Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych
29 listopada 2018
Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach przedklinicznych, w których badania odpowiedzi na lek w eksplantatach plastrów guza mogą służyć celom diagnostycznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że eksplantaty w plasterkach mogą przez krótki czas modelować złożoną biologię tkanek natywnych, w tym funkcje rozmieszczone przestrzennie. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat wykorzystania wycinków z mysich guzów płuc, można ją również zastosować do innych typów tkanek, w tym tkanek ludzkich.
Aby rozpocząć, przygotuj wibratomium i wykonaj VibraCheck zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji. Następnie napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki jednym mililitrem roztworu soli Hank's Balanced uzupełnionego penicyliną i streptomycyną i utrzymuj płytkę na lodzie. Włóż igły o rozmiarze 25 w wszystkie cztery łapy uświęconej myszy umieszczonej na styropianowej pokrywie, tak aby klatka piersiowa była odsłonięta, a zwierzę rozciągnięte.
Rozpyl 70% alkohol na powierzchnię odsłoniętej skóry. Użyj nożyczek ustawionych pod kątem, aby rozciąć skórę od brzucha w kierunku klatki piersiowej i aż do szyi. Rozciągnij skórę po obu stronach za pomocą kleszczy i włóż igły o rozmiarze 25.
Rozetnij okolicę brzucha. Następnie rozetnij klatkę piersiową i przeponę, aby odsłonić płuco i serce. Odsłoń tchawicę, odcinając otaczającą tkankę.
Wypreparuj płuca razem z sercem. Umieść chusteczki w 50-mililitrowej probówce zawierającej 30 mililitrów lodowatego HBSS uzupełnionego Pen-Strep umieszczonym na lodzie i przejdź do następnego kroku tak szybko, jak to możliwe. Teraz przenieś płuca zawierające guz na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej.
Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby oddzielić płaty płuc i wybierz płaty z guzami na powierzchni do krojenia. Umieść płat płuca z tkanką nowotworową na kawałku bibuły filtracyjnej, aby uniknąć poślizgnięcia się i wytnij część normalnego płuca lub dodatkową tkankę nowotworową otaczającą guz za pomocą sterylnego skalpela, aby wygenerować płaską powierzchnię kawałka tkanki. Zanurz płaską stronę w kropli kleju cyjanoakrylowego i zamontuj ją na uchwycie próbki wibratomu tak, aby guz był skierowany w stronę ostrza w pozycji pionowej i pozostaw do wyschnięcia na dwie do trzech minut.
Umieść uchwyt na próbkę wibratomu w metalowej tacy buforowej. Napełnij tackę zimnym HBSS uzupełnionym Pen-Strep, aż tkanka zostanie zanurzona w buforze. Przykryj tackę buforową pokrywką z pleksiglasu, która jest dostarczona z instrumentem i umieść tackę w białej łaźni lodowej i dodaj lód, aby chusteczka była chłodna podczas krojenia.
Podłącz białą kąpiel lodową do wibratomu. Następnie wybierz odpowiednie ustawienia krojenia i rozpocznij krojenie. Ustaw ostrze wibratomu w pozycji krojenia i ustaw okno krojenia.
Użyj sterylnych kleszczyków, aby zebrać plastry na 24-dołkowej płytce wypełnionej jednym mililitrem HBSS uzupełnionym Pen-Strep na dołek i trzymaj na lodzie. Śledząc kolejność krojenia, zaznacz każdą studzienkę na 24-dołkowej płytce zgodnie z planem eksperymentalnym. Zbierz wycinek tkanki przylegający do wycinków z kulturą jako odniesienie do godzin zerowych lub niehodowanych.
Zbierz co najmniej trzy wycinki referencyjne, które reprezentują górną, środkową i dolną część tkanki. A po zakończeniu krojenia kontynuuj naprawianie i przetwarzanie. Następnie przygotuj sześciodołkową płytkę zawierającą 2,5 mililitra pożywki hodowlanej na studzienkę, umieszczając w niej tytanowe siatki.
Upewnij się, że między siatką tytanową a medium nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Aby załadować plasterek na siatkę, trzymaj sześciodołkową płytkę pod kątem, tak aby część podłoża zakrywała siatkę. Następnie umieść plasterek w podłożu na siatce i użyj kleszczy, aby go rozprowadzić.
Po umieszczeniu plastrów załaduj sześciodołkowe płytki na obrotową jednostkę inkubacyjną umieszczoną w nawilżonym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 95%02 i 5% CO2. Rozpocznij cykl rotacji. W przypadku długotrwałej hodowli należy codziennie uzupełniać pożywkę hodowlaną za pomocą sterylnych kleszczy, aby podnieść siatkę zawierającą plastry tkanek i umieścić ją w pustym dołku na sześciodołkowej płytce.
Zastąp 70% pożywki świeżą pożywką hodowlaną i umieść siatkę z powrotem. Kontynuuj cykl rotacji jak poprzednio. W celu leczenia farmakologicznego na wycinkach guza dodaj 2,5 mililitra pożywki z rozcieńczonym lekiem lub kontrolą nośnika do sześciodołkowej płytki.
Umieść tytanowe kratki w dołkach, a następnie ułóż plastry na kratkach, tak jak wcześniej. Po wykonaniu zabiegów przez 24 godziny kontynuuj utrwalanie i obróbkę. Aby rozpocząć mocowanie żądanego plasterka, ostrożnie przenieś go za pomocą kleszczy na 10-centymetrową płytkę zawierającą nasączoną bibułę filtracyjną wypełnioną dwoma do trzech mililitrami PBS i pozwól mu unosić się na wodzie.
Następnie wyjmij bibułę filtracyjną za pomocą kleszczyków i umieść ją w kasecie histo. Przenieś bibułę filtracyjną do kasety histo. Dodaj kroplę rozcieńczonej hematoksyliny na wierzch wycinka tkanki, aby zaznaczyć pozycję wycinka dla kolejnych kroków.
Zamknij kasetę i przenieś ją do 4% neutralnego buforowanego roztworu formaliny i pozostaw na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po umyciu i przetworzeniu kasety zgodnie z opisem w protokole, otwórz kasetę histo i za pomocą skalpela ostrożnie wyjmij zamocowany plaster z bibuły filtracyjnej. Wyrzuć bibułę filtracyjną i przenieś plasterek do formy zawierającej ciekłą parafinę.
Użyj płaskiego ciężarka, aby docisnąć tkankę do dna formy do zatapiania, aby zapewnić równomierne cięcie. Umieść dolną część kasety histo na wierzchu formy. Dodaj na wierzch płynną parafinę.
I pozwól formie ostygnąć na zimnym talerzu przez 30 minut. Następnie oddziel schłodzoną formę od bloku parafiny. Za pomocą mikrotomu przygotuj cienkie czteromikrometrowe skrawki tkanek FFPE.
Odetnij nadmiar parafiny otaczającej tkankę. Aby uzyskać równe przekroje w całej tkance, wyreguluj kąt bloku tak, aby powierzchnia bloku była zorientowana poziomo w stosunku do ostrza. Za pomocą cienkiej szczoteczki zbierz sekwencyjne skrawki tkanki zatopionej w parafinie, zaczynając od górnej części szkiełek
podstawowych.Kontynuuj zbieranie odcinków głębszych warstw tkanek do środka, a następnie dolnej części szkiełek podstawowych. Pobieranie skrawków z różnych warstw każdego wycinka tkanki do szkiełek obiektowych odbywa się w celu umożliwienia uchwycenia potencjalnych gradientów żywotności, migracji komórek lub ekspresji biomarkerów wywołanych przez hodowlę. Po zebraniu skrawków kontynuuj ich przetwarzanie i dalszą analizę zgodnie z opisem w protokole.
Grubość plastra tkanki może wpływać na żywotność plastrów hodowanych. W tym przypadku plastry o grubości 250 mikrometrów wykazują zwiększone gradienty nekrozy w porównaniu z plastrami o grubości 200 mikrometrów, ponieważ grubsze plastry stają się podatne na niedobory tlenu lub dyfuzji składników odżywczych przez plasterki. Jednak cienkie plasterki o grubości 160 mikrometrów zawierają duże obszary nekrotyczne, prawdopodobnie spowodowane technicznym obchodzeniem się z nimi podczas ustawiania plastrów, ponieważ są one kruche i mają tendencję do zwijania się.
Analiza NKX2-1, markera dobrze zróżnicowanego gruczolakoraka płuc, pokazuje, że jego ekspresja nie jest znacząco zmieniona w hodowanych wycinkach w porównaniu z niehodowanymi plastrami w godzinie zero. Analiza ilościowa ekspresji NKX2-1 dodatkowo potwierdziła, że ekspresja nie uległa znaczącym zmianom w wycinkach hodowanych i niehodowanych, co sugeruje, że proces uprawy nie wpływa widocznie na status różnicowania tkanki gruczolakoraka. Aby sprawdzić, czy wycinki tkanki nowotworowej można wykorzystać do oceny skuteczności leków celowanych, potraktowano je DMSO lub zwiększyno ilości związków.
Po leczeniu jednym mikromolowym daktolizibem, który jest ukierunkowany na szlak mTOR, fosforylacja 4EBP1 została zahamowana. 0,5 mikromolowy selumetynib, który jest ukierunkowany na szlak kinazy MAP, był skuteczny w hamowaniu fosforylacji ERK1/2. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pracować i krytycznie analizować plastry świeżo wycięte z cennych tkanek nowotworowych.
Nasza była postdoc, Katja Narhi, znacząco przyczyniła się do opracowania tej metody we współpracy z kolegami z platformy IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę generowania i analizy organotypowych przekrojów z guzów płuc mysich. Zawiera szczegóły dotyczące optymalizacji grubości przekroju i doboru stężenia leków dla skutecznego leczenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Badania przedkliniczne
Tło
- Organotypowe przekroje mogą modelować złożone funkcje biologiczne tkanek rdzennych.
- Technika ta ma zastosowanie do różnych typów tkanek, w tym ludzkich.
- Badania odpowiedzi na leki w przekrojach guzów mogą pomóc w diagnostyce.
- Mysie guzy płuc służą jako model do badania biologii guzów.
Cel badania
- Opracowanie systematycznego podejścia do analizy przekrojów guzów płuc.
- Optymalizacja warunków leczenia lekowego w przekrojach guzów.
- Opracowanie protokołu, który można dostosować do różnych typów tkanek.
Stosowane metody
- Przygotowanie wibrotomu i płytek do hodowli tkankowej.
- Rozcinanie i krojenie tkanek płuc zawierających guzy.
- Hodowla przekrojów w klimatyzowanym inkubatorze.
- Leczenie lekami i następcza fiksacja przekrojów do analizy.
Główne wyniki
- Udane generowanie organotypowych przekrojów z mysich guzów płuc.
- Zoptymalizowano grubość przekroju i stężenia leków.
- Metoda pozwala na badanie reakcji na leki w kontrolowanym środowisku.
- Uzyskane wnioski można zastosować do innych typów tkanek.
Wnioski
- Opracowany metoda zwiększa zrozumienie biologii guzów.
- Stanowi cenне narzędzie do przedklinicznych badań nad lekami.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć to podejście na tkanki ludzkie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Tumor slice explants preserve native tissue architecture and intratumor heterogeneity, enabling physiologically relevant preclinical models for diagnostic and drug response studies. This approach supports target validation by maintaining spatially resolved signaling and stromal interactions critical for mechanistic de-risking. Systematic analysis of heterogeneous markers prior to treatment ensures predictive confidence in downstream translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by preserving spatially distributed oncogenic functions such as signaling activities and stromal infiltration.
- Operational Value: Enables functional target validation through analysis of marker expression heterogeneity in adjacent slices as a prerequisite for drug studies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by maintaining differentiation status (e.g., NKX2-1 expression) during short-term culture, reducing false-positive target assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable outputs for downstream compound evaluation.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and cultivation on rotating incubation units to improve viability and reproducibility across experiments.
- Scalability: Facilitates platform reuse through optimization of slice thickness (e.g., 200-micrometer) to minimize necrosis gradients and technical artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by enabling evaluation of drug-induced marker alterations in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Assesses pathway-specific drug effects (e.g., mTOR via 4EBP1 phosphorylation, MAPK via ERK1/2 inhibition) in intact tissue contexts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by capturing culture-induced gradients in viability, migration, or biomarker expression via layered section analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification by providing quantitative, spatially resolved biomarker data essential for hypothesis testing and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by preserving native tissue architecture and multicellular interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice thickness optimization and daily medium replenishment on rotating incubation units.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via sequential section collection to capture viability and expression gradients across tissue layers.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by analyzing drug-treated slices for alterations in differentiation and pathway markers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for systematic analysis of heterogeneous tissue markers as a prerequisite across tumor types and drug classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through preservation of intratumor heterogeneity and stable marker expression during short-term culture.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via rotating incubation units and optimized slice thickness (200-micrometer) to reduce necrosis and handling artifacts.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of targeted drug efficacy (e.g., dactolisib, selumetinib) on pathway phosphorylation in physiologically relevant models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via systematic analysis of adjacent slices as zero-hour references to distinguish cultivation effects from drug responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vibratome-based tissue slicing and histological processing for sequential section analysis.
- Dependent on instrumentation including rotating incubation units, microtomes, and embedding systems for FFPE sectioning.
- Necessitates cross-team standardization of slice thickness optimization and reference slice collection (top, center, bottom) to account for heterogeneity.
- Involves adaptation considerations across model systems, as thin slices (160-micrometer) may curl during handling while thick slices (250-micrometer) risk diffusion-limited necrosis.
- Practical limitation: Slice thickness must be empirically optimized per tissue type to balance viability, structural integrity, and oxygen/nutrient diffusion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Collection of Tumor-bearing Lungs
2:08
Generation and Cultivation of Precision-cut Lung Tumor Slices, and Treatment with Inhibitors
5:58
Fixation and Processing of the Tissue Slices
7:27
Processing and Analysis of Formalin-fixed and Paraffin-embedded (FFPE) Tissues
8:33
Results: Assessment of Viability, Specific Marker Expression, and Targeted Drug Treatment on Adenocarcinoma Tissue Slices
10:26
Conclusion
