Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania materiałów grzybowych i roślinnych do eksperymentów z magnetycznym rezonansem jądrowym w stanie stałym (NMR) oraz dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) w celu charakterystyki złożonych biosystemów. Technika ta pozwala nam badać biomateriały do poziomu rozdzielczości atomowej w ich naturalnym środowisku, na przykład w całych komórkach. Pozyskanie informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości na temat materiałów grzybowych pomoże w opracowaniu leków przeciwgrzybiczych.

Metoda zapewnia wgląd w skład i strukturę węglowodanów złożonych w ścianach komórkowych grzybów i może być stosowana do wielu organizmów bogatych w węglowodany, w tym roślin, grzybów, glonów i bakterii. Niektórzy badacze mogą zmagać się z zanieczyszczeniem grzybiczym w swoich kulturach komórkowych. Radzę dokładnie wysterylizować pożywkę i sprzęt przed użyciem, aby zapobiec temu zanieczyszczeniu.

Demonstracja ta pomoże badaczom z niewielkim doświadczeniem w NMR lub hodowlach komórkowych nauczyć się, jak wdrażać te techniki w systemach grzybowych i roślinnych. Aby przygotować nieznakowaną płynną pożywkę wzrostową, rozpuść 6,5 grama ekstraktu drożdżowego, dekstrozy peptonowej lub proszku YPD w 100 mililitrach wody destylowanej, a następnie autoklawuj powstały roztwór przez 25 minut w temperaturze 134 stopni Celsjusza. Aby przygotować nieoznakowane stałe podłoże wzrostowe, dodaj 6,5 grama proszku agarowego YPD do 100 mililitrów wody destylowanej i autoklaw pożywki przez 25 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza, a następnie schłodź pożywkę do około 50 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś od 13 do 15 mililitrów stopionej pożywki wzrostowej do pojedynczych sterylnych plastikowych szalek Petriego i natychmiast umieść pokrywki na szalkach. Aby przygotować ciekłą pożywkę wzrostową z węglem-13 znakowaną azotem-15, dostosuj 100-mililitrową objętość minimalnej pożywki zawierającej izotopy do pH 6,6 z kwasem lub zasadą, jeśli to konieczne. Następnie rozpuść sole wymienione w tabeli w 100 mililitrach wody destylowanej, dodaj do węgla-13, znakowanej azotem-15 ciekłej pożywki wzrostowej i autoklaw powstałego roztworu przez 25 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.

Gdy roztwór ostygnie do temperatury pokojowej, dodaj 100 mikrolitrów roztworu pierwiastków śladowych do całej objętości węgla-13, minimalnego podłoża znakowanego azotem-15. Aby wyhodować materiały grzybowe, użyj pętli zaszczepiającej, aby przenieść niewielką ilość grzybów z magazynu na płytkę YPD i hoduj grzyby przez dwa dni w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji użyj nowej pętli zaszczepiającej, aby przenieść aktywną krawędź rosnącego grzyba do płynnej pożywki wzrostowej znakowanej węglem-13, azotem-15 i umieść kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 220 obrotów na minutę przez trzy do pięciu dni w inkubatorze wstrząsającym.

Gdy duże ilości grzyba pokrywają dno kolby i unoszą się w cieczy, należy zebrać grzyby przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Uwodnić osad odpowiednim roztworem i za pomocą kleszczy zebrać około 0,5 grama dobrze uwodnionego osadu do analiz NMR i DNP. Następnie wymieszaj pozostały materiał z 20% roztworem glicerolu w stożkowej probówce i umieść próbkę grzyba w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.

Aby przygotować A.fumigatus do analizy NMR w stanie stałym, najpierw użyj worka do dializy z odciętą masą cząsteczkową 3,5 kilodaltonu, aby dializować 0,5-gramową próbkę grzybów znakowaną węglem-13 azotem w stosunku do jednego litra 10-milimolowego buforu fosforanowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni, aby usunąć małe cząsteczki z pożywki wzrostowej. Pod koniec dializy przenieś próbkę do 15-mililitrowej probówki do odwirowania i zapakuj od 70 do 80 miligramów równomiernie znakowanej węglem 13 i dobrze uwodnionej pasty do próbki w czteromilimetrowym wirniku dwutlenku cyrkonu. Za pomocą metalowego pręta delikatnie i powtarzalnie ściskaj próbkę, używając papieru do wchłonięcia nadmiaru wody.

Następnie szczelnie zakryj wirnik i włóż próbkę do spektrometru w celu scharakteryzowania NMR w stanie stałym. Aby przygotować A.fumigatus do analizy DNP, dodaj 100 mikrolitrów matrycy DNP do jednej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na próbkę grzybów znakowaną węglem-13, węglem-15 i rozpuść 0,7 miligrama środka polaryzującego w każdej probówce, aby utworzyć 10-milimolowy roztwór podstawowy rodnika. Po wirowaniu przez dwie do trzech minut, aby upewnić się, że rodniki są całkowicie rozpuszczone w roztworze, namocz 10 miligramów dializowanej próbki grzybów znakowanej węglem-13, azotem-15 w 50 mikrolitrach roztworu środka polaryzującego i użyj tłuczka i moździerza, aby delikatnie zmielić mieszaninę, aby zapewnić przenikanie rodników do porowatych ścian komórkowych.

Dodaj kolejne 30 mikrolitrów radykalnego roztworu do zmielonego granulatu, aby jeszcze bardziej uwodnić próbkę grzyba, i zapakuj osad w 3,2-milimetrowy szafirowy wirnik. Delikatnie ściśnij i usuń nadmiar rozpuszczalnika DNP, jak pokazano, a następnie dodaj silikonową zatyczkę o średnicy 3,2 milimetra, aby zapobiec utracie nawilżenia. Następnie dodaj wirnik do spektrometru NMR do rutynowego eksperymentu lub spektrometru DNP do pomiaru widma wzmocnionego DNP pod wpływem promieniowania mikrofalowego.

Aby przygotować materiał roślinny do badań DNP, użyj żyletki, aby pociąć jednolicie znakowany węglem 13 materiał roślinny na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów. Za pomocą moździerza i tłuczka zmielić kawałki na mniejsze cząstki, aż końcowy proszek będzie miał jednorodny wygląd. Dodaj 40 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu podstawowego rodnika do materiału roślinnego i lekko miel próbkę przez dodatkowe pięć minut, aby zapewnić jednorodne wymieszanie z rodnikiem.

Uwodnić zmieloną próbkę kolejnymi 20 mikrolitrami radykalnego roztworu podstawowego i zapakować zrównoważoną próbkę rośliny do 3,2-milimetrowego szafirowego wirnika do analizy DNP. Następnie włóż silikonową zatyczkę, aby uniknąć utraty hydratacji, i załaduj próbkę do spektrofotometru DNP. Znakowanie izotopowe znacznie zwiększa czułość NMR i umożliwia pomiar serii dwuwymiarowych widm korelacji węgla-13-węgla-13 i węgla-13-azotu-15 w celu analizy składu, hydratacji, mobilności i upakowania polimerów w celu ich integracji w celu budowy trójwymiarowego modelu architektury ściany komórkowej.

Jeśli sygnały poza przekątną są trudne do uzyskania w widmie 2D węgiel-13-węgiel-13, mogło dojść do statystycznego znakowania. Dwa piki węgla-13 przy 96 i 92 częściach na milion są charakterystycznymi sygnałami węgla-1 glukozy. W związku z tym ich silne natężenia w ilościowych widmach bezpośredniej polaryzacji węgla-13 mierzone z długimi opóźnieniami recyklingu wynoszącymi 35 sekund zwykle wskazują na dominację małych cząsteczek z powodu niepełnej dializy lub mycia.

Dzięki dobrze oznakowanym próbkom można dalej mierzyć korelacje dalekiego zasięgu w celu wykrycia przestrzennej bliskości biomolekuł i skonstruowania modelu strukturalnego nienaruszonych ścian komórkowych. Technika ta pozwala na zbadanie funkcji struktury w wielu naturalnie występujących i zmodyfikowanych materiałach, ułatwiając przyszłe badania nad biomateriałami bogatymi w węglowodany i funkcjonalizowanymi polimerami. Ponieważ niektóre grzyby mogą powodować infekcje lub systematyczne choroby u ludzi, należy obchodzić się z materiałami grzybowymi w okapie z przepływem laminarnym w celu ochrony i zminimalizowania narażenia.