Name: Bezstronne podejście do pobierania próbek z odcinków TEM w neuronauce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj bezstronną metodę pobierania próbek z odcinków TEM w neuronauce, umożliwiającą automatyczną analizę mikrografów elektronowych z minimalnym udziałem użytkownika. Technika ta usprawnia ilościowe badanie gęstości synaps i parametrów strukturalnych w tkance mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy, FWF, numer projektu P 29370 B27

<ol><li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+V+%22Unbiased+Stereology%3A+Three-Dimensional+Measurement+in+Microscopy%22">Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy</a>. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).</li>
<li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li>
<li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182(2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta%3A+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li>
<li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Golgi+structure+using+EM%3A+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+stereological+tools%3A+disector%2C+fractionator%2C+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Elsevier/Academic Press. (2008).</li>
<li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+PR+%22Staining+Methods+for+Sectioned+Material%22">Staining Methods for Sectioned Material</a>. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).</li>
<li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li>
<li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li>
<li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj przepływ pracy pozwala badaczowi uzyskać dane na temat cech ultrastrukturalnych w bezstronny sposób. Jest to znacznie mniej czasochłonne niż badania objętościowe z sekcji seryjnych. Aby osiągnąć ten cel, wykorzystuje się kilka różnych aplikacji. Na początku nasze niestandardowe oprogramowanie RPS (w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat dostępności prosimy o kontakt z autorem korespondencyjnym) służy do wprowadzenia losowego przesunięcia etapu w celu wybrania współrzędnych obszaru próbkowania. Pozwala to na systematyczne, jednolite, losowe próbkowanie zwrotu z inwestycji. Następnie, do zliczania określonych struktur, dostosowaliśmy metodę disektora, w której porównuje się 2 kolejne sekcje o znanej odległości, w nowatorski sposób w porównaniu z poprzednimi badaniami 13,14,15, ponieważ użyliśmy naszego niestandardowego oprogramowania RPS do systematycznego jednolitego próbkowania losowego. Oszczędza to czas w porównaniu z rekonstrukcją 3D całych woluminów z sekcji seryjnych. Dostosowane do potrzeb klienta oprogramowanie RPS zostało opracowane specjalnie dla jednego typu mikroskopu, który jest czynnikiem ograniczającym odtwarzanie przepływu pracy. Alternatywą dla tego konkretnego oprogramowania byłaby aplikacja, która umożliwia tworzenie skryptów i jest kompatybilna z innymi modelami mikroskopów.
Podejście to z powodzeniem zastosowaliśmy w naszych badaniach porównawczych 4,5. Na ultracienkich odcinkach tkanki neuronalnej nakreślono obszar zainteresowania, a obrazy wykonano poprzez systematyczne, jednolite, losowe pobieranie próbek w tym obszarze. Należy zauważyć, że obszar zainteresowania, warstwa polimorficzna zakrętu zębatego, jest raczej małym obszarem do zbadania, co może być korzystne dla naszego podejścia. W losowo umieszczonej disekcji oceniliśmy liczbę DCV i kilka cech ultrastrukturalnych synaps w DGpl dorosłych myszy trzymanych w SE i EE, a także dorosłych myszy WT w porównaniu z dorosłymi myszami z nokautem NPY. Korzystając z naszego podejścia, zebrane dane wykazały zmiany w niektórych badanych parametrach. Wyniki te potwierdziły wyniki innych podobnych badań na młodych zwierzętach2.
Wadą eksperymentalnego wykorzystania tego przepływu pracy może być to, że to podejście oparte na wielu aplikacjach nie jest idealne pod względem przyjazności dla użytkownika, ponieważ użytkownicy muszą przyzwyczaić się do różnych interfejsów użytkownika (w naszym przypadku interfejsu użytkownika, sekcji szeregowej TEM, oprogramowania RPS i oprogramowania SerialEM). Nauczenie się sprawnego obsługi wszystkich aplikacji jest czasochłonne i powinno być brane pod uwagę. Jednak zainwestowanie czasu w naukę korzystania z tego przepływu pracy jest nadal wyraźnie korzystne w stosunku do czasu potrzebnego na analizę całych tomów z sekcją seryjną TEM. Metoda wykorzystania disektora umieszczonego poprzez systematyczne, jednolite losowe pobieranie próbek w obszarze zainteresowania jest wystarczająca do przedstawienia wiarygodnych danych1 bez konieczności badania dużej liczby odcinków/objętości.
Aby zmaksymalizować wyniki naszych badań, konieczne było zachowanie ostrożności podczas przygotowywania próbki, ponieważ zachowanie tkanki i struktur ma kluczowe znaczenie nie tylko dla oceny cech strukturalnych, ale także dla jednoznacznej identyfikacji obszaru zainteresowania. Kluczowym czynnikiem, a być może kolejną wadą tej metody, jest to, że wymagana jest wysoka jakość par ultracienkich przekrojów: w żadnym z odcinków nie może być żadnych ani zmarszczek pokrywających badany obszar, a grubość przekroju musi być zachowana jednorodna. Badacz musi być dobrze przeszkolony w zakresie ultramikrotomii. Należy również zachować ostrożność podczas obrazowania odcinków w TEM, ponieważ są one wrażliwe na uszkodzenia wiązką elektronów i mogą łatwo się rozerwać na strzępy. Ponadto ważne jest, aby wybrać odpowiednią liczbę obszarów pobierania próbek w ROI. W zależności od celu doświadczalnego, powiększenie mikrofotografii elektronowych musi być starannie ustawione. Dla naszych eksperymentów, w szczególności zliczania synaps w ośrodkowym układzie nerwowym, optymalnych jest 20 obszarów zainteresowania na jednej sekcji o powierzchni 30,25μm2. Zaleca się dobre przeszkolenie personelu w rozpoznawaniu danych cech (w naszym przypadku synaps, cech synaptycznych i DCV), aby uzyskać wiarygodne wyniki. Aby zidentyfikować synapsy, pęcherzyki synaptyczne muszą być możliwe do zidentyfikowania, a to wymaga rozdzielczości co najmniej 10 nm. W tym celu optymalne było powiększenie 5000X, ale należy zauważyć, że powiększenie zależy od parametrów sprzętowych, takich jak typ i położenie kamer, i musiałoby być dostosowane do innych typów mikroskopów i/lub kamer. Należy również zauważyć, że protokół korzysta z aplikacji specyficznych dla jednego TEM i że użytkownicy innych modeli muszą wziąć pod uwagę różnice w konfiguracji.
Wierzymy, że nasz przepływ pracy można dostosować do wielu innych zastosowań, nie tylko w neurobiologii, ale w szerokiej dziedzinie nauk biologicznych, a także materiałoznawstwa (gdy potrzebna jest wysoka rozdzielczość TEM), gdy pytanie badawcze wymaga systematycznego, jednolitego losowego pobierania próbek, a liczba próbek do zbadania wymaga efektywnego czasowo sposobu analizy. Na przykład obecnie interesuje nas lokalizacja zapasów żelaza w ludzkim mózgu. W tym celu niedawno dostosowaliśmy nasz przepływ pracy, aby umożliwić analizę elementarną na ultracienkich przekrojach w losowo wybranych obszarach. Aby zminimalizować liczbę aplikacji, które są potrzebne do przepływu pracy, staraliśmy się aplikować tylko za pomocą oprogramowania SerialEM, ponieważ można je zaprogramować tak, aby przesuwało stolik do wstępnie ustawionych punktów, które można wybrać w sposób losowy. Stworzyliśmy niestandardowe skrypty do sterowania TEM, w celu całkowitej automatyzacji przepływu pracy. Okazało się to wykonalne, z wyjątkiem autofokusa w trybie obrazowania z filtrem, który nie przyniósł satysfakcjonujących rezultatów. W związku z tym użyliśmy oprogramowania DM do ustawiania ostrości i uzyskiwania obrazów z filtrem energetycznym.
Podsumowując, przedstawiamy rozwiązania programowe, które pomagają w uzyskaniu mikrofotografii elektronowych w bezstronny sposób.

W mikroskopii elektronowej często trudno jest pobrać próbki reprezentatywnych obszarów w obrębie sekcji. My, jako obserwatorzy, często jesteśmy stronniczy, aby patrzeć na konkretne regiony, na które zwróciliśmy uwagę przez rzucające się w oczy cechy próbki, co uniemożliwia dobrze rozłożone, bezstronne pobieranie próbek. Błędu systematycznego próbkowania można uniknąć tylko wtedy, gdy każda część obszaru zainteresowania ma taką samą szansę na znalezienie się w mikrofotografii elektronowej1. Możliwe jest uniknięcie błędu systematycznego próbkowania bez rozwiązania programowego, na przykład poprzez ręczne przesuwanie trackballa mikroskopu bez patrzenia na obraz, tak aby wybrać obszary próbkowania w miejscu, w którym stolik się zatrzymuje. Ale ściśle mówiąc, nie jest to procedura przypadkowa, ponieważ świadomie lub podświadomie użytkownik może mieć wpływ na ruch sceny, a co więcej, nie jest to wyrafinowany sposób wyboru regionów próbkowania. Losowe pobieranie próbek staje się szczególnie ważne, jeśli pary sekcji są używane do oceny liczby struktur w określonej objętości, na przykład w przypadku stereology1, co wymaga par sekcji w znanej odległości od siebie. Możliwe byłoby również przyjrzenie się tylko pojedynczemu przekrojowi i oszacowanie liczby konkretnych struktur2, ale przy takim podejściu badacze mają tendencję do przeszacowywania gęstości liczbowej większych struktur, chyba że struktury są bardzo małe w porównaniu z grubością przekroju. Alternatywnym podejściem jest rekonstrukcja objętości tkanki z odcinków seryjnych i uzyskanie w ten sposób pożądanych danych3. Jest to jednak bardzo czasochłonne i niewykonalne podejście dla (większych) badań porównawczych.
Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy procedurę, która pozwala badaczowi automatycznie wybierać próbki do uzyskania mikrofotografii elektronów w regularnych odstępach między ultracienkimi sekcjami. Położenie mikrofotografii elektronowych jest losowe, co pozwala na bezstronne pobieranie próbek. Podejście to jest odpowiednie zarówno do określania gęstości liczbowych struktur (na przykład synaps w określonej objętości neuropilu4,5), jak i wymiarów cech strukturalnych (na przykład szerokości szczeliny synaptycznej lub średnicy gęstości postsynaptycznej4,5).
Przepływ pracy wykorzystuje specjalnie wykonane oprogramowanie do losowego próbkowania punktów (RPS) (napisane w skrypcie Java przy użyciu oprogramowania do skryptów dostarczonego z naszym mikroskopem), które automatycznie oblicza pozycje siatki w predefiniowanym obszarze zainteresowania w ultracienkim przekroju. Oprogramowanie RPS przenosi stolik mikroskopu elektronowego do tych predefiniowanych punktów, dzięki czemu w każdym punkcie można wykonać mikrofotografię elektronową. Najpierw użytkownik definiuje obszar zainteresowania w cienkim przekroju. Następnie oprogramowanie RPS oblicza pozycje siatki w tym regionie. Współrzędne x/y pierwszej pozycji są tworzone losowo, a pozostałe pozycje są umieszczane w regularnych odstępach siatki w stosunku do pierwszej pozycji. Ponieważ każda część obszaru zainteresowania ma taką samą szansę na zbadanie, pozwala to na minimalne gromadzenie danych. Takie podejście do próbkowania jest również nazywane systematycznym jednolitym próbkowaniem losowym (więcej szczegółów można znaleźć w references6,7).
Aby określić gęstości liczbowe konstrukcji, pracujemy z parami sekcji, które są oddalone od siebie o znanej odległości. Po uzyskaniu mikrofotografii elektronowej z pierwszej sekcji w jednej z wcześniej ustalonych pozycji, oprogramowanie TEM Serial Section (część pakietu oprogramowania dostarczanego z naszym mikroskopem elektronowym) przemieszcza się do odpowiedniego punktu w drugiej sekcji, w celu uzyskania mikrofotografii elektronowej odpowiedniego miejsca. Jest to powtarzane dla każdej lokalizacji w ustalonej siatce. W naszym podejściu disekcja służy do zliczania liczby cząstek w każdej parze mikrografów elektronowych8,9. Disektor składa się z pary ramek zliczających, po jednej dla każdej sekcji8,9. Gęstość liczbowa obiektów jest określana przez zliczanie tylko obiektów widocznych w pierwszej sekcji (lub sekcji odniesienia), ale nie w drugiej sekcji (lub sekcji odnośnika). Pozwala to na szybkie i efektywne oszacowanie gęstości numerycznych obiektów8,9. Dodatkowo na pojedynczych przekrojach można mierzyć dwuwymiarowe cechy konstrukcyjne.
Z powodzeniem zastosowaliśmy ten proces roboczy do oceny różnic w liczbie synaps w hipokampie myszy narażonych na warunki pomieszczeń w środowisku wzbogaconym (EE) w porównaniu do warunków pomieszczenia w środowisku standardowym (SE)4,5, a także do oceny ultrastrukturalnych różnic między myszami typu dzikiego (WT) a myszami z neuropeptydem Y (NPY) ko trzymanymi w warunkach SE i EE5. Naszym celem było przyjrzenie się w szczególności cechom strukturalnym neuronów, takim jak numeryczna gęstość synaptyczna, długości strefy aktywnej w przekrojach poprzecznych i gęstość postsynaptyczna, szerokość szczeliny synaptycznej i liczba pęcherzyków synaptycznych, w celu oceny zmian w łączności neuronalnej i aktywacji między różnymi warunkami eksperymentalnymi. Dodatkowo interesowała nas gęstość liczbowa pęcherzyków o gęstym rdzeniu (DCV) w neuronach, aby określić ilość zmagazynowanych neuropeptydów w określonym obszarze mózgu.
Opierając się na sukcesie naszego podejścia do badań opisanych powyżej, w naszym następnym kroku dostosowaliśmy nasz przepływ pracy, aby wybrać obszary do bezstronnych analiz pierwiastkowych w próbkach ludzkiego mózgu. Dokonano tego w celu zobrazowania żelaza, które jest przechowywane w cząsteczkach ferrytyny zarówno w neuronach, jak i komórkach glejowych. W tym celu opracowaliśmy skrypt, który pozwolił nam zautomatyzować większość operacji związanych z losowym procesem przesiewowym sekcji mózgu w określonym obszarze.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Diahyd glutarowy</td><td>Science</td><td>Services E 16210</td><td>25%; 100ml; </td></tr><tr><td>Bufor kakodylowy</td> klasy EM <td>Merck</td><td>C4945</td><td>250g; Kwas dimetyloarsynowy sodu trójwodny</td></tr><tr><td>Octan tioniny/Ceristain</td><td>Merck</td><td>861340</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck</td><td>1064951000</td><td>1 kg, granulki</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Science Services</td><td>E 19110</td><td>10x1g</td></tr><tr><td>Żywica do zatapiania TAAB Science</td><td>Services</td><td>TAT001</td><td>500g</td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Usługi Naukowe</td><td>TAD024</td><td>100g</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Usługi Naukowe</td><td>TAD025</td><td>500g</td></tr><tr><td>Octan uranylu dwuwodny</td><td>Plano GmbH</td><td>19481</td><td>zubożony, 25g</td></tr><tr><td>Ultrastain 2</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td>Cytrynian ołowiu</td></tr><tr><td>Niebieski roztwór toluidyny</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1727</td><td>10g</td></tr><tr><td>Pioloform</td><td>Plano GmbH</td><td>R1275</td><td>10g Proylenoxide</td></tr><tr><td></td><td>w proszku SigmaAldrich</td><td>82320-1L</td><td>1L</td></tr><tr><td>DPX medium do zatapiania</td><td>Plano GmbH R1320</td><td></td><td>do półcienkich przekrojów na szkiełku szkiełkowym, 50 ml</td></tr><tr><td>Vibratome, Leica VT 1000</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Ultracut UCT, ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 20</td><td>FEI,Eindhoven, Holandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera szerokokątna Megaview</td><td>Olympus Soft Imaging Solution, M&uuml; nster, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy US 1000</td><td>Gatan, Pleasanton, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania TEM</td><td>FEI, Eindhoven, Holandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie sekcji szeregowej FEI</td><td>FEI, Eindhoven, Holandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fidżi, ImageJ 1.52e</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 20.0</td><td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>Regents of the University of Colorado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPS (losowe próbkowanie punktowe) oprogramowanie 0.9a</td><td>na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disektor v1.0.2 (makro ImageJ)</td><td>na</td><td></td><td></td>zamówienie</tr><tr><td>EFTEMSerialEM (skrypt SerialEM)</td><td>na zamówienie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bezstronne podejście do pobierania próbek z odcinków tem w neuronauce

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Badania ultrastrukturalnych cech neuronów i ich synaps są możliwe tylko za pomocą mikroskopii elektronowej. Szczególnie w przypadku badań porównawczych zmian gęstości i rozkładu takich cech, bezstronny protokół pobierania próbek ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników. W tym miejscu przedstawiamy przebieg procesu pozyskiwania obrazów próbek mózgu. Przepływ pracy umożliwia systematyczne, jednolite losowe pobieranie próbek w określonym obszarze mózgu, a obrazy mogą być analizowane za pomocą disektora. Technika ta jest znacznie szybsza niż obszerne badanie przekrojów seryjnych, ale nadal stanowi wykonalne podejście do szacowania gęstości i rozkładów cech ultrastruktury. Przed osadzeniem wykorzystano barwione skrawki wibratomu jako odniesienie do identyfikacji badanego obszaru mózgu, co pomogło przyspieszyć cały proces przygotowania próbki. Podejście to wykorzystano w badaniach porównawczych badających wpływ środowiska wzbogaconego mieszkania na kilka parametrów ultrastrukturalnych w mózgu myszy. Opierając się na udanym wykorzystaniu przepływu pracy, dostosowaliśmy go do celów analizy elementarnej próbek mózgu. Zoptymalizowaliśmy protokół pod kątem czasu interakcji użytkownika. Automatyzacja wszystkich czasochłonnych kroków poprzez kompilację skryptu dla oprogramowania open source SerialEM pomaga użytkownikowi skupić się na głównej pracy polegającej na pozyskiwaniu map elementarnych. Podobnie jak w pierwotnym przepływie pracy, zwróciliśmy uwagę na bezstronne podejście do pobierania próbek, aby zagwarantować wiarygodne wyniki.

W niniejszej pracy opisujemy schemat postępowania umożliwiający automatyczny i nieobiektywny wybór obszarów do analizy za pomocą TEM. Użytkownik wybiera interesujący go obszar w obrębie ultraprzesieki pod mikroskopem TEM, a następnie wykorzystuje kilka rozwiązań programistycznych, w tym nasze oprogramowanie RPS, które automatycznie oblicza współrzędne 20 obszarów próbkowania w obrębie wybranego obszaru. Następnie stolik TEM zostaje przesunięty do każdego obszaru próbkowania w celu wykonania fotografii. Jest to możliwe zarówno w przypadku analizy pojedynczych przesiek, jak i par przesiek oddalonych od siebie o znaną odległość, co pozwala na wybór obszarów do obrazowania bez wprowadzania stronniczości badacza.
Ten schemat postępowania okazał się wartościowy podczas dokumentowania cech ultrastrukturalnych w przekrojach mózgu myszy4,5. W badaniach tych jako obszar zainteresowania analizowano warstwę komórek ziarnistych zakrętu zębatego (DGpl). Nasza metoda okazała się odpowiednia do badania DG, ponieważ przekrój czołowy grzbietowej części DG (Bregma −1.3) mieści się w ultra-cienkim skrawku, a jego kontury są łatwo rozpoznawalne przy niskim powiększeniu. W przypadku badania innych obszarów mózgu istotne byłoby sprawdzenie ich wielkości oraz cech charakterystycznych przed zaplanowaniem eksperymentów.
Zastosowanie opisanego tutaj schematu pracy wykazało, że wzbogacenie środowiskowe (EE) znacząco zwiększa szerokość szczeliny synaptycznej w DGpl4 w porównaniu do standardowych warunków utrzymania. Ponadto liczba pęcherzyków o gęstym rdzeniu była znacząco zmniejszona u zwierząt w warunkach EE4, co wskazuje na zmiany w gospodarce neuropeptydów. W przypadku myszy WT oraz z nokautem NPY utrzymywanych w warunkach EE, liczba neuronów/µm³ w DGpl wzrosła, podczas gdy gęstość DCV spadła w stosunku do standardowego utrzymania (SE)5. Z kolei nokaut NPY spowodował znaczący wzrost liczby pęcherzyków synaptycznych w puli rezerwowej (niedopasowane pęcherzyki synaptyczne) niezależnie od warunków utrzymania5. Efekt EE na szerokość szczeliny synaptycznej został odwrócony w grupie NPY KO, co doprowadziło do znaczącej różnicy między myszami WT i NPY KO utrzymywanymi w warunkach EE5. W połączeniu z badaniami behawioralnymi zwierząt WT i z nokautem NPY utrzymywanych w obu typach warunków, wskazuje to na kluczową rolę NPY w neurobiologicznych efektach EE5.
W celu wizualizacji żelaza zgromadzonego w ludzkim mózgu opracowano skrypt dla oprogramowania SerialEM, służący do losowego wyboru punktów akwizycji z całego ultracienkiego przekroju, w celu uzyskania mikrografii elektronowej z filtrowaniem energii w każdym z tych punktów. Po wprowadzeniu przekroju do mikroskopu elektronowego skrypt przeprowadził stabilizację przekroju (t. j.., rutyny „gotowania preparatów” specimen-cooking) przez noc. Następnie skrypt losowo wybierał z tych oznaczonych siatką określoną przez użytkownika liczbę punktów w Rycina 3Poprzez generowanie mikrofotografii testowej i sprawdzanie poziomów szarości, skrypt weryfikował, czy wybrane punkty znajdują się na widocznej części przekroju, odrzucając punkty położone na prętach siatki. Większość procesu była realizowana przez skrypt przy minimalnej interakcji użytkownika. Niemniej jednak, przy tej konfiguracji nie było możliwe automatyczne rejestrowanie mikrofotografii filtrowanych energetycznie, ponieważ ilość światła była niewystarczająca dla procedury autofokusa programu SerialEM. W związku z tym, gdy tylko skrypt przesunął stolik do każdego z punktów, przełączaliśmy się na oprogramowanie DM, po czym ręcznie regulowaliśmy ostrość i wykonywaliśmy obraz EFTEM żelaza. Przykład obrazu EFTEM żelaza z ludzkiego mózgu post-mortem przedstawiono w Rycina 4.
<img alt="Schemat metody przygotowania próbek, sekcjonowania i obrazowania; schemat analizy próbek mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ilustracja schematu postępowania. (A) Przedstawiono główne etapy przygotowania próbek (zgodnie z kierunkiem strzałek): sekcje wykonane w wibrotomie (i), zatapianie (ii), wycinanie sekcji półcienkich i ultracienkich (iii) oraz zbieranie par sekcji ultracienkich na siatkach miedzianych (iv). (B) Wykorzystanie zarówno oprogramowania dostarczonego przez producenta mikroskopu, jak i autorskiego oprogramowania RPS do tworzenia współrzędnych obszarów próbkowania, które wyznaczają miejsca rejestracji. Punkty narożne sekcji są zapisywane w oprogramowaniu mikroskopowym, a ROI zostaje obrysowany (zidentyfikowany przy pomocy sekcji półcienkich) (i); nad ROI generowana jest siatka obszarów próbkowania, wprowadzając losne przesunięcie (czerwona strzałka) w osiach x i y. Przesunięcie jest mniejsze niż odległość między obszarami próbkowania (czarne strzałki), tak aby zamiast czarnych kwadratów, które nie mają przesunięcia, wykorzystano niebieskie kwadraty, przesunięte losowo, do wyznaczenia miejsc rejestracji (ii); do rejestracji wykorzystuje się wyłącznie obszary próbkowania znajdujące się w granicach ROI (narysowane jako czarne i niebieskie kwadraty). Mikrografie wykonuje się zarówno w sekcji referencyjnej (czarne kwadraty), jak i w odpowiadających im miejscach w sekcji poszukiwawczej (niebieskie kwadraty) (iii). (C) W każdym obszarze próbkowania wykonuje się mikrograf przy odpowiednim powiększeniu; w razie potrzeby tworzy się montaż składający się z kilku połączonych obrazów (w tym przypadku połączono obrazy 2 x 2) (i); generowana jest ramka liczbowa wyświetlana jako nakładka na obrazie; liczone będą struktury wewnątrz ramki oraz na „liniach akceptacji” (przerywane linie ramki), ale nie te na „liniach zakazanych” (ciągłe linie ramki) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa elektronowa z użyciem ObjectJ; adnotowany schemat analizy obrazu i wyświetlanie wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Pomiar parametrów ultrastrukturalnych na parze ultrascienkich przekrojów z wykorzystaniem nieobciążonej ramki zliczającej. (A) Przegląd okien programu ImageJ wykorzystywanych do zliczania i analizowania struktur komórkowych. Po lewej stronie widoczna jest mikrografia elektronowa z nałożoną ramką zliczającą. Po prawej stronie: interfejs użytkownika ImageJ (niebieski prostokąt) z menu rozwijanym (u góry) i paskiem narzędzi Toolbar (poniżej); edytor obiektów ObjectJ (zielony prostokąt); okno ObjectJ Tools (pomarańczowy prostokąt), w którym można wybrać narzędzia do pomiarów, oraz okno ObjectJ results (czarny prostokąt), w którym dokumentowane są wszystkie pomiary. (B) Szczegół z A przedstawiający zaznaczone synapsy na mikrografii elektronowej (synapsy na obu przekrojach – strzałki; synapsa tylko na przekroju referencyjnym – groty strzałek). Są one zaznaczane przy użyciu narzędzia Multipoint-Tool (czerwone koło) z paska narzędzi Toolbar w programie ImageJ. (C) Nazwy i parametry pomiarowe cech synaptycznych są definiowane za pomocą ObjectJ Tools. Wybierane są Marker-Tool oraz interesująca cecha, a następnie obrys struktury jest rysowany na obrazie poprzez kliknięcia lewym przyciskiem myszy wzdłuż struktury. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy siatek; analiza rozmiaru cech, badanie mikrostruktury, badania materiałowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wybór obszarów próbkowania dla mapowania pierwiastkowego w obrębie ROI dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej z filtrowaniem energii. Program SerialEM służy do wyboru obszaru zainteresowania (ROI) oraz sugerowania licznych obszarów próbkowania w regularnych odstępach (różowe krzyżyki na obrazach A i B). Następnie skrypt losowo wybiera obszary próbkowania (z tych zdefiniowanych wcześniej współrzędnych) do akwizycji. Obszary próbkowania ze słabym oświetleniem są odrzucane, aby uniknąć prętów siatki, a skrypt zatrzymuje się natychmiast po wybraniu 20 dobrze oświetlonych obszarów próbkowania w obrębie ROI. (A) Przegląd całego obszaru zainteresowania, obrysowanego wielokątem, z zaznaczonymi znakami X licznymi potencjalnymi obszarami próbkowania. (B) Szczegół obrazu A przedstawiający obszary próbkowania przed losowym wyborem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa ultrastruktury komórkowej z obszarami o dużym powiększeniu; analiza subkomórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przykład pozyskiwania mapy pierwiastkowej (EFTEM). (A) Mikrograf TEM w jasnym polu obszaru wokół punktu akwizycji. Do uzyskania mapy pierwiastkowej wykorzystano losowo wybrany obszar, zaznaczony czarnym prostokątem. (B) Obraz okna przedkrawędziowego EFTEM wykonany w losowo wybranym obszarze. (C) Obraz okna pozakrawędziowego EFTEM wykonany w tym samym obszarze. (D) Mapa pierwiastkowa żelaza tego samego obszaru (krawędź M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Wprowadzamy nowatorski przepływ pracy do badań tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii elektronowej. Metoda pozwala użytkownikowi na bezstronne badanie cech neuronalnych. Do analizy elementarnej przedstawiamy również skrypt, który automatyzuje większość przepływu pracy dla losowego próbkowania.

Bezstronne podejście do pobierania próbek z odcinków TEM w neuronauce

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Bezstronny protokół pobierania próbek ma zasadnicze znaczenie dla mikroskopii elektronowej. Jeśli chcesz określić ilościowo gęstość liczbową synaps lub innych struktur w określonym obszarze mózgu, główną zaletą naszej techniki jest to, że jest ona bezstronna i umożliwia automatyczne tworzenie mikrofotografii elektronowych przy minimalnej interwencji użytkownika. Technika ta jest również cenna w innych obszarach badawczych, takich jak neuronauka, gdzie może być wykorzystana do oceny siły sieci neuronowej.Aby zastosować nasz protokół, konieczne jest doświadczenie w technikach mikroskopii elektronowej, takich jak przygotowanie próbki i obsługa przejściowego mikroskopu elektronowego. Naszą procedurę zademonstruje dr Stefan Wernitznig, post-doc z mojego laboratorium. Protokół ten polega na przygotowaniu próbek mózgu do mikroskopii elektronowej, wycinaniu par cienkich odcinków.Następnie opisze, jak automatycznie wygenerować określoną liczbę mikrofotografii elektronowych w obszarze zainteresowania. Następnie użyje ramki zliczającej do oceny gęstości liczbowej cech strukturalnych. Aby rozpocząć, przeanalizuj, naprawij, utrwal i osadź interesujące próbki w żywicy do zatapiania, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.Następnie umieść próbkę na ultramikrotomie i wyprodukuj ultracienkie odcinki szeregowe o długości 55 nanometrów. Umieść sekcje na siatce szczelinowej o wymiarach jeden milimetr na dwa milimetry, pokrytej formą piola. Następnie przebarwiaj ultracienkie sekcje na siatkach szczelinowych za pomocą 2% octanu uranylu przez 30 minut, a następnie cytrynianu ołowiu przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.Umieść siatkę w TEM i zbadaj sekcje na siatce za pomocą TEM przy użyciu małego powiększenia, aby zorientować się i ocenić jakość sekcji. Następnie uruchom oprogramowanie TEM Serial Section, wybierz opcję Section i wybierz opcję Wstaw, aby dodać punkty narożne dla sekcji odniesienia i odnośnika. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w wyskakującym okienku.Zacznij od sekcji referencyjnej, a następnie kontynuuj pracę z sekcją wyszukiwania. Upewnij się, że krawędzie sekcji są równoległe do następnej sekcji, gdy wprowadzane są punkty pierwszy i drugi. Następnie zwizualizuj sekcję referencyjną w małym powiększeniu, aby zidentyfikować obszar zainteresowania.Przesuń stolik mikroskopu za pomocą analizy obrazu TEM w sekcji referencyjnej do wielu punktów narożnych zwrotu z inwestycji, aby utworzyć kontur zwrotu z inwestycji. Zapisz współrzędne wynikowego wielokąta za pomocą oprogramowania do losowego próbkowania punktów. W tym celu naciśnij Dodaj współrzędne w oknie dialogowym oprogramowania do losowego próbkowania punktów w każdym punkcie wielokąta, który jest potrzebny do nakreślenia ROI w przekroju.Następnie zdefiniuj i wprowadź odpowiedni rozmiar obszarów próbkowania i odległości między obszarami w oprogramowaniu do próbkowania punktów losowych. Następnie naciśnij przycisk Oblicz raster, aby wygenerować współrzędne w systematyczny, jednolity i losowy sposób dla pozycji mikrografu w wielokącie. Zapisz punkty próbkowania w sekcjach odniesienia i przeglądu, korzystając z oprogramowania do próbkowania punktów losowych i oprogramowania TEM Serial Section.Są to współrzędne montaży, które są później nagrywane. W oprogramowaniu do pobierania próbek z punktów losowych naciśnij przejdź do następnej pozycji, aby przesunąć stolik mikroskopu do współrzędnych x i y każdego obszaru pobierania próbek w sekcji referencyjnej. Następnie wybierz opcję Lokalizacja i wybierz opcję Wstaw, aby zaimportować te współrzędne w oprogramowaniu TEM Serial Section w sekcji referencyjnej.Powtórz to dla wszystkich współrzędnych. Aby odbić lustrzanie współrzędne z sekcji odwołania do sekcji wyszukiwania, wybierz opcję Sekcja i wybierz pozycję Przejdź do sekcji. Wprowadź numer sekcji odnośnika w oknie dialogowym.W celu nagrania montaży przełączaj się między sekcją odniesienia i wyszukiwania, jak opisano wcześniej, a następnie zmień pozycję w sekcji referencyjnej z lokalizacją i przejdź do numeru. Wybierz następną współrzędną w oknie dialogowym. W przypadku montaży SerialEM, przy każdej współrzędnej próbkowania, przejdź do Plik i wybierz Nowy montaż z menu rozwijanego.Wybierz odpowiednią liczbę kafelków i procent nakładania się w oknie dialogowym. W niniejszym badaniu powiększenie 5000 jest wystarczające do rozpoznania cech synaptycznych w badaniu. Jednak ograniczone pole widzenia kamery CCD wymagało wykonywania montaży obrazów dwa na dwa.Montaże wykonywane są dla SerialEM. Przed nagraniem każdego montażu ponownie wyreguluj ostrość lub aktywuj opcję automatycznego ustawiania ostrości w oprogramowaniu do nagrywania. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik montażu i rozpocznij nagrywanie montażu, naciskając Start w podmenu montażu, po lewej stronie w SerialEM.Uruchom mikrodysektor i zdefiniuj rozmiar ramki liczącej oraz liczbę segmentów zgodnie z potrzebami. Policz gęstość synaps za pomocą makra dyssektora. Korzystając z narzędzia wielopunktowego znajdującego się na pasku narzędzi, ogranicz te synapsy, które przecinają się z dwiema zakazanymi liniami dyssektora, ale policz synapsy na przeciwległych liniach akceptacji.Zaznacz każdą synapsę w ramce zliczania, która jest widoczna w sekcji referencyjnej, ale nie jest widoczna w sekcji wyszukiwania, za pomocą owalnego zaznaczenia. Do pomiaru parametrów synaps należy wybrać tylko synapsy z rozszczepem synaptycznym zorientowanym w przekroju poprzecznym, który znajduje się w sekcji referencyjnej. Powinno to znajdować się w tych samych klatkach obrazu, które są używane do sekcji.Następnie przejdź do Wtyczki, a następnie do Analizuj i uruchom wtyczkę ObjectJ z menu rozwijanego. Otwórz nowy projekt z rozwijanego okna dialogowego ObjectJ, które otworzy okno, które pozwoli użytkownikowi obrysować i oznaczyć struktury za pomocą narzędzia znacznika. Najpierw użyj narzędzia marker, aby zmierzyć długość błony presynaptycznej i długość gęstości postsynaptycznej, rysując linię wzdłuż struktury.Następnie uzyskaj średnią szerokość szczeliny synaptycznej, rysując wielokąt, pokrywający zarówno błonę przed, jak i postsynaptyczną. Aby określić liczbę zadokowanych pęcherzyków, policz wszystkie pęcherzyki, które mają maksymalną odległość od błony presynaptycznej o średnicy jednego pęcherzyka lub mniejszą. Następnie określ liczbę niezadokowanych pęcherzyków, licząc pęcherzyki z maksymalną odległością jednej średnicy pęcherzyka od zadokowanych lub innych niezadokowanych pęcherzyków w tej samej synapsie.Dostosowana wersja protokołu umożliwia przeprowadzanie analiz elementarnych w bezstronnie uzyskanych lokalizacjach w obrębie ultracienkiego przekroju. W tym celu w trybie obrazowania TEM uruchom SerialEM i otwórz nowy projekt. Następnie otwórz Nawigatora i sprawdź ustawienia kamery w kontrolkach kamery i skryptu dla widoku i nagrywania oraz uruchamiania widoku.Aby utworzyć mapę narożną ultracienkiego przekroju, wybierz opcję Dodaj punkty w oknie Nawigatora. Następnie ustaw punkty narożne na krawędziach ultracienkiego przekroju. Przesuń scenę do punktu narożnego, przytrzymując prawy myszy.Po osiągnięciu narożnika sekcji dodaj punkt narożny za pomocą lewego przycisku myszy. Powtórz procedurę, aby dodać trzy kolejne punkty narożne. Upewnij się, że w oknie Nawigatora pole C dla punktów narożnych jest zaznaczone dla zapisanych punktów.Aby rozpocząć montaż narożny, przejdź do Nawigatora na pasku menu SerialEM i wybierz z menu rozwijanego opcje Montaging Grids and Setup Corner Montage. Wybierz Dodaj wielokąt w oknie Nawigatora i obrysuj obszar zainteresowania za pomocą wielu kliknięć prawym przyciskiem myszy. Następnie wybierz opcję Dodaj siatkę punktów z menu rozwijanego Nawigator i zdefiniuj odległość między punktami.Uruchom skrypt EFTEMSerialEM, postępuj zgodnie z poleceniami skryptu, wprowadź liczbę punktów siatki, jak pokazano w Nawigatorze i wprowadź liczbę punktów akwizycji. Następnie ustaw próg oświetlenia, aby skrypt mógł unikać pasków siatki. Postępuj zgodnie z poleceniami skryptu i przesuń stół montażowy ręcznie, aby pokryć pole widzenia o jedną czwartą paska siatki.Zgodnie z wyświetlaną wartością wprowadź wartość progową oświetlenia, która jest wyższa niż wyświetlana wartość. Poczekaj, aż punkty do zdobycia zostaną wybrane, a procedura gotowania zostanie zakończona. Zajmuje to dużo czasu i można to zrobić z dnia na dzień.Po skonfigurowaniu analizy elementarnej TEM z filtrem energetycznym uzyskaj mapę elementów z ustawieniami specyficznymi dla żywiołów. Bezstronne podejście do próbkowania jest przydatne do liczenia i analizowania cech synaptycznych w określonych regionach mózgu. Dodatkowo, skrypt EFTEMSerialEM dla oprogramowania SerialEM pozwala na losowy wybór punktów akwizycji z całego ultracienkiego przekroju, w celu uzyskania przefiltrowanego energetycznie mikrografu elektronowego w każdym z tych punktów.Skrypt losowo wybierał liczbę punktów, predefiniowanych przez użytkownika spośród tych oznaczonych oceną. Tworząc mikrofotografię testową i sprawdzając jej poziomy ocen, skrypt sprawdzał, czy wybrane punkty znajdują się w widocznej części sekcji, odrzucając punkty, które wylądowały na paskach siatki. Większość przepływu pracy była obsługiwana przez skrypt, przy minimalnej interakcji użytkownika.Jednak w przypadku pokazanej tutaj próbki było zbyt mało światła dla procedury automatycznego ustawiania ostrości w SerialEM. Dlatego, gdy tylko scenariusz przenosił scenę do każdego punktu, ostrość była dostosowywana, a mapa żywiołów była tworzona z żelaza. Ważne jest, aby starannie wybrać obszar zainteresowania i upewnić się, że taka sama liczba punktów poboru próbek przypada na każdy obszar zainteresowania.Nie zapominaj, że wiele chemikaliów używanych do przygotowania próbek jest toksycznych. Noś więc fartuch laboratoryjny i rękawice ochronne i pracuj pod osłoną oparów.

an-unbiased-approach-of-sampling-tem-sections-in-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Bankowanie mózgu i systematyczne pobieranie próbek materiału biologicznego stanowią podstawę do bezstronnej stereologii i pozwalają na maksymalne wykorzystanie danych uzyskanych z każdego preparatu.

Bankowanie mózgów: maksymalne wykorzystanie materiału badawczego

Anatomiczna organizacja mózgu naczelnych może dostarczyć istotnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi. Obiektywna stereologia jest metodą dokładnego i wydajnego szacowania całkowitej liczby neuronów (lub innego typu komórek) w danym obszarze referencyjnym1.

Wiedza o tym, co liczy się w analizie: nieobciążona stereologia w mózgu naczelnych zwierząt niebędących ludźmi

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Wykorzystujemy magnetoencefalografię i elektroencefalografię (MEG/EEG), w połączeniu z informacjami anatomicznymi uzyskanymi za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI), aby zmapować dynamikę sieci korowej związanej z uwagą słuchową.

Mapowanie dynamiki korowej z wykorzystaniem jednoczesnej MEG/EEG oraz oszacowań minimalnej normy z ograniczeniami anatomicznymi: przykład uwagi słuchowej

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Tutaj prezentujemy metodę stereologiczną, frakcjonator optyczny, używany do ilościowego określenia powstawania nowych neuronów i ich przeżycia w hipokampie szczura po stymulacji elektrowstrząsowej. Przy prawidłowym wdrożeniu, czułość i wydajność metod stereologicznych zapewnia dokładne oszacowania ze stałą i z góry określoną precyzją.

Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Szczegółowo opisujemy, jak przeprowadzić metaanalizę badań neuroobrazowania opartych na wokselach za pomocą Mapowania d opartego na nasionach z permutacją obrazów obiektowych (SDM-PSI).

Metaanaliza badań neuroobrazowania opartych na wokselach przy użyciu mapowania d opartego na nasionach z permutacją obrazów obiektowych (SDM-PSI)

Opisana tutaj jest procedura stereotaktyczna, która może celować w trudne i trudno dostępne obszary mózgu (ze względu na ograniczenia przestrzenne) przy użyciu kątowego podejścia koronalnego. Protokół ten można dostosować zarówno do modeli mysich, jak i szczurzych i może być stosowany do różnych zastosowań neuronaukowych, w tym implantacji kaniuli i mikroiniekcji konstruktów wirusowych.

Adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Protokół pokazuje powtarzające się pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi od szczurów z padaczką, wykonywane równolegle z ciągłym monitorowaniem wideo-elektroencefalogramu (EEG). Są one niezbędne do zbadania możliwych powiązań między zmianami w różnych cząsteczkach płynów ustrojowych a aktywnością napadową.

Pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi z żyły ogonowej bocznej u szczurów podczas zapisów EEG

Poznaj bezstronną metodę pobierania próbek z odcinków TEM w neuronauce, umożliwiającą automatyczną analizę mikrografów elektronowych z minimalnym udziałem użytkownika. Technika ta usprawnia ilościowe badanie gęstości synaps i parametrów strukturalnych w tkance mózgowej.

Bezstronne podejście do pobierania próbek z odcinków TEM w neuronauce

Przeglądaj więcej filmów