMM) z warunkową aktywacją KrasG12D wraz z utratą Lkb1 (znana również jako kinaza serynowo-treoninowa 1), w dalszej części tekstu określana jako KL. Rozmnażanie myszy oraz inicjację guzów płuc przeprowadzono zgodnie z opisem w26,28. Rysunek 2A demonstruje wpływ grubości przekroju tkanki na żywotność skrawków hodowanych przez 24 h przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej. Wyniki wykazują, że 160 µm cienkie skrawki zawierają duże obszary martwicze w obrębie całego skrawka. Ponadto, 250 µm cienkie plastry wykazują gradient martwicy w obrębie plastra w porównaniu do 200 µm cienkie plastry. Prawdopodobnie niska ogólna żywotność najcieńszych 160 µm jest spowodowane błędami technicznymi podczas nakładania plastrów na siatki, ponieważ są one delikatne i mają tendencję do zwijania się. Z drugiej strony, gdy plastry są zbyt grube, mogą wystąpić niedobory w dyfuzji tlenu lub składników odżywczych przez ich strukturę, co w eksplantach NSCLC mysiej przejawia się w postaci gradientu martwicy.25Należy jednak zauważyć, że z jednego guza można uzyskać skrawki o różnej grubości, mimo zastosowania identycznych ustawień wibratomu. Zaleca się zatem analizę wielu powtórzeń z różnych próbek guzów. Co istotne, każdy typ tkanki wymaga optymalizacji grubości skrawka w celu osiągnięcia maksymalnej żywotności, ponieważ tekstura i twardość tkanki mogą wpływać na dotlenienie oraz przepływ składników odżywczych. Rysunek 2B-2°C ilustruje ilościowe analizy IHC ekspresji NKX2-1, markera dobrze zróżnicowanego gruczolakoraka płuca (AC) w próbkach hodowanych do 72 h oraz odpowiadających im skrawkach w czasie 0 h. Wyniki pokazują, że ekspresja NKX2-1 nie uległa istotnej zmianie w hodowanych skrawkach w porównaniu ze skrawkami niehodowanymi w czasie 0 h, co sugeruje, że proces hodowli nie wpływa w sposób wyraźny na stopień zróżnicowania tkanki nowotworowej AC. Rycina 2D wykazuje użyteczność cienkich przekrojów tkanki nowotworowej w ocenie skuteczności leków celowanych. Niedawno wykazaliśmy, że Kras mutanty mysich AC wykazują wysoką ekspresję fosforylowanego ERK1/2 (oznaczającą zwiększoną aktywność szlaku MAPK) w porównaniu z guzami gruczołowo-płaskimi (ASC), podczas gdy ekspresja fosforylowanego 4EBP1 (oznaczająca aktywność mTOR) jest na podobnym poziomie w obu typach guzów, AC i ASC26Aby sprawdzić, czy szlaki te mogą być skutecznie celem w przypadku skrawków tkanek, skrawki tkanek KL AC poddano działaniu DMSO lub przemierzonych ilości związków, mianowicie 0,1 – 1 µM daktolisib w celu ukierunkowania na szlak mTOR lub 0,05–0.5 µM selumetinib w celu ukierunkowania na szlak MAPK. Wyniki pokazują, że 1 µM dactolisib lub 0.5 µM selumetinibu są skuteczne w hamowaniu fosforylacji odpowiednio 4EBP1 lub ERK1/2. Ponadto zależne od dawki hamowanie docelowych fosfoprotein wskazuje, że skrawki tkanek mogą być również wykorzystywane do walidacji przeciwciał specyficznych dla fosforylacji.
<img alt="Proces krojenia guzów płuca; sekcjonowanie wibratomie; przygotowanie do hodowli tkanek; tworzenie bloków FFPE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przebieg procesu tworzenia i analizy eksplantów w formie plastrów pochodzących z guzów niedrojnokomórkowego raka płuca (NSCLC) u myszy. (A) Schemat opisujący pobieranie i przygotowanie płuc z guzami do krojenia. Płaty płuc są pobierane z myszy, a tkanka nowotworowa jest oddzielana od tkanki prawidłowej. Czarna grota strzałki i gwiazdka wskazują odpowiednio guzy o wielkości około 4 mm i 1 mm. Biała grota strzałki wskazuje tkankę płucną przyklejoną do powierzchni uchwytu na próbkę. Czerwona strzałka wskazuje dodatkowy fragment prawidłowej tkanki płucnej służącej jako podparcie, aby utrzymać guz w pozycji pionowej. (B) Krojenie wibratomie i zbieranie skrawków tkanki. Biała strzałka wskazuje kierunek krojenia. Zbieranie kolejnych skrawków do płytki 24-dołkowej zawierającej zimny roztwór HBSS + P/S. Skrawki mogą być hodowane przez różne okresy czasu (tutaj 24–72 h) w celu oceny ekspresji markerów specyficznych dla guza podczas hodowli (górny rząd) lub mogą być wykorzystane do prowadzenia eksperymentów z zastosowaniem leków. C: kontrola nośnikiem, T: traktowanie lekiem (dolny rząd). (C) Umieszczanie plasterka tkanki do hodowli z wykorzystaniem obrotowych jednostek inkubacyjnych. Przechylić płytkę 6-dołkową tak, aby część pożywki pokryła górną część siatki, umieścić plasterek tkanki na środku siatki na powierzchni pożywki, a następnie rozprostować plasterek za pomocą pęsety. Należy upewnić się, że płytki 6-dołkowe są wyważone, aby zapewnić płynny cykl obrotowy. X: oznacza nieprawidłowo, a <img alt="równowaga statyczna, diagram ΣFx=0, ilustracja równowagi momentów sił, analiza układu dźwigni" src="/files/ftp_upload/58569/58569eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">: wskazuje prawidłowe ustawienie przekroju. (DZdjęcie bloku FFPE z wycinkiem guza. Czarna strzałka wskazuje zatopiony w parafinie wycinek tkanki zabarwiony hematoksyliną.E) Schematy przedstawiające kolejność sekcjowania skrawków w blokach FFPE; skrawki te mogą być poddane obróbce w celu oceny żywotności tkanki oraz ekspresji specyficznych dla nowotworu biomarkerów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza żywotności i ekspresja NKX2-1 w plastrach tkanek NSCLC; obrazy mikroskopowe, analiza wykresów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58569/58569fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ocena żywotności i ekspresji markerów specyficznych dla histotypu oraz celowana terapia lekową na skrawkach tkanek NSCLC. (A) Reprezentatywne H&amp;Obrazy E przekrojów AC NSCLC o wskazanych grubościach, hodowanych przez 24 h. 200 µm cienkie plastry zachowują lepszą żywotność w porównaniu do 160 µm lub 250 µm cienkie przekroje. Ciemnoniebieski kolor oznacza H&amp;E barwi żywą tkankę, a kolor różowy oznacza pseudokolorowane obszary nekrotyczne. Kolor jasnoniebieski wskazuje obszary wykluczone z analizy ze względu na słabą jakość tkanki lub obecność zrębienia włóknistego. T1 i T2 reprezentują powtórzenia biologiczne pochodzące z dwóch różnych guzów. Pasek skali = 500 µm. (B) Reprezentatywne obrazy IHC wykazujące ekspresję NKX2-1 w skrawkach AC hodowanych przez wskazane punkty czasowe. Strzałka wskazuje obszar przedstawiony w większym powiększeniu. Wyniki pokazują, że ekspresja NKX2-1 w hodowanych skrawkach nie uległa zmianie w porównaniu ze skrawkami z punktu 0 h. Pasek skali = 500 µm i 50 µm odpowiednio dla małych i dużych powiększeń. (C) Ilościowe określenie danych przedstawionych w (B). (D) Reprezentatywne obrazy IHC ekspresji fosforylowanego 4EBP1 lub ERK1/2 w skrawkach z godziny 0, lub w skrawkach traktowanych DMSO lub przemierzonymi ilościami dactolisibu (dact, górny rząd) lub ekspresji fosforylowanego ERK1/2 w skrawku z godziny 0, lub w skrawkach traktowanych DMSO lub selumetinibem (sel, dolny rząd). Czarne kwadratowe ramki wskazują obszary przedstawione w większym powiększeniu. Pasek skali = 1 mm lub 50 µm odpowiednio dla małego lub dużego powiększenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58569/58569fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach przedklinicznych, w których badania odpowiedzi na lek w eksplantatach plastrów guza mogą służyć celom diagnostycznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że eksplantaty w plasterkach mogą przez krótki czas modelować złożoną biologię tkanek natywnych, w tym funkcje rozmieszczone przestrzennie. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat wykorzystania wycinków z mysich guzów płuc, można ją również zastosować do innych typów tkanek, w tym tkanek ludzkich.Aby rozpocząć, przygotuj wibratomium i wykonaj VibraCheck zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji. Następnie napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki jednym mililitrem roztworu soli Hank's Balanced uzupełnionego penicyliną i streptomycyną i utrzymuj płytkę na lodzie. Włóż igły o rozmiarze 25 w wszystkie cztery łapy uświęconej myszy umieszczonej na styropianowej pokrywie, tak aby klatka piersiowa była odsłonięta, a zwierzę rozciągnięte.Rozpyl 70% alkohol na powierzchnię odsłoniętej skóry. Użyj nożyczek ustawionych pod kątem, aby rozciąć skórę od brzucha w kierunku klatki piersiowej i aż do szyi. Rozciągnij skórę po obu stronach za pomocą kleszczy i włóż igły o rozmiarze 25.Rozetnij okolicę brzucha. Następnie rozetnij klatkę piersiową i przeponę, aby odsłonić płuco i serce. Odsłoń tchawicę, odcinając otaczającą tkankę.Wypreparuj płuca razem z sercem. Umieść chusteczki w 50-mililitrowej probówce zawierającej 30 mililitrów lodowatego HBSS uzupełnionego Pen-Strep umieszczonym na lodzie i przejdź do następnego kroku tak szybko, jak to możliwe. Teraz przenieś płuca zawierające guz na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej.Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby oddzielić płaty płuc i wybierz płaty z guzami na powierzchni do krojenia. Umieść płat płuca z tkanką nowotworową na kawałku bibuły filtracyjnej, aby uniknąć poślizgnięcia się i wytnij część normalnego płuca lub dodatkową tkankę nowotworową otaczającą guz za pomocą sterylnego skalpela, aby wygenerować płaską powierzchnię kawałka tkanki. Zanurz płaską stronę w kropli kleju cyjanoakrylowego i zamontuj ją na uchwycie próbki wibratomu tak, aby guz był skierowany w stronę ostrza w pozycji pionowej i pozostaw do wyschnięcia na dwie do trzech minut.Umieść uchwyt na próbkę wibratomu w metalowej tacy buforowej. Napełnij tackę zimnym HBSS uzupełnionym Pen-Strep, aż tkanka zostanie zanurzona w buforze. Przykryj tackę buforową pokrywką z pleksiglasu, która jest dostarczona z instrumentem i umieść tackę w białej łaźni lodowej i dodaj lód, aby chusteczka była chłodna podczas krojenia.Podłącz białą kąpiel lodową do wibratomu. Następnie wybierz odpowiednie ustawienia krojenia i rozpocznij krojenie. Ustaw ostrze wibratomu w pozycji krojenia i ustaw okno krojenia.Użyj sterylnych kleszczyków, aby zebrać plastry na 24-dołkowej płytce wypełnionej jednym mililitrem HBSS uzupełnionym Pen-Strep na dołek i trzymaj na lodzie. Śledząc kolejność krojenia, zaznacz każdą studzienkę na 24-dołkowej płytce zgodnie z planem eksperymentalnym. Zbierz wycinek tkanki przylegający do wycinków z kulturą jako odniesienie do godzin zerowych lub niehodowanych.Zbierz co najmniej trzy wycinki referencyjne, które reprezentują górną, środkową i dolną część tkanki. A po zakończeniu krojenia kontynuuj naprawianie i przetwarzanie. Następnie przygotuj sześciodołkową płytkę zawierającą 2,5 mililitra pożywki hodowlanej na studzienkę, umieszczając w niej tytanowe siatki.Upewnij się, że między siatką tytanową a medium nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Aby załadować plasterek na siatkę, trzymaj sześciodołkową płytkę pod kątem, tak aby część podłoża zakrywała siatkę. Następnie umieść plasterek w podłożu na siatce i użyj kleszczy, aby go rozprowadzić.Po umieszczeniu plastrów załaduj sześciodołkowe płytki na obrotową jednostkę inkubacyjną umieszczoną w nawilżonym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 95%02 i 5% CO2. Rozpocznij cykl rotacji. W przypadku długotrwałej hodowli należy codziennie uzupełniać pożywkę hodowlaną za pomocą sterylnych kleszczy, aby podnieść siatkę zawierającą plastry tkanek i umieścić ją w pustym dołku na sześciodołkowej płytce.Zastąp 70% pożywki świeżą pożywką hodowlaną i umieść siatkę z powrotem. Kontynuuj cykl rotacji jak poprzednio. W celu leczenia farmakologicznego na wycinkach guza dodaj 2,5 mililitra pożywki z rozcieńczonym lekiem lub kontrolą nośnika do sześciodołkowej płytki.Umieść tytanowe kratki w dołkach, a następnie ułóż plastry na kratkach, tak jak wcześniej. Po wykonaniu zabiegów przez 24 godziny kontynuuj utrwalanie i obróbkę. Aby rozpocząć mocowanie żądanego plasterka, ostrożnie przenieś go za pomocą kleszczy na 10-centymetrową płytkę zawierającą nasączoną bibułę filtracyjną wypełnioną dwoma do trzech mililitrami PBS i pozwól mu unosić się na wodzie.Następnie wyjmij bibułę filtracyjną za pomocą kleszczyków i umieść ją w kasecie histo. Przenieś bibułę filtracyjną do kasety histo. Dodaj kroplę rozcieńczonej hematoksyliny na wierzch wycinka tkanki, aby zaznaczyć pozycję wycinka dla kolejnych kroków.Zamknij kasetę i przenieś ją do 4% neutralnego buforowanego roztworu formaliny i pozostaw na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po umyciu i przetworzeniu kasety zgodnie z opisem w protokole, otwórz kasetę histo i za pomocą skalpela ostrożnie wyjmij zamocowany plaster z bibuły filtracyjnej. Wyrzuć bibułę filtracyjną i przenieś plasterek do formy zawierającej ciekłą parafinę.Użyj płaskiego ciężarka, aby docisnąć tkankę do dna formy do zatapiania, aby zapewnić równomierne cięcie. Umieść dolną część kasety histo na wierzchu formy. Dodaj na wierzch płynną parafinę.I pozwól formie ostygnąć na zimnym talerzu przez 30 minut. Następnie oddziel schłodzoną formę od bloku parafiny. Za pomocą mikrotomu przygotuj cienkie czteromikrometrowe skrawki tkanek FFPE.Odetnij nadmiar parafiny otaczającej tkankę. Aby uzyskać równe przekroje w całej tkance, wyreguluj kąt bloku tak, aby powierzchnia bloku była zorientowana poziomo w stosunku do ostrza. Za pomocą cienkiej szczoteczki zbierz sekwencyjne skrawki tkanki zatopionej w parafinie, zaczynając od górnej części szkiełek podstawowych.Kontynuuj zbieranie odcinków głębszych warstw tkanek do środka, a następnie dolnej części szkiełek podstawowych. Pobieranie skrawków z różnych warstw każdego wycinka tkanki do szkiełek obiektowych odbywa się w celu umożliwienia uchwycenia potencjalnych gradientów żywotności, migracji komórek lub ekspresji biomarkerów wywołanych przez hodowlę. Po zebraniu skrawków kontynuuj ich przetwarzanie i dalszą analizę zgodnie z opisem w protokole.Grubość plastra tkanki może wpływać na żywotność plastrów hodowanych. W tym przypadku plastry o grubości 250 mikrometrów wykazują zwiększone gradienty nekrozy w porównaniu z plastrami o grubości 200 mikrometrów, ponieważ grubsze plastry stają się podatne na niedobory tlenu lub dyfuzji składników odżywczych przez plasterki. Jednak cienkie plasterki o grubości 160 mikrometrów zawierają duże obszary nekrotyczne, prawdopodobnie spowodowane technicznym obchodzeniem się z nimi podczas ustawiania plastrów, ponieważ są one kruche i mają tendencję do zwijania się.Analiza NKX2-1, markera dobrze zróżnicowanego gruczolakoraka płuc, pokazuje, że jego ekspresja nie jest znacząco zmieniona w hodowanych wycinkach w porównaniu z niehodowanymi plastrami w godzinie zero. Analiza ilościowa ekspresji NKX2-1 dodatkowo potwierdziła, że ekspresja nie uległa znaczącym zmianom w wycinkach hodowanych i niehodowanych, co sugeruje, że proces uprawy nie wpływa widocznie na status różnicowania tkanki gruczolakoraka. Aby sprawdzić, czy wycinki tkanki nowotworowej można wykorzystać do oceny skuteczności leków celowanych, potraktowano je DMSO lub zwiększyno ilości związków.Po leczeniu jednym mikromolowym daktolizibem, który jest ukierunkowany na szlak mTOR, fosforylacja 4EBP1 została zahamowana. 0,5 mikromolowy selumetynib, który jest ukierunkowany na szlak kinazy MAP, był skuteczny w hamowaniu fosforylacji ERK1/2. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pracować i krytycznie analizować plastry świeżo wycięte z cennych tkanek nowotworowych.Nasza była postdoc, Katja Narhi, znacząco przyczyniła się do opracowania tej metody we współpracy z kolegami z platformy IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform.

establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opracowaliśmy metodę badania skuteczności leków z wykorzystaniem chirurgicznych preparatów guzów mózgu, nazwaną „metodą eksplantatu guza”. Dzięki tej metodzie możemy ocenić skuteczność leków bez naruszania mikrośrodowiska guzów litych. Aby potwierdzić wiarygodność tej metody, przedstawiamy reprezentatywne dane z badania naszego preparatu glejaka traktowanego obecnie stosowanym w pierwszej linii chemioterapii temozolomidem.

Metoda opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych z wykorzystaniem eksplantatów guzów z materiału chirurgicznego

Organotypowe pierwotne kultury eksplantatów tkankowych, które zawierają precyzyjnie wycięte plastry, reprezentują trójwymiarową (3-D) architekturę tkanki, jak również wielokomórkowe interakcje natywnej tkanki. Ten film opisuje hodowlę wycinków tkanek pochodzących z mysiego guza płuc przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej, systemu, który umożliwia okresową ekspozycję tkanek na tlen i składniki odżywcze. Protokół opisuje metodologię generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych wycinków guza...

Hodowla eksplantatów tkanki guza płuc: procedura generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych plastrów guza płuc

Poniższy film opisuje, jak zachować morfologię tkanki za pomocą utrwalania formaliny i zatapiania parafiny.

Konserwacja tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE): metoda badania morfologii tkanek

Ten film pokazuje rozwój systemu kokultury 3D. Wycinki mózgu myszy umieszcza się na błonie, a znakowane fluorescencyjnie ludzkie komórki guza mózgu mogą na niej rosnąć. Gdy system jest gotowy, jest barwiony do obrazowania.

Ustalenie guza mózgu w organotypowym modelu kokultury warstw

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Wprowadzamy protokół do mierzenia reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna stanowi platformę do przeprowadzania średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na wycinkach tkanek pochodzących z nowotworów klinicznych lub mysich w warunkach ex vivo.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Ten artykuł opisuje metody generowania, leczenia lekami i analizy eksplantatów pochodzących od pacjentów do oceny reakcji na leki nowotworowe w żywym, istotnym dla pacjenta, przedklinicznym systemie modelowym.

Eksplantaty nowotworów pochodzące od pacjentów jako "żywa" platforma przedkliniczna do przewidywania oporności na leki u pacjentów

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Opisujemy protokół produkcji, hodowli i wizualizacji ludzkich nowotworów, które dały przerzuty na powierzchnie otrzewnej. Wycięte próbki guza są cięte za pomocą wibratomu i hodowane na przepuszczalnych wkładkach w celu zwiększenia natlenienia i żywotności, a następnie obrazowanie i dalsze analizy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Hodowla i obrazowanie organotypowych wycinków guza rzekomego śluzaka otrzewnej ex vivo z wyciętych próbek guza ludzkiego

Poznaj metodę przygotowania i analizy eksplantatów plastrów guza płuca myszy w badaniach przedklinicznych. Technika ta umożliwia ocenę odpowiedzi na leki w kontrolowanych warunkach in vitro.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Przeglądaj więcej filmów