Name: Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę druku 3D matryc bezkomórkowych z mikrosferami PLA w filamentach PCL dla inżynierii tkankowej. Technika umożliwia tworzenie szkieletów o wysokiej wytrzymałości mechanicznej i zgodności biologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został częściowo sfinansowany z grantu Pediatric Orthopaedic Society of North America (POSNA) oraz grantu National Institutes of Health NIBIB R21EB025378-01 (Exploratory Bioengineering Research Grant).

1. Otrzymywanie i wstępne przetwarzanie mikrosfer
<ol>
	<li>Wytwarzaj mikrosfery z pożądaną matrycą w obudowie (PLA-DM)2. 
	UWAGA: Konieczne jest, aby mikrosfery miały jednolitą wielkość. Z tego powodu niezbędne jest przesianie mikrosfer przed użyciem. Chociaż decelularyzacja i enkapsulacja matrycy zostały szczegółowo opisane w poprzednich publikacjach2, poniżej znajduje się krótkie podsumowanie tego procesu.
	<ol>
		<li>Najpierw zbierz czopy chrzęstne z tylnych kończyn świń. Decelularyzacja chrząstki w serii płukań 0,05% trypsyny/0,5 mm tetrasodowego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), zmodyfikowanego podłoża Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco oraz 1,5% kwasu nadoctowego i 2,0% Tritona X-100 przez 4 godziny za pomocą płukania wodą destylowaną przed i po każdym kroku2.</li>
		<li>Odcedź zdecelularyzowaną matrycę, zamroź ją, liofilizuj, zmiel i rozpuść w roztworze pepsyny. Po rozpuszczeniu zmieszać roztwór pepsyny z PLA, który został rozpuszczony w dichlorometanie.</li>
		<li>Dodaj mieszaninę kroplami do 3% alkoholu poliwinylowego w roztworze wodnym. Powstałe mikrosfery odwirować, spłukać, odcedzić i ponownie liofilizować. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat tego procesu można znaleźć w opublikowanym wcześniej pliku protocol2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesiej mikrosfery.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wszystkie płyty sita zostały dokładnie wyczyszczone i są suche przed użyciem. W razie potrzeby wyczyść sita za pomocą myjki ultradźwiękowej, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały usunięte z sita.</li>
		<li>Zamontuj wytrząsarkę sitową z tacką sitową 106 μm na górze, tacą 53 μm następnie i tacą sitową na dole.</li>
		<li>Umieść suche mikrokulki w górnej tacy sitowej i umieść pokrywkę na górnej tacy. Włącz grube przesiewanie na 8 do 10 minut. Powtarzać na dokładnym poziomie przez 8 do 10 minut 
		UWAGA: W zależności od partii może być konieczne wydłużenie lub skrócenie czasu przesiewania.</li>
		<li>Ostrożnie zdejmuj płytki sitowe jedna po drugiej i umieść je do góry nogami na dużym papierze wagowym. Delikatnie postukaj w boki, aby upewnić się, że większość kulek wypadła z sita na papier.</li>
		<li>Odrzuć zbyt duże kule (>106 μm) i zbyt małe kule (<53 μm). Dodaj kulki o rozmiarach od 53 do 106 μm do oznaczonej probówki wirówkowej z typem i numerem partii, a następnie umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C do dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oceny kontroli jakości mikrosfery
Uwaga: Zobacz Rysunek 1.
<ol>
	<li>Wykonaj ocenę makroskopową/wizualną, aby sprawdzić, czy mikrosfery są jednolite i kuliste, bez obecnych agregatów.</li>
	<li>Oceń mikrosfery za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).
	<ol>
		<li>W tym celu należy umieścić mikrosfery na uchwycie SEM i napylić warstwę złoto-palladową w atmosferze argonu za pomocą napylarki do grubości 4 nm.</li>
		<li>Obserwuj cechy powierzchni, morfologię i średnice mikrosfer za pomocą napięcia przyspieszającego 10 kV i odległości roboczej 10 mm, aby upewnić się, że produkcja i przesiewanie mikrosfer przebiegły pomyślnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tworzenie filamentu do druku 3D
<ol>
	<li>Zmierzyć i zapisać masę mikrosfer otrzymaną z etapów 2 i 3; potrzebne jest co najmniej 25 g.</li>
	<li>Dodaj proszek polikaprolaktonu (PCL) do mikrosfer, aby uzyskać stosunek wagowy mikrosfer do PCL 1:4.</li>
	<li>Wymieszaj mieszaninę proszku na miniaturowym mieszadle walcowym z prędkością 20 obr./min przez 5 minut, a następnie odwróć pojemnik i mieszaj z prędkością 20 obr./min przez dodatkowe 5 minut (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Wiele dostępnych na rynku ekstruderów (patrz Tabela Materiałów) ma płaszcze izolacyjne, ponieważ ich zamierzone temperatury pracy są przeznaczone dla tradycyjnych filamentów do modelowania metodą topienia topionego (FDM). Zmodyfikuj ekstruder (jeśli to konieczne), usuwając materiał izolacyjny i używając go w połączeniu z wentylatorami biurkowymi (które wdmuchują powietrze z otoczenia na ekstruder i wytłaczany filament), aby używać ekstrudera w niższych temperaturach. 
	UWAGA: Wentylatory biurkowe, które wydmuchują powietrze z otoczenia w celu schłodzenia ekstrudera i filamentu, są przydatne do tej procedury.</li>
	<li>Skonfiguruj sprzęt do wytłaczania. Zobacz Rysunek 3.
	<ol>
		<li>Ustaw ekstruder tak, aby jego wylot znajdował się ~60 cm od wlotu do szpuli, z bezpośrednią ścieżką od wylotu wytłaczacza do wlotu szpuli. 
		UWAGA: Szpulę można opcjonalnie podnieść o 3-4 cale od ławki, jeśli okaże się, że filament opada do punktu, w którym dotyka blatu.</li>
		<li>Umieść wentylator biurkowy w odległości ~15 cm od płaszcza grzewczego i skieruj go w stronę płaszcza grzewczego, aby zapewnić chłodzenie powietrzem z otoczenia przez cały czas produkcji filamentu. Umieść drugi wentylator chłodzący mniej więcej w połowie odległości między ekstruderem a szpulą i skieruj go w stronę ekstrudatu, aby pomóc w chłodzeniu filamentu powietrzem z otoczenia.</li>
		<li>Dostosuj położenie zgodnie z potrzebami w trakcie całego procesu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw zmodyfikowany element grzejny ekstrudera na 52 °C, włącz wentylatory chłodzące na pulpicie i pozwól instrumentowi dojść do równowagi na 20 do 30 minut. Upewnij się, że do ekstrudera jest podłączona odpowiednia dysza.</li>
	<li>Tuż przed rozpoczęciem napełnij lej ekstrudera mieszaniną mikrosfery/PCL z kroku 3.3. Włącz szpulę i ślimak ekstrudera, aby rozpocząć wytłaczanie filamentu.</li>
	<li>Gdy początkowy filament zostanie wytłaczony, ręcznie wyciągnij ekstrudat z wylotu wytłaczania za pomocą kleszczy i podaj go do szpuli filamentu.</li>
	<li>Pożądany filament będzie potrzebował trochę czasu, aby wydostać się ze szpuli. Używając oddzielnych szpul lub taśmy, wyraźnie zaznacz, kiedy skład filamentu wydaje się wizualnie jednolity.</li>
	<li>Uważnie monitoruj proces i w razie potrzeby modyfikuj parametry. Dostosuj temperaturę ekstrudera, prędkość ślimaka wytłaczania i prędkość szpuli, aby uzyskać filament o średnicy 1.75 mm mierzony suwmiarką. W razie potrzeby wyreguluj wentylatory, aby odpowiednio schłodzić filament, aby uniknąć nieokrągłych przekrojów żarnika. W razie potrzeby wymieszaj i napełnij zbiornik. 
	UWAGA: Podczas tego procesu należy zwrócić szczególną uwagę na uzyskanie odpowiedniego filamentu do późniejszego drukowania 3D. Powyższe parametry będą się zmieniać w zależności od warunków otoczenia, poziomu napełnienia i jednorodności mieszanki w leju zasypowym oraz termodynamiki i dynamiki przepływu poszczególnych partii PCL i mikrosfer.</li>
	<li>Kontynuuj wytłaczanie, aż cały proszek zostanie zużyty, a lej będzie prawie pusty. Dodaj proszek PCL (bez mikrosfer) do leja zasypowego, aby wypłukać mieszaninę mikrosfer, która znajduje się obecnie w wytłaczarce. Kontynuuj dodawanie proszku PCL do leja zasypowego, aż w ekstrudacie nie będą już widoczne mikrosfery.</li>
	<li>Pamiętaj, aby oznaczyć i oddzielić filament zawierający mikrosfery w pożądanym stężeniu, ponieważ po schłodzeniu filamentu trudniej jest odróżnić jednolity filament od niejednorodnego.</li>
	<li>Kontynuuj wytłaczanie, aż w zbiorniku pozostanie minimalna ilość proszku, a następnie wyłącz szpulę, ślimak ekstrudera, element grzejny ekstrudera i wentylatory.</li>
</ol>
4. Drukowanie za pomocą filamentu
<ol>
	<li>Zaprojektuj geometrię o pożądanym kształcie i formie za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo. Następnie pokrój model i podyktuj ścieżkę narzędzia za pomocą oprogramowania do krojenia, które jest kompatybilne z używaną maszyną do druku 3D.</li>
	<li>Załaduj filament z kroku 3 na dowolną standardową drukarkę FDM, wyposażoną w standardowe dysze o żądanej średnicy (zwykle 0,4 mm). Rozpocznij drukowanie (zwykle w temperaturze 65-70 °C i prędkości liniowej 300 mm/min), gdy niestandardowy filament jest nakładany warstwa po warstwie przez maszynę.</li>
	<li>Upewnij się, że zwróciłeś szczególną uwagę na pierwszą warstwę i dostosuj ustawienia w razie potrzeby, aby uzyskać dobrą jakość druku. 
	UWAGA: Można dokonać regulacji prędkości drukowania, temperatury drukowania, temperatury platformy, mnożnika ekstruzji i innych parametrów. Aby uzyskać dalszą pomoc, zapoznaj się z instrukcją rozwiązywania problemów producenta drukarki i krojenia.</li>
</ol>
5. Ocena kontroli jakości
<ol>
	<li>Wydrukowane konstrukcje umieścić na uchwytach SEM i napylić złoto-palladem w atmosferze argonu za pomocą napylarki do grubości 4 nm.</li>
	<li>Obserwować pod mikroskopem, stosując napięcie przyspieszające 10 kV i odległość roboczą 10 mm, aby sprawdzić cechy powierzchni oraz, w stosownych przypadkach, obecność lub brak mikrosfer.</li>
</ol>
6. Testowanie funkcjonalne drukowanych konstrukcji
UWAGA: Fosfataza alkaliczna (ALP) może być używana jako substytut matrycy bezkomórkowej w celu określenia, czy kapsułkowane białka są biologicznie aktywne po procesie produkcji filamentu. ALP jest stosowany, ponieważ katalizuje reakcję z substratu, fosforanu p-nitrofenylu, w celu zmiany z bezbarwnych na żółte produkty uboczne, p-nitrofenol i fosforan nieorganiczny, ale tylko wtedy, gdy ALP jest w konformacji funkcjonalnej.
<ol>
	<li>Wydrukuj geometrię (n = 3) o masie końcowej co najmniej 400 mg za pomocą filamentu mikrosferycznego ALP (PLA-ALP/PCL), używając identycznych parametrów druku jak rusztowania PLA-DM/PCL. Drukowanie obejmuje również rusztowania tylko z PCL (PCL(-)) o tej samej geometrii co rusztowania PLA-ALP/PCL. Zanurz je w 1 ml buforu Tris-HCl i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i rotacji 110 obr./min, aby umożliwić dyfuzję enzymu.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1 mg/ml fosforanu p-nitrofenylu, sześciowodnego disodu w Tris-HCl. Inkubować w temperaturze 37 °C, 110 obr./min przez dodatkowe 10 godzin. Odczytać absorbancję supernatantu przy długości fali 415 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. <a target="_blank" href="https://www.astm.org/DIGITAL_LIBRARY/STP/PAGES/STP15307S.htm">Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone.</a> Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).</li>
<li>Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29394158">Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold.</a> Biofabrication. , (2018).</li>
<li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li>
<li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11071603">Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.</a> Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).</li>
<li>Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+biodegradable+lumbar+interbody+fusion+cage+design+and+fabrication+using+integrated+global-local+topology+optimization+with+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering.</a> Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).</li>
<li>Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00158-010-0508-8">Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity.</a> Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+bone+engineering+using+ex+vivo.+gene+therapy+and+topology-optimized%2C+biodegradable+polymer+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).</li>
<li>Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interbody+Fusion+Cage+Design+Using+Integrated+Global+Layout+and+Local+Microstructure+Topology+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization.</a> Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).</li>
<li>Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresorbable+Airway+Splint+Created+with+a+Three-Dimensional+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).</li>
<li>Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamenting+3D+printed+scaffolds+with+cell-laid+extracellular+matrix+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration.</a> Biomaterials. 37, 230-241 (2015).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interface+microstructure+on+interfacial+shear+strength+for+osteochondral+scaffolds+based+on+biomimetic+design+and+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing.</a> Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).</li>
<li>Williams, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15763261">tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering.</a> Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).</li>
<li>Monibi, F. A., Cook, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Derived+Extracellular+Matrix+Bioscaffolds%3A+Emerging+Applications+in+Cartilage+and+Meniscus+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).</li>
<li>Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs%3A+Current+Problems+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).</li>
<li>Sutherland, A. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Microsphere-Based+Scaffolds+Containing+Decellularized+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage.</a> Macromolecular Bioscience. , (2015).</li>
<li>Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naturally+derived%2C+cytocompatible%2C+and+architecturally+optimized+scaffold+for+tendon+and+ligament+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.</a> Biomaterials. , (2007).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+strain+on+tensile+properties+of+a+naturally+derived%2C+decellularized+tendon+scaffold+seeded+with+allogeneic+tenocytes+and+associated+messenger+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+surgical+orthopaedic+advances%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression.</a> Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+process+for+optimizing+musculoskeletal+allograft+tissue+to+improve+safety%2C+ultrastructural+properties%2C+and+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+-+Series+A%22%5BJournal%5D)">A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration.</a> Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).</li>
<li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21362080">Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment.</a> Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).</li>
<li>Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration.</a> Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).</li>
<li>Dean, R. L. <a target="_blank" href="https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bmb.2002.494030060138">Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niezależnie wykazano, że zarówno matryce bezkomórkowe, jak i drukowane w 3D rusztowania PCL umożliwiają adhezję i proliferację komórek, potwierdzając ich zastosowanie do naprawy chrzęstnejkości 10,11,12. Zastosowanie matrycy bezkomórkowej w podejściach inżynieryjnych do naprawy tkanek było przedmiotem dużego zainteresowania i sukcesu w niedalekiej przeszłości 2,3,14,15.<...

Obecne techniki inżynierii tkankowej do zastosowań klinicznych, takich jak rekonstrukcja kości, chrząstek, ścięgien i więzadeł, wykorzystują auto- i alloprzeszczepy do naprawy uszkodzonej tkanki. Każda z tych technik jest rutynowo wykonywana jako "złoty standard" w praktyce klinicznej, polegająca na pierwszym pobraniu tkanki dawcy od pacjenta lub dopasowania zwłok, a następnie umieszczeniu tkanki dawcy w miejscu ubytku2. Strategie te są jednak ograniczone przez zachorowalność w miejscu dawczym, niedobór miejsc dawczych w przypadku dużych defektów, ryzyko infekcji i trudności ze znalezieniem przeszczepów pasujących do pożądanej geometrii. Ponadto badania wykazały, że przeszczepy allogeniczne stosowane do rekonstrukcji mają zmniejszone właściwości mechaniczne i biologiczne w porównaniu z natywnymi tkankami3. Mając na uwadze te względy, inżynierowie tkankowi zwrócili się ostatnio ku trójwymiarowemu (3D) biodrukowi, aby uzyskać niestandardowe, złożone geometrie, które są biologicznie aktywne i zaprojektowane tak, aby dostosować się do rozmiaru i kształtu defektu, zapewniając jednocześnie wystarczające właściwości mechaniczne do czasu zakończenia przebudowy biologicznej.
Idealnie, rusztowanie wydrukowane w 3D składałoby się z polimerowego szkieletu, który może zachować wymaganą stabilność mechaniczną rodzimej tkanki, podczas gdy włączone leki biologiczne oferują biochemiczne wskazówki dla otaczających komórek, prowadząc do ich migracji, proliferacji, różnicowania i produkcji tkanek2,5. Niestety, większość konstruktów zawierających składniki biologiczne jest wykonana z żeli lub polimerów, które są zbyt słabe, aby wytrzymać siły in vivo, których doświadczają tkanki docelowe do rekonstrukcji auto/alloprzeszczepu. Inne polimery, takie jak kwas polimlekowy (PLA), są bioresorbowalne, nadają się do druku 3D i są strukturalnie zdrowe, ale są drukowane w temperaturach równych lub wyższych niż 210 °C - co uniemożliwia współdrukowanie leków biologicznych podczas produkcji. Polikaprolakton (PCL) to kolejny zatwierdzony przez FDA, bioresorbowalny polimer, który można drukować 3D w niższej temperaturze (65 °C), który staje się coraz bardziej popularny w wytwarzaniu implantów specyficznych dla pacjenta o złożonej morfologii5,6,7,8,9. Jednak większość biodrukarek wykorzystujących technologię pneumatyczną uniemożliwia drukowanie PCL w niższych temperaturach, w których aktywność biologiczna może pozostać nienaruszona. Do tej pory nie udało się jeszcze zintegrować tych polimerów z autoprzeszczepami/alloprzeszczepami w nowy biomateriał nadający się do druku. W przypadku braku takiego materiału, prawdziwe podejście do rekonstrukcji tkanek oparte na inżynierii tkankowej jest mało prawdopodobne. Dlatego staraliśmy się połączyć PLA, PCL i bezkomórkowe matryce alloprzeszczepu (DM), aby wykorzystać zalety każdego materiału w celu wytworzenia żywotnego konstruktu zdolnego do rekonstrukcji złożonych tkanek. Proces ten zapewniłby początkową wytrzymałość mechaniczną niezbędną do oparcia się siłom in vivo oraz stabilność termiczną, aby dostosować się do wytwarzania przyrostowego w konstrukcji, która indukuje tworzenie pożądanej tkanki.
W niedawnej próbie rozwiązania wyżej wymienionych przeszkód wykazaliśmy, że możliwe jest zamknięcie zdecelularizowanej chrząstki zewnątrzkomórkowej w termicznie ochronnej barierze PLA, która może być wytłaczana w włóknach PCL, zachowując zdolność DM do wpływania na otaczające komórki gospodarza2. To zainspirowało nas do poszukiwania klinicznie skutecznych metod rekonstrukcji tkanek. W obecnym badaniu wykorzystujemy technologię platformy do budowy rusztowań typu "wszystko w jednym", które obejmują PLA, DM i PCL (PLA-DM/PCL).
Naszym celem jest poprawa skuteczności i użyteczności przeszczepów allogenicznych przy użyciu proponowanej nowatorskiej techniki biofabrykacji, aby dokładniej odtworzyć rodzime tkanki, aby ostatecznie wykorzystać je w różnych zastosowaniach.

<table><tbody><tr><td>Maszyna sitowa</td><td>Haver & Boecker Tyler</td><td>Ro-Tap RX 29-E Sito czyste</td><td></td></tr><tr><td>90 um</td><td>Fisherbrand</td><td>170328156</td><td>nr 170</td></tr><tr><td>Sito 53 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162513588</td><td>Nr 270</td></tr><tr><td>Sito 106 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162018121</td><td>nr 140</td></tr><tr><td>Napylarka</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi, USA</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Filabot EX2</td><td>Filabot.com</td><td>FB00061</td><td></td></tr><tr><td>Filabot Spooler</td><td>Filabot.com</td><td>FB00073</td><td></td></tr><tr><td>CAPA 6506</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>6" Fan</td><td>Comfort Zone, Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa kąpiel wodna</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-08895-13</td><td></td></tr><tr><td>Dreamer</td><td>FlashForge</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mikser bębnowy</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>nie dotyczy</td><td>Podobny element wyposażenia: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= nie & gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Mikrowaga</td><td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td><td>01-913-851</td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D</td><td>Simplify3D</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>SolidWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery</td><td>produkowane we własnym zakresie, patrz równolegle zgłoszone JoVE zgłoszenie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosforan p-nitrofenylu, sól disodowa, sześciowodny</td><td>Millipore</td><td>4876-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza, alkaliczna</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10 713 023 001</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik absorbancji</td><td>Tecan</td><td>Sunrise</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewany shaker</td><td>Nowość Brunswick Scientific</td><td>Excella E24</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorski proces druku 3d matryc bezkomórkowych

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Bioprinting 3D ma na celu stworzenie niestandardowych rusztowań, które są biologicznie aktywne i dostosują się do pożądanego rozmiaru i geometrii. Termoplastyczny szkielet może zapewnić stabilność mechaniczną podobną do tkanki natywnej, podczas gdy czynniki biologiczne oferują wskazówki dotyczące składu komórek progenitorowych, prowadząc do ich migracji, proliferacji i różnicowania w celu odtworzenia oryginalnych tkanek/narządów1,2. Niestety, wiele kompatybilnych z drukiem 3D, bioresorbowalnych polimerów (takich jak kwas polimlekowy, PLA) jest drukowanych w temperaturach 210 °C lub wyższych - temperaturach, które są szkodliwe dla leków biologicznych. Z drugiej strony, polikaprolakton (PCL), inny rodzaj poliestru, jest bioresorbowalnym materiałem do druku 3D, który ma łagodniejszą temperaturę drukowania 65 °C. W związku z tym postawiono hipotezę, że zdecelularyzowana macierz zewnątrzkomórkowa (DM) zawarta w termicznie ochronnej barierze PLA może zostać wydrukowana w włóknie PCL i pozostać w swojej funkcjonalnej konformacji. W tej pracy naprawa kostno-chrzęstna była zastosowaniem, dla którego hipoteza została przetestowana. W związku z tym chrząstka świni została zdecelularyzowana i zamknięta w mikrosferach kwasu polimlekowego (PLA), które następnie zostały wytłaczane z polikaprolaktonem (PCL) do włókna w celu wytworzenia konstruktów 3D za pomocą modelowania osadzania stopionego. Konstrukty z mikrosferami lub bez nich (odpowiednio PLA-DM/PCL i PCL(-)) oceniano pod kątem różnic w cechach powierzchni.

Po przesiewaniu mikrosfery powinny wyglądać jednorodnie i być wolne od aglomeratów. W obrazowaniu SEM przesiane mikrosfery mogą wykazywać niewielkie pory na powierzchni, ale poza tym powinny być sferyczne i gładkie, co przedstawiono na ryc. 1. Wszystkie wytłoczone włókna powinny mieć jednorodną średnicę i okrągły przekrój poprzeczny. Włókno zawierające mikrosfery (PLA-DM/PCL) będzie miało nieco bardziej matowy wykończenie, natomiast włókno złożone wyłącznie z...

Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Metoda ta pozwala na wspólne drukowanie zarówno strukturalnych syntetyków, jak i komponentów biologicznych do rusztowań inżynierii tkankowej. Rusztowania te mogą dokładniej replikować natywne środowisko tkankowe, co może być korzystne dla hodowanych komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona drukować struktury o zdrowych warunkach mechanicznych bez uszkadzania materiału biologicznego zamkniętego w rusztowaniach w technice "wszystko w jednym" dla inżynierii tkankowej.Wyprodukuj mikrosfery z pożądaną matrycą w kapsułkach. Te mikrosfery zostały wykonane ze zdecelularizowanej chrząstki z tylnych kończyn świni. Różnią się wielkością.Pracuj z maszyną sitową, aby uzyskać mikrosfery o jednolitej wielkości. Upewnij się, że trzy tace sitowe zostały dokładnie wyczyszczone i wysuszone przed użyciem. Zamontuj wytrząsarkę sitową z większą tacą siatkową na górze i tacą o mniejszych oczkach pośrodku.Połóż miskę sitową na dnie. Umieść suche mikrosfery w najwyższej tacy. Następnie umieść pokrywkę na tacy.Grube sito przez osiem do dziesięciu minut. Następnie przesiewaj drobno przez osiem do dziesięciu minut. Czekając, ułóż papier wagowy na przesiane kulki.Po zakończeniu przesiewania ostrożnie wyjmij tackę sitową. Umieść tacę do góry nogami na papierze wagowym. Delikatnie postukaj w boki, aby upewnić się, że większość kulek wypadnie.Po opróżnieniu wszystkich płytek sitowych na papier wagowy, wyrzuć zbyt duże i zbyt małe kulki. Pozostałe kule mają odpowiedni rozmiar do wykorzystania w kolejnych krokach. Umieść te kulki w oznakowanej probówce wirówkowej.Przechowuj probówkę w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna. Zważ materiał niezbędny do wytworzenia materiału filamentu. Wykonaj stosunek wagowy mikrosfer do czterech do proszku polikaprolaktonu z co najmniej 25 gramami mikrosfer.Przenieś mieszaninę proszku do miniaturowego mieszalnika do walcowania. Mieszaj proszek z prędkością 20 obrotów na minutę przez pięć minut. Po pięciu minutach zatrzymaj obrót i odwróć pojemnik.Następnie mieszaj z prędkością 20 obr./min przez dodatkowe pięć minut. Aby kontynuować, przenieś mieszaninę do konfiguracji ekstrudera i szpuli. Ustaw ekstruder tak, aby jego wylot znajdował się około 60 centymetrów od wlotu szpuli.Następnie przy elemencie grzejnym ekstrudera upewnij się, że nie ma płaszcza izolacyjnego. Umieść wentylator biurkowy mniej więcej w połowie odległości między ekstruderem a szpulą, aby schłodzić ekstrudat. Umieść kolejny wentylator w pobliżu płaszcza grzewczego, aby schłodzić go powietrzem z otoczenia.Następnie upewnij się, że właściwa dysza jest podłączona do ekstrudera i ustaw temperaturę elementu grzejnego. Uruchom wentylatory chłodzące i pozwól instrumentowi osiągnąć stan ustalony. Po 20 do 30 minutach weź mieszaninę mikrosfery PCL i napełnij lej wytłaczarki.Włącz szpulę i ślimak ekstrudera, aby rozpocząć wytłaczanie filamentu. Użyj kleszczyków i ręcznie pociągnij początkowy wytłaczany filament. Podaj filament do szpuli filamentu.Podczas wytłaczania obserwuj filament, aby określić jego skład. Po pewnym czasie skład filamentu będzie wyglądał na jednolity, co jest pożądane. Owiń taśmę wokół filamentu, aby zaznaczyć początek jednolitego obszaru.Poza rolkami szpuli monitoruj średnicę filamentu. Użyj suwmiarki, aby sprawdzić, czy średnica jest zbliżona do pożądanej 1.75 mm. W razie potrzeby dostosuj prędkości i temperatury szpuli i ekstrudera.Aby wyregulować średnicę filamentu, najpierw zmień prędkość szpuli i ekstrudera. Możesz również zmienić temperaturę ekstrudera, chociaż zwykle nie jest to konieczne. Kontynuuj napełnianie leja i wytłaczanie, aż zostanie zużyty cały proszek.Gdy zbiornik jest prawie pusty, dodaj proszek PCL do leja, aby wypłukać mieszaninę mikrosfer. Monitoruj ekstrudat podczas dodawania proszku PCL. Na początku mikrosfery będą nadal widoczne w ekstrudacie.W końcu, gdy nie widać już mikrosfer, przestań dodawać PCL. Oddziel i oznacz filament mikrosferami w pożądanym stężeniu. Gdy w zbiorniku jest minimalna ilość proszku, przerwij wytłaczanie i wyłącz urządzenie.Filament może być używany w standardowej drukarce do modelowania osadzania topionego. Załaduj filament do drukarki, która jest wyposażona w dysze o żądanej średnicy. Po załadowaniu modelu ustaw temperaturę i prędkość liniową drukowania i rozpocznij odkładanie filamentu.Niestandardowy filament jest osadzany warstwa po warstwie. Zwróć szczególną uwagę na pierwszą warstwę i dostosuj ustawienia w razie potrzeby. Te dwa rusztowania wydrukowane w 3D są trudne do odróżnienia w tej skali.Jeden z nich zawiera filament zawierający polikapralakton, tylko PCL. Drugi ma filament PCL z osadzonymi mikrosferami kwasu polimlekowego i matrycami deceluaryzowanymi. Oglądane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej rusztowanie tylko z PCL wydaje się w większości gładkie.Natomiast w przypadku drugiego włókna mikrosfery osadzone w PCL są widoczne w całej próbce. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że zbyt małe lub zbyt małe mikrosfery mogą wpływać na dynamikę przepływu materiału w wytłaczarce. Z tego powodu należy pamiętać o odpowiednim przygotowaniu mikrosfer przed użyciem.W celu zminimalizowania ilości odpadów, zaleca się tworzenie jednej dużej partii filamentu wymaganej do wszystkich eksperymentów, zamiast częstszego tworzenia mniejszych partii. Doświadczenie w produkcji filamentów przyjdzie z czasem. Rusztowania wytworzone w wyniku tej procedury mogą być dalej oceniane in vitro i in vivo, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zwiększonej indukcji i wytrzymałości mechanicznej w porównaniu z innymi rusztowaniami drukowanymi biologicznie.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie inżynierii tkankowej do zbadania kontrgenicznej indukcji zdeceluaryzowanej matrycy świńskiej w rusztowaniach 3D. Nie zapominaj, że praca z małymi cząstkami może stanowić zagrożenie dla układu oddechowego. Podczas tej procedury zaleca się noszenie małej maski przeciwpyłowej.

novel-process-for-3d-printing-decellularized-matrices

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z chrząstki mogą być używane jako rusztowanie do naprawy chrząstki i jako środek do regeneracji tkanki kostno-chrzęstnej. W artykule szczegółowo opisano proces decelularyzacji i przedstawiono sugestie dotyczące wykorzystania tych rusztowań w warunkach in vitro.

Wytwarzanie bezkomórkowych rusztowań matrycowych pochodzących z chrząstki

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Bezkomórkowa matryca zewnątrzkomórkowa (dECM) może dostarczyć odpowiednich wskazówek mikrośrodowiskowych do podsumowania inherentnych funkcji tkanek docelowych w skonstruowanym konstrukcie. W tym artykule wyjaśniono protokoły decelularyzacji tkanki trzustkowej, ocenę biotuszu dECM pochodzącego z tkanki trzustki oraz generowanie konstruktów 3D tkanki trzustki przy użyciu techniki biodruku.

Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

W tej pracy zoptymalizowano protokół decelularyzacji w celu uzyskania zdecelularyzowanych matryc mięśni szkieletowych płodu myszy. Mioblasty C2C12 mogą kolonizować te matryce, namnażać się i różnicować. Ten model in vitro może być wykorzystany do badania zachowania komórek w kontekście chorób mięśni szkieletowych, takich jak dystrofie mięśniowe.

Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

Protokół wyjaśnia dwie różne metodologie decelularyzacji stosowane do rodzimych tkanek płucnych bydła, dostarczając wyczerpującego opisu ich charakterystyki.

Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

Bezkomórkowa matryca śledziony (DSM) ma obiecujące zastosowania w dziedzinie inżynierii tkankowej wątroby. Protokół ten określa procedurę przygotowania DSM dla szczurów, która obejmuje zbieranie śledziony szczurów, ich decellularację poprzez perfuzję i ocenę powstałego DSM w celu potwierdzenia jego cech.

Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Poznaj metodę druku 3D matryc bezkomórkowych z mikrosferami PLA w filamentach PCL dla inżynierii tkankowej. Technika umożliwia tworzenie szkieletów o wysokiej wytrzymałości mechanicznej i zgodności biologicznej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów