Name: Wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj wpływ genów związanych ze smakiem na odpowiedź immunologiczną w modelu zapalenia jelit u myszy. Ta metoda pozwala ocenić pro- i przeciwzapalne efekty białek sygnalizacyjnych w chorobach IBD.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81671016, 31471008 i 31661143030) oraz Narodowych Instytutów Zdrowia (DC010012, DC015819) oraz przez Fundację Siyuan.

Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Zhejiang. Zaleca się noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej przed wykonaniem tego protokołu.
1. Przygotowanie myszy i DSS
<ol>
	<li>Myszy z nokautem (α-gustducin-/-) i myszy C57BL/6 α C57BL/6 z dopasowanym wiekiem, płcią i masą ciała należy przechowywać indywidualnie w czystych klatkach. 
	UWAGA: Myszy z nokautem były krzyżowane wstecznie z myszami C57BL / 6 przez ponad 20 pokoleń i mają prawie 100% tła genetycznego C57BL / 6.</li>
	<li>Rozpuścić 30 g sproszkowanego siarczanu dekstranu (DSS) w 1 l wody w autoklawie. Mieszać, aż roztwór stanie się klarowny, aby upewnić się, że końcowe stężenie robocze wynosi 3% (w/v). 
	UWAGA: Roztwór DSS można przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 tygodnia lub w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Indukcja i ocena zapalenia jelita grubego DSS u myszy
<ol>
	<li>Zważ i zapisz początkową masę ciała każdej myszy. Umieść myszy pojedynczo w standardowych plastikowych klatkach i oznacz klatki.</li>
	<li>Zastąp zwykłą wodę pitną 3% roztworem DSS na łącznie 7 dni, do których obie grupy myszy mają dostęp ad libitum.</li>
	<li>Zmierz masę ciała myszy, rejestruj spożycie roztworu DSS oraz zbieraj i badaj stolec każdej myszy codziennie podczas podawania DSS. Obserwuj nasilenie biegunki i krwawienia z odbytu i przelicz je na indeks chorób wywołanych przez DSS12.</li>
	<li>Podczas eksperymentu oblicza się procentową utratę masy ciała w porównaniu z masą początkową oraz wskaźnik choroby w celu oceny objawów zapalenia jelita grubego. 
	UWAGA: Indeks choroby jest oceniany przez połączenie obserwacji biegunki i krwawienia z odbytu i jest zdefiniowany w następujący sposób: 0 (normalny stolec, brak krwi), 1 (miękki stolec, brak krwi), 2 (miękki stolec, mała ilość krwi), 3 (bardzo miękki stolec, umiarkowane krwawienie) i 4 (wodnisty stolec, znaczne krwawienie)12. Indeks chorób jest analizowany codziennie dla każdej myszy.</li>
	<li>Pod koniec 7-dniowej kuracji DSS należy złożyć myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy i kontynuować pozostałe eksperymenty.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek tkanek
<ol>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i oczyść skórę brzucha 70% etanolem. Wykonaj nacięcie linii środkowej w jamie brzusznej o długości 3 cm za pomocą małych nożyczek, aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić śledzionę od innych tkanek, a następnie usuń śledzionę i zmierz jej rozmiar.</li>
	<li>Zidentyfikuj i podnieś okrężnicę za pomocą kleszczy i oddziel ją od otaczającej krezki. Wyciągnij całą okrężnicę, aż będzie widoczne jelito ślepe i odbytnica.</li>
	<li>Odizoluj okrężnicę, przecinając ją na brzegu okrężnicy i głęboko w miednicy, aby uwolnić odpowiednio okrężnicę proksymalną i dystalną. Następnie zmierz i zapisz długość izolowanej okrężnicy. Należy uważać, aby nie uszkodzić tkanki okrężnicy podczas zabiegu preparowania.</li>
	<li>Przepłukać okrężnicę 10 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłębnik w celu usunięcia kału i krwi, aż eluat będzie całkowicie czysty.</li>
	<li>W celu identyfikacji histologicznej podziel próbki tkanek równo na trzy części: proksymalną, środkową i dystalną. Następnie utrwalić tkankę 4% paraformaldehydem (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W celu analizy ekspresji cytokin należy szybko zamrozić całą okrężnicę ciekłym azotem i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Histologiczna ocena nasilenia zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS
<ol>
	<li>Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
	<ol>
		<li>Po utrwaleniu zanurz tkankę w roztworze 30% sacharozy w 1x PBS na noc w probówce o pojemności 15 ml w celu krioochrony próbek.</li>
		<li>Osadź tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i umieść ją w temperaturze -20 °C, aż OCT stwardnieje.</li>
		<li>Przenieś blok OCT zawierający tkankę do kriostatu, ustaw pokrętło grubości w kriostacie na 12 μm, a następnie pokrój i zbierz zamrożone skrawki o grubości 12 μm.</li>
		<li>Podgrzewać pobrane skrawki tkanek z kriostatu w temperaturze 65 °C przez 20 minut na gorącej płycie.</li>
		<li>Umyj krótko sekcje w wodzie destylowanej. Zabarwić je roztworem barwiącym hematoksylinę przez 5 minut, a następnie spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.</li>
		<li>Dymuflować skrawki 0,5% kwasem solnym-etanolem przez 30 s i płukać je pod bieżącą wodą z kranu przez 1 min. Następnie wykonuj pranie w 1x PBS przez 1 min, a następnie spłukuj pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.</li>
		<li>Wykonać mycie skrawków tkanek w alkoholu 70%, 75%, 80% i 95%, każdy przez 10 s. Barwienie przeciwstawne w roztworze barwiącym eozynę przez 2 min.</li>
		<li>Wykonuj odwadnianie za pomocą 95% alkoholu i 2 podmian alkoholu bezwodnego przez 5 minut za każdym razem. Klarowne w 2 przemianach ksylenu przez 5 min.</li>
		<li>Oceń uszkodzenie tkanek proksymalnej, środkowej i dystalnej okrężnicy każdej myszy zarówno dla grupy z nokautem genu, jak i grupy typu dzikiego na podstawie wyników powyższego barwienia H&E. 
		UWAGA: Indeks choroby to łączny wynik uszkodzenia nabłonka i stanu zapalnego w błonie śluzowej, błonie podśluzowej, mięśniach i obszarach surowiczych, który definiuje się w następujący sposób: 0 (brak uszkodzenia tkanek i stanu zapalnego), 1 (ogniskowe uszkodzenie tkanki i stan zapalny), 2 (niejednolite uszkodzenie tkanek i stan zapalny) i 3 (rozproszone uszkodzenie tkanek i stan zapalny)12,13. Następnie sumuje się trzy wyniki na mysz dla bliższej, środkowej i dalszej części okrężnicy, aby uzyskać łączny wynik dla każdego zwierzęcia. Następnie obliczane są średnie wyniki dla każdej grupy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia<klasa sup="xref">14
	<ol>
		<li>Podgrzewać pobrane skrawki tkanek z kriostatu w temperaturze 65 °C przez 20 minut na gorącej płycie. Umyj sekcje w 1x PBS 3 razy, po 10 minut każda. Inkubuj skrawki tkanki w 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut, aby wyeliminować endogenną peroksydazę. Umyj sekcje jeszcze 3 razy. Zablokuj tkanki buforem blokującym (3% BSA, 0,3% detergentu niejonowego, 2% surowicy koziej, 0,1% azydku sodu w 1x PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub dłużej.</li>
		<li>Zastąp bufor blokujący roztworem zawierającym następujące podstawowe przeciwciała specyficzne dla typu komórek odpornościowych: CD45 dla leukocytów, CD3 dla limfocytów T, B220 dla komórek B, CD11b dla makrofagów i Ly6G dla neutrofili. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Usunąć pierwotne przeciwciała z wycinków tkanki przez aspirację. Umyj sekcje 1x PBS 3 razy, po 10 minut każda. Inkubować skrawki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym, a następnie inkubować z kompleksem streptawidyna-HRP w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować skrawki roztworem 3,3'-diaminobenzydu (DAB), aby uzyskać jasno- lub ciemnobrązowy kolor i uwidocznić komórki immunoreaktywne.</li>
		<li>Przeciwbarwić skrawki hematoksyliną i rozcieńczonym 0,3% (v/v) amoniakiem. Rób zdjęcia w jasnym polu przy 10-krotnym powiększeniu pod mikroskopem.</li>
		<li>Użyj programu do przetwarzania obrazu, aby zidentyfikować i określić ilościowo populację oznaczonych komórek odpornościowych zarówno w nabłonku, jak i blaszce właściwej (pod nabłonkiem), ustawiając 2 maski: użyj pierwszej maski w funkcji opartej na kostce kolorów, aby ustawić próg wykrywania koloru i zmierz kolorowe obszary reagujące na DAB; użyj drugiej maski, aby określić całkowite obszary nabłonka i laminarnej właściwości w badanym przekroju. Wyraź populację komórek immunoreaktywnych jako stosunek powierzchni barwienia naciekanych komórek do całkowitej powierzchni badanej tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ocena ekspresji genów w zapaleniu jelita grubego wywołanym przez DSS
<ol>
	<li>Pobrać tkanki jelita grubego od myszy z nokautem genu i myszy typu dzikiego leczonych DSS z zamrażarki o temperaturze -80 °C i dodać 0,6 ml buforu do lizy do 25 mg tkanki, a następnie homogenizować w homogenizatorze.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem zestawu do ekstrakcji RNA, aby wyekstrahować całkowite RNA, a DNaza I służy do eliminacji wszelkich zanieczyszczających genomowych DNA.</li>
	<li>Uruchom żel agarozowy, aby sprawdzić jakość wyekstrahowanego RNA. Jeśli jego pasmo RNA 28S jest jaśniejsze niż pasmo 18S, nadaje się do użytku. Pobrać 1 μl próbki RNA, aby określić stężenie RNA na mikrospektrofotometrze.</li>
	<li>Wymieszaj 1 μg całkowitego RNA z 2,5 μl 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 starterów i 1 μl odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki mysiej Moloneya (MMLV). Inkubować w temperaturze 42 °C przez 60 minut w celu przygotowania cDNA.</li>
	<li>Skonfiguruj reakcje PCR w czasie rzeczywistym, mieszając 1 μl cDNA z 0,5 μl starterów qPCR do przodu i do tyłu dla TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 i β-aktyny jako kontrolę oprócz 2x fluorescencyjnego zielonego barwnika.</li>
	<li>Uruchom qPCR z następującymi parametrami: 95 °C przez 10 minut, a następnie 45 cykli po 95 °C przez 10 s, 50 °C przez 25 s i 72 °C przez 20 s.</li>
	<li>Oblicz względną kwantyfikację ekspresji genów za pomocą metody 2-ΔΔCt="xref">15. Porównawczo przeanalizuj poziomy ekspresji genów w nokautach vs. myszy typu dzikiego.</li>
</ol>

<ol><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li>
<li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510619">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li>
<li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li>
<li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B313+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li>
<li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li>
<li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li>
<li>Bezençon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li>
<li>Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28569761">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510619">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).</li>
<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+%CE%B1-gustducin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li>
<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system%3A+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678(2012).</li>
<li>Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice%3A+Effects+in+CD4%2B-cell+depleted%2C+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis%3A+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652(2010).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Metoda ta może być zastosowana do ilościowego określenia wpływu mutacji określonych genów smakowych na stan zapalny w mysim modelu IBD wywołanym przez DSS. Aby w pełni wykorzystać tę potrzebę, kluczowym krokiem jest optymalna indukcja IBD. Na rozwój zapalenia jelita grubego wpływa kilka czynników, w tym szczep myszy, środowisko utrzymania, mikroflora jelitowa, a także interesujące geny. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego na niewielkiej liczbie myszy w celu przetestowania różnych dawek i czasu podawania ...

Dwie główne formy nieswoistego zapalenia jelit (IBD), choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) charakteryzują się przewlekłymi, remisyjnymi lub postępującymi stanami zapalnymi jelita o wieloczynnikowej etiologii1,2. Rozwój IBD zależy od czynników genetycznych, a także niektórych czynników środowiskowych, takich jak dieta, stosowanie antybiotyków i co ważne, infekcje chorobotwórcze. Jednak etiologia i regulacyjne mechanizmy molekularne leżące u podstaw IBD są nadal niejasne. W związku z tym skonstruowano i zastosowano liczne chemicznie indukowane modele zwierzęce IBD w celu nakreślenia patogenezy i mechanizmów regulacyjnych oraz oceny skuteczności terapii stosowanych u ludzi3.
Receptory smaku są receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) i są klasyfikowane jako dwa główne typy: typ I (T1Rs) i typ II (T2Rs), które wykrywają słodkie, umami i gorzkie związki. Kaskady sygnalizacji smaku są inicjowane przez degustacyjne wiązanie z T1Rs lub T2R, aktywując heterotrimeryczne białka G składające się z α-gustducyny i dimeru Gβγ i prowadząc do uwolnienia podjednostek Gβγ. Ugrupowanie Gβγ z kolei stymuluje znajdujący się za nim enzym efektorowy fosfolipazę C-β2 (PLC-β2). Aktywowany PLC-β2 następnie hydrolizuje fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan do dwóch wewnątrzkomórkowych wtórnych przekaźników [inozytolo-1,4,5-trifosforan (IP3) i diacyloglicerol], a IP3 wiąże się i otwiera swój kanał-receptor IP3R3, uwalniając jony wapnia z retikulum endoplazmatycznego. To ostatecznie prowadzi do otwarcia kanału jonowego Trpm5 o potencjale przejściowego receptora i uwolnienia neuroprzekaźnika ATP do nerwów smakowych4,5,6,7. Jednak szlaki sygnałowe smaków słonych i kwaśnych są różne i niezależne od smaków słodkich, umami i gorzkich8. Ponadto składniki GPCR smaku i białka znajdujące się w dalszej części układu występują w różnych tkankach pozaustnych. Ostatnie badania wykazały, że α-gustducyna, główny składnik sygnalizacji smaku, ulega ekspresji w błonie śluzowej jelit. Potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć funkcje tych składników sygnalizacji smaku w tkankach pozaustnych9,10.
Opisana tutaj metoda służy do scharakteryzowania funkcji białek sygnalizacji smakowej wyrażanych w tkankach pozaustnych. Łączymy transgeniczną linię myszy opracowaną do wyznaczania kaskad sygnałowych w kubkach smakowych z chemicznie indukowanym modelem zapalenia jelita grubego. W dużej mierze ze względu na prostotę procedury i patologiczne podobieństwa do ludzkiego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, model IBD indukowany siarczanem dekstranu sodu (DSS) jest najczęściej stosowany spośród różnych chemicznie indukowanych modeli zapalenia jelita grubego11. W tym badaniu wykorzystaliśmy myszy z niedoborem α-gustducyny jako reprezentatywną linię myszy, aby ujawnić nowe funkcje α-gustducyny w odporności i zapaleniu błony śluzowej jelit poprzez 1) analizę zmian morfologicznych w tkance i 2) oznaczanie różnic w ekspresji cytokin związanych ze stanem zapalnym w okrężnicy. Metoda ta może być wykorzystana do ilościowego i jakościowego określenia udziału białek sygnalizacji smakowej (i innych białek ulegających ekspresji w jelitach) do uszkodzenia tkanek i zapalenia jelit, gdy dostępne są genetycznie zmodyfikowane linie myszy dla genów będących przedmiotem zainteresowania. Zaletą tej metody jest umożliwienie użytkownikom uzyskania zintegrowanych danych wynikających zarówno z działania substancji chemicznej DSS, jak i niedoboru interesującego nas genu. Metodę tę można jeszcze udoskonalić, aby zwiększyć jej czułość i ujawnić subtelne zmiany jelitowe na poziomie komórkowym i molekularnym.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>B220</td><td>BD Biosciences</td><td>550286</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550282</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>BD Biosciences</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran Siarczan Sól sodowa (DSS)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks Streptawidyna-HRP</td><td>BD Pharmingen</td><td>551011</td><td></td></tr><tr><td>H& Zestaw do barwienia E</td><td>BBI Life Sciences</td><td>E607318</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548117</td><td></td></tr><tr><td>FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td><td>Roche</td><td>4913850001</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza MMLV, GPR</td><td>Clontech,TaKaRa</td><td>639574</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny zestaw do ekstrakcji RNA TaKaRa MiniBEST&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>9767</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 mL Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nożyczki&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR maszyna</td><td></td><td></td><td></td>do</tr><tr><td>barwienia słoiki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imag-Pro Plus&nbsp;</td><td>Media Cybernetics, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) jest jednym z zaburzeń żołądkowo-jelitowych związanych z układem odpornościowym, w tym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i chorobą Leśniowskiego-Crohna, która wpływa na jakość życia milionów ludzi na całym świecie. Objawy IBD obejmują ból brzucha, biegunkę i krwawienie z odbytu, które mogą wynikać z interakcji między mikrobiotą jelitową, składnikami żywności, komórkami nabłonka jelitowego i komórkami odpornościowymi. Szczególnie ważna jest ocena, w jaki sposób każdy kluczowy gen ulegający ekspresji w nabłonku jelitowym i komórkach odpornościowych wpływa na stan zapalny w okrężnicy. W jelitach znaleziono receptory smaku sprzężone z białkiem G, w tym podjednostkę białka G α-gustducynę i inne białka sygnałowe. Tutaj używamy α-gustducyny jako przedstawiciela i opisujemy model IBD indukowany siarczanem sodu dekstranu (DSS) w celu oceny wpływu mutacji genów smakowych na odporność błony śluzowej jelit i stan zapalny. Metoda ta łączy technologię nokautu genów z chemicznie indukowanym modelem IBD, a zatem może być stosowana do oceny wyniku smakowego niwelacji genów, a także innych genów, które mogą wylewać się lub tłumić indukowaną przez DSS odpowiedź immunologiczną w okrężnicy. Zmutowanym myszom podaje się DSS przez pewien czas, podczas którego ich masa ciała, stolec i krwawienie z odbytu są monitorowane i rejestrowane. W różnych punktach czasowych podczas podawania niektóre myszy są poddawane eutanazji, następnie mierzy się rozmiary i wagę ich śledzion i okrężnicy, a tkanki jelitowe są zbierane i przetwarzane do analiz histologicznych i ekspresji genów. Dane pokazują, że nokaut α-gustducin powoduje nadmierną utratę wagi, biegunkę, krwawienie z jelit, uszkodzenie tkanek i stan zapalny w porównaniu z myszami typu dzikiego. Ponieważ na nasilenie indukowanego stanu zapalnego mają wpływ szczepy myszy, środowisko hodowlane i dieta, optymalizacja stężenia DSS i czasu podawania w eksperymencie pilotażowym jest szczególnie ważna. Dostosowując te czynniki, metoda ta może być stosowana do oceny zarówno działania przeciw-, jak i prozapalnego.

Procedurę indukcji IBD za pomocą DSS ustanowiono poprzez podawanie 3% DSS w wodzie pitnej myszom z nokautem (KO) α-gustducyny oraz myszom typu dzikiego (WT). W porównaniu z myszami WT, myszy z nokautem wykazywały cięższy przebieg zapalenia jelita grubego z nadmierną utratą masy ciała, biegunką i krwawieniem z jelit (Rycina 1). Po 7-dniowym podawaniu DSS przeanalizowano różnice w integralności tkanek, stosując barwienie H&amp;E jako metodę histologiczną; w bli...

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu unieważnienia genów związanych z degustacją na odpowiedzi immunologiczne w mysim modelu IBD wywołanym siarczanem dekstranu sodu (DSS).

Wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochorób zapalnych dotyczące wrzodziejącego zapalenia jelita grubego i choroby Leśniowskiego-Crohna. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do oceny pierwszych efektów anty i proinfammatycznych białek sygnałowych. Implikacje tej techniki rozszerzają badania nad gazami w nowych postępach i stanach zapalnych.Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w genetyczny wpływ na zapalenie jelit. Może być również stosowany do innych czynników, takich jak dieta i mikrobiom. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tym semestrze będą miały trudności, ponieważ przetwarzanie tkanki bliznowatej choroby jest trudne.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy preparacji i przygotowania tkanek są trudne do nauczenia, ponieważ mystalia i struktury tkanki komórkowej mogą ulec zmianie. Aby wywołać siarczan sodu dekstranu lub zapalenie jelita grubego DDS, zastąp zwykłą wodę pitną 3% roztworem DSS, dodaj libid na siedem dni. Pomiar masy ciała każdej myszy, dziennego spożycia roztworu DSS i produkcji stolca.Pod koniec siedmiodniowej kuracji umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i małymi nożyczkam

effects-taste-signaling-protein-abolishment-on-gut-inflammation-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Ten film demonstruje technikę generowania chemicznie wywołanego mysiego modelu zapalenia jelita grubego - choroby zapalnej jelit. Mysz może spożywać roztwór siarczanu sodu dekstranu (DSS) przez odpowiedni czas. Po spożyciu DSS uszkadza barierę warstwy śluzu i nabłonka w okrężnicy, umożliwiając drobnoustrojom jelitowym przedostanie się do leżącej poniżej tkanki – gdzie są wyczuwane przez rezydujące komórki odpornościowe, aby pośredniczyć w przesadnej odpowiedzi immunologicznej, powodując stan...

Technika generowania mysiego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem sodu

Ten film pokazuje ocenę chemicznie wywołanego zapalenia jelita grubego poprzez immunohistochemiczne barwienie tkanki okrężnicy myszy. W wycinku wybarwionej tkanki obecność dużej liczby komórek reagujących immunologicznie w uszkodzonej tkance reprezentuje infiltrację komórek odpornościowych podczas zapalenia jelita grubego.

Ocena chemicznie wywołanego zapalenia jelita grubego za pomocą analizy immunohistochemicznej skrawków tkanki jelita grubego

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Tutaj podajemy szczegółowy opis procedury wywoływania biopsji szczypanych pod kontrolą kolonoskopii u myszy i śledzenia zamykania ran w czasie rzeczywistym. Dodatkowo przedstawiono metody przygotowania tkanek do analiz histologicznych, immunohistochemicznych i molekularnych łożyska rany.

Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Interakcja genetycznej podatności, odporności błony śluzowej i mikroekologicznego środowiska jelitowego jest zaangażowana w patogenezę nieswoistego zapalenia jelit (IBD). W tym badaniu zastosowaliśmy przeszczep mikrobioty kałowej myszom z niedoborem IL-10 i zbadaliśmy jej wpływ na zapalenie okrężnicy i czynność serca.

Ocena terapeutyczna przeszczepu mikrobioty kałowej w mysim modelu z niedoborem interleukiny 10

Ten protokół opisuje metodę tworzenia szczurzego modelu zapalenia torebki. Model worka jelita krętego powstał poprzez wykonanie operacji zespolenia jelita krętego z odbytem (IPAA) z wykorzystaniem technik mikrochirurgicznych. Po operacji szczur był leczony 4% siarczanem dekstranu sodu (DSS) przez 4 dni.

Szczurzy model zapalenia torebki po proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego z odbytem przy użyciu siarczanu dekstranu sodu

Poznaj wpływ genów związanych ze smakiem na odpowiedź immunologiczną w modelu zapalenia jelit u myszy. Ta metoda pozwala ocenić pro- i przeciwzapalne efekty białek sygnalizacyjnych w chorobach IBD.

Wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit

Przeglądaj więcej filmów