Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych
January 7th, 2019
Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.
Metoda ta pozwala na wspólne drukowanie zarówno strukturalnych syntetyków, jak i komponentów biologicznych do rusztowań inżynierii tkankowej. Rusztowania te mogą dokładniej replikować natywne środowisko tkankowe, co może być korzystne dla hodowanych komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona drukować struktury o zdrowych warunkach mechanicznych bez uszkadzania materiału biologicznego zamkniętego w rusztowaniach w technice "wszystko w jednym" dla inżynierii tkankowej.
Wyprodukuj mikrosfery z pożądaną matrycą w kapsułkach. Te mikrosfery zostały wykonane ze zdecelularizowanej chrząstki z tylnych kończyn świni. Różnią się wielkością.
Pracuj z maszyną sitową, aby uzyskać mikrosfery o jednolitej wielkości. Upewnij się, że trzy tace sitowe zostały dokładnie wyczyszczone i wysuszone przed użyciem. Zamontuj wytrząsarkę sitową z większą tacą siatkową na górze i tacą o mniejszych oczkach pośrodku.
Połóż miskę sitową na dnie. Umieść suche mikrosfery w najwyższej tacy. Następnie umieść pokrywkę na tacy.
Grube sito przez osiem do dziesięciu minut. Następnie przesiewaj drobno przez osiem do dziesięciu minut. Czekając, ułóż papier wagowy na przesiane kulki.
Po zakończeniu przesiewania ostrożnie wyjmij tackę sitową. Umieść tacę do góry nogami na papierze wagowym. Delikatnie postukaj w boki, aby upewnić się, że większość kulek wypadnie.
Po opróżnieniu wszystkich płytek sitowych na papier wagowy, wyrzuć zbyt duże i zbyt małe kulki. Pozostałe kule mają odpowiedni rozmiar do wykorzystania w kolejnych krokach. Umieść te kulki w oznakowanej probówce wirówkowej.
Przechowuj probówkę w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna. Zważ materiał niezbędny do wytworzenia materiału filamentu. Wykonaj stosunek wagowy mikrosfer do czterech do proszku polikaprolaktonu z co najmniej 25 gramami mikrosfer.
Przenieś mieszaninę proszku do miniaturowego mieszalnika do walcowania. Mieszaj proszek z prędkością 20 obrotów na minutę przez pięć minut. Po pięciu minutach zatrzymaj obrót i odwróć pojemnik.
Następnie mieszaj z prędkością 20 obr./min przez dodatkowe pięć minut. Aby kontynuować, przenieś mieszaninę do konfiguracji ekstrudera i szpuli. Ustaw ekstruder tak, aby jego wylot znajdował się około 60 centymetrów od wlotu szpuli.
Następnie przy elemencie grzejnym ekstrudera upewnij się, że nie ma płaszcza izolacyjnego. Umieść wentylator biurkowy mniej więcej w połowie odległości między ekstruderem a szpulą, aby schłodzić ekstrudat. Umieść kolejny wentylator w pobliżu płaszcza grzewczego, aby schłodzić go powietrzem z otoczenia.
Następnie upewnij się, że właściwa dysza jest podłączona do ekstrudera i ustaw temperaturę elementu grzejnego. Uruchom wentylatory chłodzące i pozwól instrumentowi osiągnąć stan ustalony. Po 20 do 30 minutach weź mieszaninę mikrosfery PCL i napełnij lej wytłaczarki.
Włącz szpulę i ślimak ekstrudera, aby rozpocząć wytłaczanie filamentu. Użyj kleszczyków i ręcznie pociągnij początkowy wytłaczany filament. Podaj filament do szpuli filamentu.
Podczas wytłaczania obserwuj filament, aby określić jego skład. Po pewnym czasie skład filamentu będzie wyglądał na jednolity, co jest pożądane. Owiń taśmę wokół filamentu, aby zaznaczyć początek jednolitego obszaru.
Poza rolkami szpuli monitoruj średnicę filamentu. Użyj suwmiarki, aby sprawdzić, czy średnica jest zbliżona do pożądanej 1.75 mm. W razie potrzeby dostosuj prędkości i temperatury szpuli i ekstrudera.
Aby wyregulować średnicę filamentu, najpierw zmień prędkość szpuli i ekstrudera. Możesz również zmienić temperaturę ekstrudera, chociaż zwykle nie jest to konieczne. Kontynuuj napełnianie leja i wytłaczanie, aż zostanie zużyty cały proszek.
Gdy zbiornik jest prawie pusty, dodaj proszek PCL do leja, aby wypłukać mieszaninę mikrosfer. Monitoruj ekstrudat podczas dodawania proszku PCL. Na początku mikrosfery będą nadal widoczne w ekstrudacie.
W końcu, gdy nie widać już mikrosfer, przestań dodawać PCL. Oddziel i oznacz filament mikrosferami w pożądanym stężeniu. Gdy w zbiorniku jest minimalna ilość proszku, przerwij wytłaczanie i wyłącz urządzenie.
Filament może być używany w standardowej drukarce do modelowania osadzania topionego. Załaduj filament do drukarki, która jest wyposażona w dysze o żądanej średnicy. Po załadowaniu modelu ustaw temperaturę i prędkość liniową drukowania i rozpocznij odkładanie filamentu.
Niestandardowy filament jest osadzany warstwa po warstwie. Zwróć szczególną uwagę na pierwszą warstwę i dostosuj ustawienia w razie potrzeby. Te dwa rusztowania wydrukowane w 3D są trudne do odróżnienia w tej skali.
Jeden z nich zawiera filament zawierający polikapralakton, tylko PCL. Drugi ma filament PCL z osadzonymi mikrosferami kwasu polimlekowego i matrycami deceluaryzowanymi. Oglądane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej rusztowanie tylko z PCL wydaje się w większości gładkie.
Natomiast w przypadku drugiego włókna mikrosfery osadzone w PCL są widoczne w całej próbce. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że zbyt małe lub zbyt małe mikrosfery mogą wpływać na dynamikę przepływu materiału w wytłaczarce. Z tego powodu należy pamiętać o odpowiednim przygotowaniu mikrosfer przed użyciem.
W celu zminimalizowania ilości odpadów, zaleca się tworzenie jednej dużej partii filamentu wymaganej do wszystkich eksperymentów, zamiast częstszego tworzenia mniejszych partii. Doświadczenie w produkcji filamentów przyjdzie z czasem. Rusztowania wytworzone w wyniku tej procedury mogą być dalej oceniane in vitro i in vivo, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zwiększonej indukcji i wytrzymałości mechanicznej w porównaniu z innymi rusztowaniami drukowanymi biologicznie.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie inżynierii tkankowej do zbadania kontrgenicznej indukcji zdeceluaryzowanej matrycy świńskiej w rusztowaniach 3D. Nie zapominaj, że praca z małymi cząstkami może stanowić zagrożenie dla układu oddechowego. Podczas tej procedury zaleca się noszenie małej maski przeciwpyłowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę współdruku strukturalnych syntetycznych i biologicznych komponentów w celu stworzenia szkieletów inżynierii tkankowej. Takie szkielety mogą dokładniej naśladować środowisko tkanki naturalnej, przynosząc korzyści hodowanym komórkom.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria tkankowa
- Druk 3D
- Biomateriały
Tło
- Zdezintegrowane macierze (DM) są używane do zwiększenia funkcjonalności szkieletu.
- Polikaprolakton (PCL) i kwas polimlekowy (PLA) są kluczowymi materiałami w produkcji szkieletów.
- Mikrosfery mogą zamknąc materiały biologiczne bez ich uszkodzenia.
- Ta technika pozwala na integrację właściwości mechanicznych i biologicznych w szkieletach.
Cel badania
- Wytworzenie mechanicznie solidnych szkieletów inżynierii tkankowej.
- Zamknięcie zdezintegrowanych macierzy w mikrosferach dla ulepszonych kultur komórkowych.
- Rozwój metody łączącej strukturalne i biologiczne komponenty w jednym procesie druku.
Stosowane metody
- Produkcja filamentu PCL z osadzoną mikrosferami PLA.
- Użycie zdezintegrowanej chrząstki z tylnych kończyn świń.
- Techniki druku 3D do produkcji szkieletów.
- Charakteryzacja wielkości i właściwości mikroesfera.
Główne wyniki
- Sukces w stworzeniu szkieletów zachowujących integralność strukturalną.
- Wykazanie zdolności do efektywnego zamknięcia materiałów biologicznych.
- Wykazanie poprawy warunków kultury komórkowej w szkieletach.
- Walidacja metody do produkcji złożonych konstrukcji inżynierii tkankowej.
Wnioski
- Ta metoda zwiększa potencjał tworzenia funkcjonalnych szkieletów tkankowych.
- Techniki współdruku mogą przenieść przepaść między materiałami syntetycznymi i biologicznymi.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować medycynę regeneracyjną i naprawę tkanek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Integrating decellularized matrices within 3D-printed scaffolds enables the creation of tissue-engineered constructs that combine mechanical integrity with biologic functionality. This approach addresses a critical challenge in early discovery and preclinical research by preserving bioactivity during fabrication, supporting predictive confidence in tissue modeling. The method positions bioprinting as a platform for developing disease-relevant systems and advancing translational biomaterials research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions in a controlled 3D environment.
- Supports functional validation of biomaterial cues for progenitor cell behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by preserving biologic agent activity during scaffold fabrication.
- Improves predictive confidence in tissue engineering hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D scaffolds for downstream cell-based assays.
- Enables quantitative comparison of scaffold surface features and cell responses.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound or biomaterial screening.
- Prepares validated biological systems for reliable evaluation of regenerative cues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold composition with disease-relevant tissue environments for translational studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of tissue repair strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by maintaining biologic function in constructs.
- Facilitates in vitro and in vivo assessment of scaffold performance.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, assay development, and preclinical research by enabling the fabrication of biologically active, mechanically robust 3D scaffolds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-matrix interactions and biological de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative scaffold outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides measurable surface features and composition for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional biomaterial cues for preclinical model alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and target validation in tissue engineering.
- Operational Value: Standardizes scaffold production with reproducible and scalable outputs.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk and supports efficient go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterials processing and 3D printing instrumentation.
- Demands analytical infrastructure for scaffold characterization and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation and extrusion parameters.
- Adaptation may be needed for different tissue types or biologic agents.
- Proper handling of particulates and batch scaling are essential for reproducibility and safety.
