Name: Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj przygotowanie próbek grzybowych i roślinnych do badań NMR i DNP w stanie stałym. Ta metoda umożliwia analizę strukturalną biomateriałów z rozdzielczością atomową w ich naturalnym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation poprzez NSF OIA-1833040. Narodowe Laboratorium Silnych Pól Magnetycznych (NHMFL) jest wspierane przez National Science Foundation za pośrednictwem DMR-1157490 i stan Floryda. System MAS-DNP w NHMFL jest częściowo finansowany przez NIH S10 OD018519 i NSF CHE-1229170.

1. Wzrost 13C, 15N znakowanego Aspergillus fumigatus Liquid Medium
<ol>
	<li>Przygotowanie nieznakowanej i 13C, 15N znakowanej pożywki wzrostowej 
	UWAGA: Do utrzymania hodowli grzybów użyto zarówno pożywki z dekstrozy peptonowej z ekstraktem drożdżowym (YPD), jak i ulepszonego minimalnego podłoża 43. Wszystkie etapy po autoklawowaniu są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
	<ol>
		<li>Przygotowanie nieznakowanego płynnego podłoża: Rozpuścić 6,5 g proszku YPD w 100 ml wody destylowanej, a następnie sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 134 °C.</li>
		<li>Przygotowanie nieoznakowanego podłoża stałego
		<ol>
			<li>Dodać 1,5 g agaru i 6,5 g proszku YPD do 100 ml wody destylowanej.</li>
			<li>Podłoże należy sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 121 °C, a następnie schłodzić do temperatury około 50 °C.</li>
			<li>Przenieś 13-15 ml pożywki do każdej wstępnie sterylnej plastikowej szalki Petriego i natychmiast przykryj naczynie pokrywką.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie 13C, 15N znakowanego płynnym podłożem 
		UWAGA: Aby przygotować roztwór wzrostowy do znakowania izotopowego, minimalną pożywkę zawierającą 13C-glukozę i 15azotan N-sodu oraz roztwór pierwiastka śladowego przygotowuje się oddzielnie, a następnie miesza przed użyciem.
		<ol>
			<li>Przygotować 100 ml minimalnej pożywki zawierającej izotopy, jak podano w tabeli 1. Doprowadzić pH do 6,6 za pomocą roztworu NaOH (1 M) lub HCl (1M).</li>
			<li>Autoklawować w monoklawie minimalną pożywkę przez 25 minut w temperaturze 121 °C.</li>
			<li>Przygotować 100 ml (1000x) roztworu pierwiastków śladowych, rozpuścić sole wymienione w tabeli 2 w wodzie destylowanej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 134 °C. Ostudzić i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania. pH wyniesie około 6,5 i można je sprawdzić za pomocą pH-metru.</li>
			<li>Przed użyciem dodać 0,1 ml roztworu pierwiastków śladowych do 100 ml minimalnego podłoża w temperaturze 13C, 15N, jak podano w Tabeli 2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzrost materiałów grzybowych
	<ol>
		<li>Przenieś niewielką ilość grzybów z magazynu na płytkę YPD za pomocą pętli zaszczepiającej w okapie z przepływem laminarnym. Przechowywać kulturę w temperaturze 30 °C przez 2 dni w inkubatorze.</li>
		<li>Użyj pętli zaszczepiającej, aby przenieść aktywną krawędź rosnącego grzyba do roztworu znakującego 13 C,15N w okapie z przepływem laminarnym. Przechowywać kulturę w temperaturze 30 °C przez 3-5 dni z prędkością 220 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
		<li>Wirować przy 4 000 x g przez 20 minut. Usunąć supernatant i zebrać osad.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby zebrać ~ 0,5 g dobrze uwodnionego granulatu (>50% wag. uwodnienia) do badań NMR. Utrata nawodnienia w dowolnym momencie znacznie pogorszy rozdzielczość widmową. 
		UWAGA: W razie potrzeby, niewielka ilość (0,1 g) uwodnionej grzybni może zostać oddzielona i całkowicie wysuszona pod przepływem gazuN2 w kapturze lub liofilizarze, aby oszacować poziom nawodnienia i obliczyć procent suchej masy. Zazwyczaj pellet zawierający ~0,3 g suchej masy można uzyskać po 3 dniach. Jeśli eksperyment NMR, który ma być przeprowadzony, jest długi (>7 dni) i/lub jeśli stan grzybów wymaga ustalenia, materiał grzybowy można głęboko zamrozić w płynieN2 na 10-20 minut przed dalszym przetwarzaniem. Jeśli eksperyment będzie krótki (3-6 dni), zamrażanie można pominąć, aby próbka pozostała świeża.</li>
		<li>Nadmiar materiału wymieszać z 20% (v/v) glicerolu w probówce wirówkowej i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 oC do długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie A. fumigatus do badań NMR i DNP w stanie stałym
<ol>
	<li>Przygotowanie A. fumigatus do eksperymentów NMR w stanie stałym
	<ol>
		<li>Próbkę grzybów znakowaną izotopem 13C, 15N (etap 1.2.4) należy dializować w stosunku do 1 l 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,0) w temperaturze 4°C za pomocą worka do dializy z odciętą masą cząsteczkową 3,5 kDa w celu usunięcia małych cząsteczek z pożywki wzrostowej przez łączny okres 3 dni. Zmieniaj bufor dwa razy dziennie. 
		UWAGA: Alternatywnie próbkę można myć 6-10 razy przy użyciu wody dejonizowanej w celu usunięcia resztek małych cząsteczek.</li>
		<li>Przenieść próbkę do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut (10 000 x g) za pomocą wirówki stołowej. Usuń supernatant i zbierz pozostałe materiały grzybowe.</li>
		<li>Umieść 70-80 mg równomiernie 13znakowanej C i dobrze uwodnionej pasty próbki do 4-milimetrowego wirnika ZrO2 lub rotora 30-50 mg do 3,2 mm do eksperymentów NMR. Kilkakrotnie delikatnie ściskać próbkę za pomocą metalowego pręta i wchłaniać nadmiar wody za pomocą papieru.</li>
		<li>Szczelnie zakryj wirnik i włóż próbkę do spektrometru w celu scharakteryzowania NMR w stanie stałym. 
		UWAGA: Sugeruje się, aby fabrycznie nowe wirniki zminimalizować możliwość awarii wirnika i rozlania próbki w spektrometrze NMR. W razie potrzeby jednorazowa wkładka Kel-F ze uszczelniającymi może służyć jako pojemnik wtórny wewnątrz wirnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek A. fumigatus do doświadczeń DNP
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 μl rozpuszczalników DNP29,44 (znany również jako matryca DNP) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dla 13 C,15próbek grzybów znakowanych N. Ta matryca DNP zawiera mieszaninę d 8-glicerolu/D2O/H2O (60/30/10 Vol%). 
		UWAGA: Jeśli mają być badane próbki nieznakowane, należy przygotować matrycę DNP przy użyciu 13 d-8-glicerolu zubożonego w C (12C 3, 99,95%; D8, 98%) orazD2OiH2O, aby uniknąć udziału rozpuszczalników w sygnale 13C.</li>
		<li>Rozpuścić 0,7 mg AMUPol45 w 100 μl rozpuszczalników DNP, aby utworzyć 10 mM radykalnego roztworu podstawowego. Wirować przez 2-3 minuty, aby upewnić się, że rodniki są całkowicie rozpuszczone w roztworze.</li>
		<li>Namoczyć 10 mg dializowanych 13C, 15N znakowanych materiałami grzybowymi zgodnie z opisem w poprzednich krokach (kroki 2.1.1 i 2.1.2) w 50 μl roztworu AMUPolu i delikatnie zmielić mieszaninę za pomocą tłuczka i moździerza, aby zapewnić przenikanie rodników do porowatych ścian komórkowych><.
		UWAGA: Aby zmniejszyć szybkość utraty nawodnienia, mielenie może również odbywać się w probówce mikrowirówkowej za pomocą mikrotłuczka.</li>
		<li>Dodaj kolejne 30 μl roztworu rodnika do zmielonego osadu, aby jeszcze bardziej uwodnić próbkę grzyba.</li>
		<li>Zapakuj granulat do szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm, delikatnie ściśnij i usuń nadmiar rozpuszczalnika DNP. Dodaj silikonową zatyczkę o średnicy 3,2 mm, aby zapobiec utracie nawilżenia. Zazwyczaj do wirnika można zapakować 5-30 mg próbki. Dokładna ilość musi być określona na podstawie wymagań dotyczących czułości eksperymentów NMR, które mają być przeprowadzone.</li>
		<li>Włożyć i odkręcić próbkę do spektrometru DNP, zmierzyć widmo wzmocnione DNP pod wpływem promieniowania mikrofalowego i porównać je z widmem wyłączonym z mikrofal. Doprowadzi to dowłączenia/wyłączenia ε współczynnika wzmacniającego, który powinien wynosić 20-40 dla tych złożonych materiałów. Uruchom zaprojektowane eksperymenty, aby określić strukturę ściany komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie biomasy roślinnej do badań NMR i DNP
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów roślinnych do NMR w stanie stałym
	<ol>
		<li>Wyprodukuj jednolicie 13roślin z oznaczeniem C we własnym zakresie, używając 13zapasów CO2 w komorze wzrostowej lub 13pożywki C-glukozy, jak opisano wcześniej46,47 lub bezpośrednio kupuj oznakowane materiały od firm zajmujących się etykietowaniem izotopów. 
		UWAGA: 13C-glukoza może być stosowana tylko w ciemnym wzroście, aby uniknąć wprowadzenia 12C w procesie fotosyntezy.</li>
		<li>Pokrój równomiernie oznakowany materiał roślinny o temperaturze 13C na małe kawałki (zwykle o wymiarach 1-2 mm) za pomocą laboratoryjnej żyletki. 
		UWAGA: W zależności od celu, wyekstrahowane ściany komórkowe są czasami używane do charakterystyki strukturalnej, a szczegółowe protokoły są opisane w poprzednich badaniach21,46.</li>
		<li>Jeśli próbka została wcześniej wysuszona, dodać 100 μl wody do 30 mg materiałów roślinnych w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, wirować, równoważyć w temperaturze pokojowej przez 1 dzień. Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut i usunąć nadmiar wody za pomocą pipety.</li>
		<li>Jeśli próbka nigdy nie była suszona w żadnym momencie, należy użyć próbki bezpośrednio bez dalszej obróbki.</li>
		<li>Upakuj powstałe materiały roślinne w wirniki ZrO2 o średnicy 3,2 mm lub 4 mm w celu przeprowadzenia eksperymentów NMR w stanie stałym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie materiału roślinnego do badań DNP
	<ol>
		<li>Przygotować 60 μl roztworu podstawowego 10 mM rodnika AMUPol zgodnie z opisanymi krokami 2.2.1 i 2.2.2.</li>
		<li>Materiał roślinny oznaczony równomiernie w temperaturze 13°C do badania należy pokroić na małe kawałki (o wymiarach 1-2 mm) za pomocą laboratoryjnej żyletki i zważyć 20 mg materiału roślinnego.</li>
		<li>Ręcznie zmiel kawałki rośliny na małe cząstki (o wielkości ~1-2 mm) za pomocą moździerza i tłuczka. Końcowe proszki mają jednorodny wygląd.</li>
		<li>Dodać 40 μl roztworu podstawowego DNP przygotowanego w poprzednim etapie (etap 2.2.2) do materiału roślinnego i delikatnie mielić przez 5 minut, aby zapewnić jednorodne wymieszanie z rodnikiem.</li>
		<li>Dodaj kolejne 20 μl roztworu podstawowego, aby jeszcze bardziej uwodnić materiał roślinny po zmieleniu.</li>
		<li>Zapakuj zrównoważoną próbkę rośliny do szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm w celu przeprowadzenia eksperymentów DNP. Włóż silikonową zatyczkę, aby uniknąć utraty nawodnienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Standardowe eksperymenty NMR w stanie stałym do wstępnej charakterystyki biomateriałów bogatych w węglowodany
UWAGA: Krótki przegląd eksperymentów NMR znajduje się w tej sekcji. Jednak wyjaśnienie strukturalne zazwyczaj wymaga rozległej wiedzy specjalistycznej. Dlatego zaleca się współpracę ze spektroskopistami NMR.
<ol>
	<li>Zmierz widma 1D 13C Cross Polarization (CP), 13C Direct Polarization (DP) z 2-s i 35-s opóźnieniami recyklingu oraz 1 H-13C INEPT48,49 stry, aby uzyskać ogólne zrozumienie dynamicznego rozkładu składników komórek (Rysunek 1a). Ściany komórkowe są zazwyczaj stosunkowo sztywną częścią i wykazują dominujące sygnały w widmie CP.</li>
	<li>Zmierz serię standardowych eksperymentów korelacji 2D 13 C-13C w celu przypisania rezonansu sygnałów 13C. Zacznij od ponownego skoncentrowania INADEQUATE50,51, aby uzyskać łączność węglową, która musi być wspomagana przez serię eksperymentów w przestrzeni, takich jak 1,5-ms RFDR52 (Rysunek 1b) i 50-ms CORD/DARR53 eksperymenty. 
	UWAGA: Jeśli interesujące jest znalezienie próbki bogatej w określony składnik, na przykład pierwotne lub wtórne ściany komórkowe, może być konieczne osobne zmierzenie wielu segmentów lub wielu roślin, aby znaleźć próbkę o optymalnym składzie.</li>
	<li>Przeprowadzanie eksperymentów korelacji 2D 15 N-13C, które można zmierzyć, aby ułatwić przypisywanie rezonansu białek i węglowodanów azotowanych. 
	UWAGA: Przypisanie rezonansu jest zazwyczaj czasochłonne. Obecnie opracowywana jest metoda, która ma ułatwić rezonansowe przypisywanie sygnałów węglowodanowych tym naukowcom, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia.</li>
	<li>Zmierz bardziej specjalistyczne eksperymenty, aby określić bliskości przestrzenne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1c, d), nawodnienie i ruchliwość złożonych biomolekuł, aby określić trójwymiarową strukturę materiałów bogatych w węglowodany, jak systematycznie opisano wcześniej22,29.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W porównaniu z metodami biochemicznymi, NMR w stanie stałym ma zalety jako technika nieniszcząca o wysokiej rozdzielczości. NMR jest również ilościowy w analizie składu i w przeciwieństwie do większości innych metod analitycznych nie ma niepewności wynikających z ograniczonej rozpuszczalności biopolimerów. Ustanowienie obecnego protokołu ułatwia przyszłe badania nad biomateriałami bogatymi w węglowodany i funkcjonalizowanymi polimerami. Należy jednak zauważyć, że przypisywanie rezonansu i analiza danych mogą być czasochł...

Węglowodany odgrywają kluczową rolę w różnych procesach biologicznych, takich jak magazynowanie energii, budowanie struktur oraz rozpoznawanie i adhezja komórek. Są one wzbogacone w ścianę komórkową, która jest podstawowym składnikiem roślin, grzybów, glonów i bakterii1,2,3. Ściana komórkowa służy jako centralne źródło do produkcji biopaliw i biomateriałów, a także jako obiecujący cel dla terapii przeciwdrobnoustrojowych4,5,6,7,8,9.
Współczesne zrozumienie tych złożonych materiałów zostało znacznie rozwinięte dzięki dziesięcioleciom wysiłków, które poświęcono na charakterystykę strukturalną przy użyciu czterech głównych metod biochemicznych lub genetycznych. Pierwsza główna metoda opiera się na sekwencyjnym traktowaniu przy użyciu ostrych chemikaliów lub enzymów w celu rozbicia ścian komórkowych na różne części, po czym następuje analiza składu i powiązań cukrów w każdej frakcji10. Metoda ta rzuca światło na rozkład domenowy polimerów, ale interpretacja może być myląca ze względu na właściwości chemiczne i fizyczne biomolekuł. Na przykład trudno jest określić, czy frakcja ekstrahowana alkaliami pochodzi z pojedynczej domeny mniej ustrukturyzowanych cząsteczek, czy z przestrzennie oddzielonych cząsteczek o porównywalnej rozpuszczalności. Po drugie, wyekstrahowane części lub całe ściany komórkowe można również zmierzyć za pomocą roztworu NMR w celu określenia wiązań kowalencyjnych, określanych również jako sieciowanie, między różnymi cząsteczkami11,12,13,14,15. W ten sposób można było zbadać szczegółową strukturę kotew kowalencyjnych, ale mogą istnieć ograniczenia wynikające z niskiej rozpuszczalności polisacharydów, stosunkowo małej liczby miejsc sieciowania oraz ignorowania efektów niekowalencyjnych, które stabilizują upakowanie polisacharydów, w tym wiązania wodorowe, siłę van der Waalsa, oddziaływanie elektrostatyczne i splątanie polimeru. Po trzecie, powinowactwo wiązania zostało określone in vitro przy użyciu izolowanych polisacharydów16,17,18,19, ale procedury oczyszczania mogą znacząco zmienić strukturę i właściwości tych biomolekuł. Metoda ta nie jest również w stanie odtworzyć wyrafinowanego osadzania i składania makrocząsteczek po biosyntezie. Wreszcie, fenotyp, morfologia komórki i właściwości mechaniczne mutantów genetycznych z osłabioną produkcją niektórych składników ściany komórkowej rzucają światło na funkcje strukturalne polisacharydów, ale potrzeba więcej dowodów molekularnych, aby połączyć te makroskopowe obserwacje z inżynieryjną funkcją maszyn białkowych20.
Ostatnie postępy w rozwoju i zastosowaniu wielowymiarowej spektroskopii NMR w stanie stałym wprowadziły unikalną okazję do rozwiązania tych strukturalnych zagadek. Eksperymenty NMR w stanie stałym 2D/3D umożliwiają badanie składu i architektury materiałów bogatych w węglowodany w stanie naturalnym w wysokiej rozdzielczości bez większych zakłóceń. Z powodzeniem przeprowadzono badania strukturalne zarówno pierwotnych, jak i wtórnych ścian komórkowych roślin, katalitycznego traktowanego biomasy, biofilmu bakteryjnego, duchów barwnikowych w grzybach oraz, ostatnio przez autorów, nienaruszonych ścian komórkowych w chorobotwórczym grzybie Aspergillus fumigatus21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Rozwój dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP)32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42 znacznie ułatwia wyjaśnienie strukturalne NMR, ponieważ zwiększenie czułości przez DNP znacznie skraca czas eksperymentowania na tych złożonych biomateriałach. Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje procedury znakowania izotopowego grzyba A. fumigatus oraz przygotowania próbek grzybów i roślin do charakterystyki NMR w stanie stałym i DNP. Podobne procedury etykietowania powinny mieć zastosowanie do innych grzybów ze zmienioną pożywką, a procedury przygotowania próbek powinny być ogólnie stosowane do innych biomateriałów bogatych w węglowodany.

<table><tbody><tr><td>Tetrahydrat molibdenianu amonu</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Model PA84C</td></tr><tr><td>Bioklaw 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Labconco corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>VWR</td><td>BDH9222</td><td>przechowywać w sklepach w godzinach 15-30 &; C</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek kobaltu(II)</td><td>Honeywell |Fluka</td><td>60820</td><td>&ge; 98 %</td></tr> <tr><td>Pięciowodny siarczan miedzi(II)</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Inkubator wytrząsający Corning LSE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99,9 atom % D</td></tr><tr><td>d6-DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99,9 atom % D</td></tr><tr><td>d8-glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 atom % D</td></tr><tr><td>Rurka do dializy 3,2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Fosforan dipotasowy</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge; 99,5 %</td></tr><tr><td>Wirówka Heraus Megafuge 16R</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Maksymalny RCF 25 830 x g</td></tr><tr><td>Zestaw jednorazowych wkładek HR-MAS</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(II) siedmiowodny</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; 99+ %</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>przechowywać w temperaturze 18-26 stopni; C</td></tr><tr><td>Tetrahydrat chlorku manganu(II)</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>Fosforan monopotasowy</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; 99</td></tr>% <tr><td>pH-metr</td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasodowy etylenodiaminotetraoctan</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; 99,5 %</td></tr> <tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399&</td><td>ge; 98</td></tr>%<tr><td>12C3, d8-glicerol</td><td>Cambridge Isotope Laboratory</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99,95%; D8, 98%</td></tr><tr><td>13C6-glukoza</td><td>Sigma Alrdrich 364606</td><td></td><td>&ge; 99 % (CP)</td></tr><tr><td>15azotan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge; 98 % 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr><tr><td>Szafirowy wirnik NMR 3,2 mm</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>3,2 mm Wtyczka silikonowa</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wirnika MAS 4 mm</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Cyrkonia</td></tr></tbody></table>

przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym nmr

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Ten protokół pokazuje, jak jednolicie można wyprodukować 13C, 15N znakowanych materiałami grzybowymi i jak te miękkie materiały powinny być postępowane w eksperymentach NMR w stanie stałym i DNP o zwiększonej czułości. Szczegółowo opisana jest również procedura przetwarzania próbek biomasy roślinnej. Metoda ta pozwala na pomiar szeregu widm korelacji 1D i 2D 13 C-13C/15N, co umożliwia wyjaśnienie strukturalne złożonych biomateriałów w ich stanie naturalnym w wysokiej rozdzielczości, przy minimalnych zakłóceniach. Znakowanie izotopowe można zbadać, określając ilościowo intensywność w widmach 1D i wydajność przenoszenia polaryzacji w widmach korelacji 2D. Powodzenie przygotowania próbki do dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) można ocenić za pomocą współczynnika zwiększenia czułości. Dalsze eksperymenty badające aspekty strukturalne polisacharydów i białek doprowadzą do stworzenia modelu architektury trójwymiarowej. Metody te mogą być modyfikowane i dostosowywane do badania szerokiej gamy materiałów bogatych w węglowodany, w tym naturalnych ścian komórkowych roślin, grzybów, glonów i bakterii, a także syntetyzowanych lub projektowanych polimerów węglowodanowych i ich kompleksu z innymi cząsteczkami.

Znakowanie izotopowe znacząco zwiększa czułość NMR i umożliwia pomiar serii dwuwymiarowych (2D) widm korelacyjnych 13C-13C oraz 13C-15N w celu analizy składu, hydratacji, mobilności i upakowania polimerów, które zostaną zintegrowane w celu stworzenia trójwymiarowego modelu architektury ściany komórkowej (Rysunek 1). W przypadku sukcesu jednolitego znakowania, pełny zestaw jednowymiarowych (1D) widm 13C i ...

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania materiałów grzybowych i roślinnych do eksperymentów z magnetycznym rezonansem jądrowym w stanie stałym (NMR) oraz dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) w celu charakterystyki złożonych biosystemów. Technika ta pozwala nam badać biomateriały do poziomu rozdzielczości atomowej w ich naturalnym środowisku, na przykład w całych komórkach. Pozyskanie informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości na temat materiałów grzybowych pomoże w opracowaniu leków przeciwgrzybiczych.Metoda zapewnia wgląd w skład i strukturę węglowodanów złożonych w ścianach komórkowych grzybów i może być stosowana do wielu organizmów bogatych w węglowodany, w tym roślin, grzybów, glonów i bakterii. Niektórzy badacze mogą zmagać się z zanieczyszczeniem grzybiczym w swoich kulturach komórkowych. Radzę dokładnie wysterylizować pożywkę i sprzęt przed użyciem, aby zapobiec temu zanieczyszczeniu.Demonstracja ta pomoże badaczom z niewielkim doświadczeniem w NMR lub hodowlach komórkowych nauczyć się, jak wdrażać te techniki w systemach grzybowych i roślinnych. Aby przygotować nieznakowaną płynną pożywkę wzrostową, rozpuść 6,5 grama ekstraktu drożdżowego, dekstrozy peptonowej lub proszku YPD w 100 mililitrach wody destylowanej, a następnie autoklawuj powstały roztwór przez 25 minut w temperaturze 134 stopni Celsjusza. Aby przygotować nieoznakowane stałe podłoże wzrostowe, dodaj 6,5 grama proszku agarowego YPD do 100 mililitrów wody destylowanej i autoklaw pożywki przez 25 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza, a następnie schłodź pożywkę do około 50 stopni Celsjusza.Następnie przenieś od 13 do 15 mililitrów stopionej pożywki wzrostowej do pojedynczych sterylnych plastikowych szalek Petriego i natychmiast umieść pokrywki na szalkach. Aby przygotować ciekłą pożywkę wzrostową z węglem-13 znakowaną azotem-15, dostosuj 100-mililitrową objętość minimalnej pożywki zawierającej izotopy do pH 6,6 z kwasem lub zasadą, jeśli to konieczne. Następnie rozpuść sole wymienione w tabeli w 100 mililitrach wody destylowanej, dodaj do węgla-13, znakowanej azotem-15 ciekłej pożywki wzrostowej i autoklaw powstałego roztworu przez 25 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.Gdy roztwór ostygnie do temperatury pokojowej, dodaj 100 mikrolitrów roztworu pierwiastków śladowych do całej objętości węgla-13, minimalnego podłoża znakowanego azotem-15. Aby wyhodować materiały grzybowe, użyj pętli zaszczepiającej, aby przenieść niewielką ilość grzybów z magazynu na płytkę YPD i hoduj grzyby przez dwa dni w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji użyj nowej pętli zaszczepiającej, aby przenieść aktywną krawędź rosnącego grzyba do płynnej pożywki wzrostowej znakowanej węglem-13, azotem-15 i umieść kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 220 obrotów na minutę przez trzy do pięciu dni w inkubatorze wstrząsającym.Gdy duże ilości grzyba pokrywają dno kolby i unoszą się w cieczy, należy zebrać grzyby przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Uwodnić osad odpowiednim roztworem i za pomocą kleszczy zebrać około 0,5 grama dobrze uwodnionego osadu do analiz NMR i DNP. Następnie wymieszaj pozostały materiał z 20% roztworem glicerolu w stożkowej probówce i umieść próbkę grzyba w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.Aby przygotować A.fumigatus do analizy NMR w stanie stałym, najpierw użyj worka do dializy z odciętą masą cząsteczkową 3,5 kilodaltonu, aby dializować 0,5-gramową próbkę grzybów znakowaną węglem-13 azotem w stosunku do jednego litra 10-milimolowego buforu fosforanowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni, aby usunąć małe cząsteczki z pożywki wzrostowej. Pod koniec dializy przenieś próbkę do 15-mililitrowej probówki do odwirowania i zapakuj od 70 do 80 miligramów równomiernie znakowanej węglem 13 i dobrze uwodnionej pasty do próbki w czteromilimetrowym wirniku dwutlenku cyrkonu. Za pomocą metalowego pręta delikatnie i powtarzalnie ściskaj próbkę, używając papieru do wchłonięcia nadmiaru wody.Następnie szczelnie zakryj wirnik i włóż próbkę do spektrometru w celu scharakteryzowania NMR w stanie stałym. Aby przygotować A.fumigatus do analizy DNP, dodaj 100 mikrolitrów matrycy DNP do jednej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na próbkę grzybów znakowaną węglem-13, węglem-15 i rozpuść 0,7 miligrama środka polaryzującego w każdej probówce, aby utworzyć 10-milimolowy roztwór podstawowy rodnika. Po wirowaniu przez dwie do trzech minut, aby upewnić się, że rodniki są całkowicie rozpuszczone w roztworze, namocz 10 miligramów dializowanej próbki grzybów znakowanej węglem-13, azotem-15 w 50 mikrolitrach roztworu środka polaryzującego i użyj tłuczka i moździerza, aby delikatnie zmielić mieszaninę, aby zapewnić przenikanie rodników do porowatych ścian komórkowych.Dodaj kolejne 30 mikrolitrów radykalnego roztworu do zmielonego granulatu, aby jeszcze bardziej uwodnić próbkę grzyba, i zapakuj osad w 3,2-milimetrowy szafirowy wirnik. Delikatnie ściśnij i usuń nadmiar rozpuszczalnika DNP, jak pokazano, a następnie dodaj silikonową zatyczkę o średnicy 3,2 milimetra, aby zapobiec utracie nawilżenia. Następnie dodaj wirnik do spektrometru NMR do rutynowego eksperymentu lub spektrometru DNP do pomiaru widma wzmocnionego DNP pod wpływem promieniowania mikrofalowego.Aby przygotować materiał roślinny do badań DNP, użyj żyletki, aby pociąć jednolicie znakowany węglem 13 materiał roślinny na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów. Za pomocą moździerza i tłuczka zmielić kawałki na mniejsze cząstki, aż końcowy proszek będzie miał jednorodny wygląd. Dodaj 40 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu podstawowego rodnika do materiału roślinnego i lekko miel próbkę przez dodatkowe pięć minut, aby zapewnić jednorodne wymieszanie z rodnikiem.Uwodnić zmieloną próbkę kolejnymi 20 mikrolitrami radykalnego roztworu podstawowego i zapakować zrównoważoną próbkę rośliny do 3,2-milimetrowego szafirowego wirnika do analizy DNP. Następnie włóż silikonową zatyczkę, aby uniknąć utraty hydratacji, i załaduj próbkę do spektrofotometru DNP. Znakowanie izotopowe znacznie zwiększa czułość NMR i umożliwia pomiar serii dwuwymiarowych widm korelacji węgla-13-węgla-13 i węgla-13-azotu-15 w celu analizy składu, hydratacji, mobilności i upakowania polimerów w celu ich integracji w celu budowy trójwymiarowego modelu architektury ściany komórkowej.Jeśli sygnały poza przekątną są trudne do uzyskania w widmie 2D węgiel-13-węgiel-13, mogło dojść do statystycznego znakowania. Dwa piki węgla-13 przy 96 i 92 częściach na milion są charakterystycznymi sygnałami węgla-1 glukozy. W związku z tym ich silne natężenia w ilościowych widmach bezpośredniej polaryzacji węgla-13 mierzone z długimi opóźnieniami recyklingu wynoszącymi 35 sekund zwykle wskazują na dominację małych cząsteczek z powodu niepełnej dializy lub mycia.Dzięki dobrze oznakowanym próbkom można dalej mierzyć korelacje dalekiego zasięgu w celu wykrycia przestrzennej bliskości biomolekuł i skonstruowania modelu strukturalnego nienaruszonych ścian komórkowych. Technika ta pozwala na zbadanie funkcji struktury w wielu naturalnie występujących i zmodyfikowanych materiałach, ułatwiając przyszłe badania nad biomateriałami bogatymi w węglowodany i funkcjonalizowanymi polimerami. Ponieważ niektóre grzyby mogą powodować infekcje lub systematyczne choroby u ludzi, należy obchodzić się z materiałami grzybowymi w okapie z przepływem laminarnym w celu ochrony i zminimalizowania narażenia.

preparation-fungal-plant-materials-for-structural-elucidation-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Nadziemne organy roślin są chronione przez kutykulę, która stanowi supramolekularny kompleks biopoliestru i wosków. Przedstawiamy protokoły monitorowania selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owoców pomidora w skalach molekularnej i mikro, odpowiednio za pomocą NMR w stanie stałym oraz mikroskopii sił atomowych, a także oceny zdolności do sieciowania zmodyfikowanych biopoliestrów kutykularnych.

Izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

Zwiększenie czułości zapewniane przez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP) umożliwia śledzenie procesów metabolicznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR i MRI. Omówiono charakterystykę i wydajność dedykowanego zestawu DNP do rozpuszczania, przeznaczonego do badania reakcji enzymatycznych.

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

31P NMR to potężne narzędzie do strukturalnego wyjaśniania polifenoli. Ta szybka, łatwa, precyzyjna, ilościowa i wysoce odtwarzalna procedura analityczna, która pozwala na kwantyfikację i różnicowanie różnych typów grup hydroksylowych, fenolowych i karboksylowych w ligninach i garbnikach, stała się obecnie rutynowym narzędziem analitycznym.

Ilościowa analiza 31P NMR ligniny i garbników

Ten artykuł przedstawia zastosowanie PSYCHE i SAPPHIRE-PSYCHE w profilowaniu metabolicznym roślin i zawiera szczegółowe procedury przygotowania próbek i optymalnego zapisu widm NMR Pure Shift. Omówiono przykłady, dzięki którym przyrost rozdzielczości osiągnięty przez rozprzęganie homojądrowe pozwala na pełniejsze zrozumienie systemu.

Magnetyczny rezonans jądrowy z czystym przesunięciem: nowe narzędzie do metabolomiki roślin

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Poznaj przygotowanie próbek grzybowych i roślinnych do badań NMR i DNP w stanie stałym. Ta metoda umożliwia analizę strukturalną biomateriałów z rozdzielczością atomową w ich naturalnym środowisku.

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Przeglądaj więcej filmów