Name: Dystrybucja wody ksylemu w roślinach drzewiastych wizualizowana za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj metodę obserwacji dystrybucji wody w naczyniach ksylemu roślin drzewiastych za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego. Technika ta eliminuje artefakty przygotowania próbek i pozwala badać dynamikę przepływu wody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez JSPS KAKENHI (nr 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

UWAGA: Schemat ideowy tego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.
1. Pobieranie próbek: Rozluźnienie napięcia w słupie wody przewodów ksylemowych
UWAGA: Przed zastosowaniem LN2 zaleca się następujący zabieg rozluźniania napięcia, aby uniknąć zarówno zamarzania, jak i artefaktów wywołanych napięciem w dystrybucji wody ksylemu.
<ol>
	<li>Opasnąć gałąź i liście do pobierania próbek czarną plastikową torbą, aby zrównoważyć potencjał wodny między ksylemem a liśćmi na więcej niż dwie godziny przed pobraniem próbki.</li>
	<li>Oznaczyć potencjał wodny co najmniej dwóch liści z próbki za pomocą komory ciśnieniowej lub psychrometru. Gdy potencjał wodny jest wyższy niż ok. −0,5 MPa (tj. nie występuje napięcie lub występuje ono bardzo niskie), próbkę można pobrać po zamrożeniu (patrz rozdział 2: Utrwalanie przez zamrażanie). Gdy potencjał wodny jest niższy niż −0,5 MPa, konieczne jest leczenie relaksacyjne, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Zamocuj wodoszczelny kołnierz wokół trzpienia, aby napełnić go wodą. Plastikowy kubek bez dna może służyć jako wodoszczelny kołnierz. Należy zadbać o szczelne uszczelnienie przestrzeni między trzpieniem a kołnierzem za pomocą taśmy klejącej, aby zapobiec wyciekom płynnych mediów, które są następnie używane. Aby zebrać elastyczne łodygi, takie jak cienkie gałęzie lub gałązki, zanurz część cięcia w wiadrze wypełnionym wodą, zginając łodygę. Tnij pod powierzchnią wody za pomocą sekatora lub piły. Przenieś próbkę do innego pojemnika z wodą tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować wystawienie odciętego końca na działanie powietrza.</li>
	<li>Odcięty koniec próbki należy przechowywać pod wodą. W przypadku gatunków liściastych należy zapewnić, aby długość od miejsca, w którym zostanie pobrana kriopróbka do SEM, do krawędzi cięcia zebranej łodygi była dłuższa niż maksymalna długość naczynia próbki, aby zapobiec powstawaniu artefaktów spowodowanych naprężeniem w próbce kriogenicznej.</li>
	<li>Przykryj próbkę zawierającą liście czarną plastikową torbą, aby zmniejszyć transpirację. Trzymaj odcięty koniec próbki w wodzie i utrzymuj ten stan przez około 30 minut w celu rozluźnienia napięcia ksylemu. Unikaj dłuższego czasu relaksacji (>1 h) ze względu na możliwe sztuczne napełnianie kawitacyjnych przewodów12.</li>
	<li>Ponownie zmierzyć potencjał wody, aby potwierdzić rozluźnienie napięcia ksylemu (prawie 0 MPa). 
	UWAGA: Przed pobraniem próbek należy zbadać maksymalną długość naczynia krwionośnego gatunku docelowego lub określić ją za pomocą podobnych próbek metodą wtrysku powietrza. Podczas pobierania próbek z dużego drzewa lub dużej gałęzi trudno jest przeprowadzić opisane powyżej procedury rozluźniania napięcia. Dlatego próbki z dużych drzew muszą być pobierane w okresie przed świtem, kiedy potencjał wodny ksylemu jest wyższy.</li>
</ol>
2. Fiksacja zamrożenia za pomocą LN2
<ol>
	<li>Wytnij i otwórz jedną stronę wodoszczelnej obroży nożyczkami lub nożem uniwersalnym. Mocno przymocuj kołnierz wokół trzpienia za pomocą taśmy klejącej, trzymając otwór poziomo.</li>
	<li>Nosić rękawice izolacyjne/rękawice, ale upewnij się, że bezpiecznie trzymasz butelkę LN2 i włóż LN2 do kołnierza, aby napełnić ją LN2. Utrzymuj go napełnionym, stopniowo dodając LN2, aby całkowicie zamrozić wodę w ksylemie. Czas potrzebny do zamrożenia zależy od wielkości próbki; 1 minuta po zagotowaniu wylanego LN2 jest wystarczająca dla małej gałązki lub sadzonki, podczas gdy ponad 20 minut jest potrzebne dla pnia większego drzewa20. Dodawać LN2 w sposób ciągły podczas zamrażania, ponieważ szybko odparowuje z powodu dużych różnic temperatur między LN2 a temperaturami otoczenia.</li>
	<li>Odczepić kołnierz od zamrożonej części trzpienia próbki w celu usunięcia LN2 po upływie wystarczającego czasu zamrażania. Upewnij się, że nosisz rękawice izolacyjne, aby uniknąć kontaktu z potencjalnym rozlaniem LN2 spowodowanym odłączeniem obroży.</li>
	<li>Natychmiast zbierz próbkę za pomocą cienkiej piły ręcznej.</li>
	<li>Przykryj zamrożoną próbkę kawałkiem folii aluminiowej lub włóż ją do probówki z próbką, na której zapisane są numery identyfikacyjne próbki. Pobraną próbkę należy szybko umieścić w pojemniku wypełnionym LN2 lub zapakować do izolowanego pudełka wypełnionego suchym lodem.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w głębokiej zamrażarce do czasu obserwacji. Preferowana temperatura przechowywania wynosi −80 °C, aby zapobiec sublimacji lodu i jego rekrystalizacji podczas przechowywania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
UWAGA: Do obserwacji, próbka musi być przycięta, a jej powierzchnia do obserwacji musi być strugana w temperaturze poniżej zera, aby utrzymać rozkład wody w ksylemie in situ. Mikrotom biologiczny z systemem kriostatu (kriostatu) jest idealny do przycinania i naświetlania powierzchni próbki w tego typu obserwacji za pomocą krio-SEM.
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę komory na próbki kriostatu na -30 °C, która jest zwykle wystarczająco niska, aby utrzymać sok ksylemu większości roślin w stanie zamrożonym.</li>
	<li>Przytnij próbkę do małego kawałka (< ok. 2 cm wysokości i < ok. 1 cm szerokości lub średnicy), który można dostosować do uchwytu próbki cryo-SEM. Do przycinania używaj ostrego noża lub piły o drobnych zębach, aby zapobiec pękaniu lodu w próbce. W przypadku większej próbki, której nie można przeciąć nożem, należy ją szybko wstępnie przyciąć schłodzoną piłą w zamrażarce.</li>
	<li>Przymocuj przycięty element do uchwytu, uchwytu do kriostatu, montując go na podłożu do zamrażania tkanek (np. związku OCT) w celu kriosekcji. Następnie przymocuj uchwyt do uchwytu na próbkę mikrotomu kriostatu.</li>
	<li>Przyciąć powierzchnię, wielokrotnie goląc odcinki o grubości 5–7 μm. Przycinanie poprzez odcięcie od 1 000 do 2 000 μm na całkowitą głębokość od początkowej powierzchni podczas pobierania próbki jest przydatne do wyeliminowania uszkodzonej części próbki spowodowanej wstępnym cięciem nożem lub piłą, jak opisano w kroku 3.2.</li>
	<li>Po zgrubnym przycięciu powierzchni próbki, wyreguluj nieużywaną część ostrza mikrotomu nad powierzchnią próbki. Nie pozwól, aby ostrze dotykało próbki, co mogłoby przekroczyć ustawienie grubości.</li>
	<li>Przed pierwszym cięciem niewykorzystaną częścią ostrza należy nieznacznie poszerzyć odległość między powierzchnią próbki a ostrzem.</li>
	<li>Przeciąć powierzchnię próbki tylko raz lub dwa razy. Następnie ponownie przesuń ostrze, regulując nieużywaną część ostrza na powierzchni próbki.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.6 i 3.7 trzy lub cztery razy. Jest to ważne w celu uzyskania czystej powierzchni bez "śladów noża" (Rysunek 4).</li>
	<li>Po ostatnim cięciu ustaw pozycję ostrza z dala od próbki, aby zapobiec przywieraniu pyłu do próbki.</li>
	<li>Odłącz uchwyt od uchwytu na próbkę i odłącz próbkę od uchwytu, usuwając zamrożone podłoże do zatapiania ostrym nożem. Upewnij się, że próbka jest umieszczona w komorze kriostatu, aby zapobiec jej struganej powierzchni przed pyłem mrozu.</li>
	<li>Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę cryo-SEM z podłożem do zamrażania tkanek w komorze kriostatu.</li>
</ol>
4. Transfer do komory na próbki Cryo-SEM
UWAGA: Próbka przygotowana na powierzchnię musi być chroniona przed wzrostem temperatury lub gromadzeniem szronu podczas przenoszenia z komory kriostatu do etapu obserwacji w komorze próbek cryo-SEM.
<ol>
	<li>Utrzymuj temperaturę zimnego etapu w komorze na próbki cryo-SEM na poziomie niższym niż –120 °C z LN2 zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia.</li>
	<li>Umieścić uchwyt próbki z przygotowaną próbką w pojemniku izolacyjnym wypełnionym LN2 w komorze kriostatu.</li>
	<li>Trzymaj uchwyt próbki z prętem do wymiany próbek pod LN2. Jeśli to możliwe, unikaj wystawiania uchwytu na próbkę na działanie powietrza.</li>
	<li>Szybko ustaw uchwyt próbki w komorze wstępnej ewakuacji komory próbek cryo-SEM, gdy tylko rozpocznie się opróżnianie komory wstępnej ewakuacji. Następnie umieść uchwyt próbki na zimnym etapie po całkowitym odprowadzeniu powietrza. Chociaż nie da się uniknąć odrobiny szronu, procedura "trawienia przez zamrożenie" (krok 6) może go usunąć.</li>
</ol>
5. Ustawienie w SEM
UWAGA: Typowe ustawienie dla obserwacji jest opisane poniżej. Wymagane są pewne modyfikacje w zależności od warunków próżni lub wiązki elektronów.
<ol>
	<li>Ustaw parametry SEM dla obserwacji w następujący sposób: 
	Napięcie przyspieszenia: 3–5 kV 
	Temperatura etapu pobierania próbki: < −120 °C 
	Detektor: Emisja wtórna</li>
</ol>
6. Trawienie przez zamrażanie
UWAGA: Trawienie przez zamrożenie to procedura uwydatniania krawędzi ścian komórkowych próbki poprzez lekką sublimację kryształów lodu. Trawienie przez mrożenie polega również na usuwaniu pyłów szronowych z powierzchni.
<ol>
	<li>Włącz napięcie przyspieszenia pistoletu elektrycznego podczas trawienia przez zamrażanie. Lepiej jest przeprowadzić trawienie przez zamrożenie podczas obserwacji próbki.</li>
	<li>Podnieść temperaturę stopnia pobierania próbki do −100 °C.</li>
	<li>Odczekaj kilka minut, aż pył szronu zostanie usunięty, a poziom powierzchni lodu w komórkach ksylemu nieznacznie się obniży w porównaniu ze ścianami komórkowymi.</li>
	<li>Obniżyć temperaturę stopnia pobierania próbki do -120 °C. 
	UWAGA: Jeśli nie ma zainstalowanego regulatora temperatury dla stolika na próbkę, przytrzymaj próbkę za pomocą pręta wymiennika i odłącz ją od stolika na próbkę na kilka minut. Obserwuj próbkę kilka razy podczas tego procesu zamrażania, aby zweryfikować status sublimacji próbki.</li>
</ol>
7. Powłoka metalowa (opcjonalnie)
UWAGA: Ostatnie ulepszenia instrumentu SEM i przetwarzania obrazów mogą dostarczyć wysokiej jakości obrazy próbek izolacji elektrycznej bez powłoki metalowej. Jednak próbki nieprzewodzące, takie jak materiały biologiczne, są czasami płatne; wyższa jasność w określonych pozycjach próbki ze względu na akumulację elektronów ("ładowanie"). Wystawienie próbki na działanie wiązek elektronów przez dłuższy czas lub w dużym powiększeniu zwiększa efekty ładowania. Pokrycie powierzchni próbki materiałami metalowymi przewodzącymi prąd elektryczny zapobiega powstawaniu ładunków. Użyj systemu powlekania próżniowego, który jest zainstalowany w jednostce cryo-SEM, aby zapobiec wzrostowi temperatury próbki podczas powlekania.
<ol>
	<li>Upewnij się, że materiał powłokowy jest zainstalowany na wyznaczonej głowicy parownika systemu powlekania.</li>
	<li>Utrzymać temperaturę fazy zimnej w systemie powłokowym poniżej −170 °C.</li>
	<li>Umieścić uchwyt próbki na zimnym etapie systemu powlekania po wystarczającym wytrawieniu przez zamrożenie.</li>
	<li>Otwórz przegrodę między zimnym stopniem a głowicą parownika.</li>
	<li>Ustaw wartość prądu i wartość napięcia głowicy parownika odpowiednio na ok. 30 mA i ok. 5 V.</li>
	<li>Odparować materiał powlekający przez ok. 30 s w celu pokrycia powierzchni próbki.</li>
	<li>Ustaw zarówno wartości prądu, jak i napięcia głowicy parownika na zero i zamknij przegrodę.</li>
	<li>Umieścić uchwyt próbki na zimnym stoliku komory próbki w celu obserwacji.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metody obserwacji cryo-SEM przedstawione w tym artykule są praktyczne do wyraźnej wizualizacji dystrybucji wody w skali komórkowej. Dzięki tej metodzie badanie zmian w dystrybucji wody w ksylemie może potencjalnie pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu tolerancji gatunków drzew na stres abiotyczny (niedobór wody lub zamarzanie) lub stres biotyczny (choroba drzew).
Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest zachowanie rozkładu wody charakterystycznego dla rodzimego stanu wody podczas pobierania próbki ...

Dostępność zasobów wodnych (np. opadów, zawartości wody w glebie) ściśle determinuje śmiertelność i rozmieszczenie geograficzne gatunków roślin, ponieważ muszą one pobierać wodę z gleby i transportować ją do liści w celu produkcji fotosyntetycznej. Rośliny muszą utrzymywać swój system transportu wody w warunkach wahań w zaopatrzeniu w wodę. W szczególności rośliny drzewiaste generują wysokie napięcia w swoich przewodach wzdłuż strumieni transpiracji, ponieważ w niektórych przypadkach muszą utrzymywać swoją koronę na wysokości ponad ~100 m nad ziemią. Aby utrzymać słupy wody pod tak wysokim podciśnieniem, przewody ksylemu składają się z kontinuum komórek rurkowych ze sztywnymi i hydrofobowo zdrewniałymi ścianami komórkowymi1. Podatność przewodów ksylemu na dysfunkcję ksylemu u każdego gatunku jest dobrym wyznacznikiem przetrwania gatunku przy zmiennym zaopatrzeniu w wodę2. Ponadto badanie stanu wody w przewodach ksylemowych jest ważne dla oceny stanu zdrowotnego poszczególnych drzew poddanych stresom abiotycznym lub biotycznym. Pomiar przepływu soków lub potencjału wodnego może zapewnić oszacowanie stanu wody w roślinach drzewiastych dzięki zintegrowanej funkcji hydraulicznej przewodów ksylemu. Co więcej, wizualizacja rozkładu wody w komórkach ksylemu może wyjaśnić stan poszczególnych elementów układu hydraulicznego ksylemu.
Istnieje kilka technik wizualizacji stanu wody w kanałach ksylemowych3. Klasyczne i użyteczne metody obserwacji ścieżek wodnych w tkance drzewiastej polegają na barwieniu słupa wody poprzez zanurzanie końców ściętych gałęzi w barwniku lub wstrzykiwanie barwnika w stojące pnie drzew4. Miękka fotografia rentgenowska umożliwia również wizualizację rozkładu wody w pokrojonych dyskach drewnianych ze względu na różnicową intensywność absorpcji promieniowania rentgenowskiego wilgoci w xylem5,6. Metody te dostarczają jednak tylko śladów ruchu wody lub pokazują makroskopowy rozkład wody. Ostatnio techniki obserwacji nieniszczącej, takie jak rentgenowska tomografia komputerowa z mikroogniskowaniem (μCT)7,8,9,10i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)11,12, zostały znacznie ulepszone, aby umożliwić obserwację wody w przewodach ksylemu w nienaruszonych sadzonkach. Te nieniszczące metody mają wielką zaletę, ponieważ możemy obserwować stan wody w ksylemie bez sztucznych efektów cięcia, a także możemy śledzić dynamikę przepływu wody poprzez sekwencyjne obrazowanie lub wprowadzenie środka kontrastowego10. Musimy jednak użyć dostosowanego rezonansu magnetycznego do obrazowania roślin lub specjalistycznego urządzenia do synchrotronowego μCT, aby uzyskać obrazy, które mogą zidentyfikować zawartość wody na poziomie komórkowym. Ponadto, mimo że synchrotronowy system μCT umożliwił uzyskanie precyzyjnych obrazów o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, która jest porównywalna z mikroskopią świetlną7,8,9, żywe komórki mogą zostać uszkodzone przez promieniowanie promieniowania rentgenowskiego o wysokiej energii13,14. Zastosowanie skaningowego mikroskopu elektronowego, w którym zainstalowane są kriojednostki (cryo-SEM), jest bardzo przydatną metodą precyzyjnego lokalizowania wody w ksylemie na poziomie komórkowym, chociaż wymaga to destrukcyjnego pobrania próbki do obserwacji. Aby utrwalić wodę w przewodach ksylemu, część łodyg (tj. gałązek, gałęzi lub łodyg) jest zamrażana in situ przez ciekły azot (LN2). Obserwacje powierzchni przyciętych, zamrożonych próbek za pomocą cryo-SEM dostarczają bardzo powiększonych obrazów struktury ksylemu, na podstawie których możemy zidentyfikować wodę w przewodach ksylemu jako lód. Istotnym ograniczeniem tej metody jest to, że sekwencyjna obserwacja ruchomości wody w tej samej próbce jest niemożliwa. Jednak zastosowanie μCT lub MRI do sekwencyjnej obserwacji drzew żyjących na polu jest niezwykle trudne, ponieważ instrumenty te nie są przenośne. W przeciwieństwie do tego, cryo-SEM ma potencjał do wykorzystania tej techniki na dużych drzewach w eksperymentach terenowych, aby wyraźnie zobrazować zawartość wody nie tylko na poziomie komórkowym, ale także na drobniejszym poziomie struktury, np. woda w dołach międzynaczyniowych15, woda w przestrzeniach międzykomórkowych16, lub bąbelki w kolumnie wody17.
Wiele badań z udziałem wody ksylemowej za pomocą cryo-SEM zostało zgłoszonych 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi i in. (1996) początkowo ustalili protokół obserwacji ksylemu in situ poprzez zamrażanie żywego pnia poprzez napełnienie LN2 pojemnikiem ustawionym na trzonie21. Temperatura próbki była utrzymywana poniżej -20 °C podczas pobierania próbki i podczas przygotowywania krio-SEM, aby uniknąć stopienia lodu w przewodach ksylemu. Metoda ta została wykorzystana do obserwacji wody w ksylemie w celu wyjaśnienia rozkładu wody pod wpływem zmieniającego się reżimu wodnego11,12,24,25,26,27,28, sezonowa zmiana dystrybucji wody21,29,30, efekt cykli zamrażania i rozmrażania17,31,32, rozkład wody w mokrym drewnie5, zmiany w dystrybucji wody podczas przejścia z bieli na twardziel20, sezonowy przebieg aktywności kambialnej i zróżnicowanie naczyń33oraz kawitacja wywołana pewnymi stresami biotycznymi23,34. Przewodność hydrauliczna i podatność przewodów na kawitację zostały również zweryfikowane za pomocą cryo-SEM35,36. Cryo-SEM wyposażony w spektrometrię rentgenowską z dyspersją energii (EDX lub EDS) został wykorzystany do badania rozkładu pierwiastków na powierzchni próbki zawierającej wodę37.
Zamrożenie żywego pnia, które zawiera przewody pod wysokim napięciem hydraulicznym, czasami powoduje sztuczne kawitacje, które są obserwowane przez cryo-SEM jako pęknięte kryształki lodu w świetle przewodów38,39. W szczególności gatunki liściaste z dłuższymi i szerszymi przewodami są podatne na artefakty wywołane napięciem, takie jak kawitacja spowodowana cięciem próbki, nawet jeśli jest prowadzona pod wodą3,40. Artefakty kawitacji stają się widoczne po pobraniu próbki z drzewa transpirującego (tj. próbkowaniu w ciągu dnia) lub w warunkach ciężkiej suszy i mogą prowadzić do przeszacowania występowania kawitacji3,38,39. W związku z tym naprężenie działające w przewodach musi zostać zwolnione, aby uniknąć sztucznej kawitacji3,12,39.
Technika zamrażania i pękania za pomocą noża zainstalowanego w komorze na próbki jest często stosowana do wystawiania powierzchni próbki do obserwacji kriogenicznej. Jednak popękane przez zamrożenie płaszczyzny zdrewniałych tkanek roślinnych, zwłaszcza przekroje poprzeczne wtórnego ksylemu, są zbyt szorstkie, aby wyraźnie zaobserwować cechy anatomiczne i wodę w tkance6. Zastosowanie kriostatu do przycinania próbki pozwala na szybkie i wysokiej jakości przygotowanie powierzchni próbki20,23. Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie dowodów na rozkład wody w różnych rodzajach komórek ksylemu in situ za pomocą mikroskopii elektronowej bez występowania artefaktów próbkowania. Wprowadzamy naszą zaktualizowaną procedurę, która jest stale ulepszana od czasu jej pierwszego przyjęcia, dotyczącą pobierania próbek, przycinania i czyszczenia powierzchni próbki w celu uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych krioutrwalonych próbek ksylemu.

<table><tbody><tr><td>materiał powłokowy</td><td>JOEL Ltd., Japonia</td><td>Złoty drut, 0,50 &times; 1000 mm, 99,99 %, Nr części 125000499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>krioskaningowy mikroskop elektronowy</td><td>JOEL Ltd., Japonia</td><td>JSM-6510 zainstalowany z kriostatem MP-Z09085T / MP-51020ALS</td><td></td></tr> Ostrze mikrotomu <tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX70</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe</td> ostrza<td>mikrotomu</td> Thermo Scientific <td>HP35 ULTRA,</td> 3153735 <td></td></tr><tr><td>pożywka do zamrażania tkanek</td><td>Żywica</td><td>do zatapiania Thermo Scientific Shandon Cryomatrix, </td><td></td>6769006</tr></tbody></table>

dystrybucja wody ksylemu w roślinach drzewiastych wizualizowana za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Zainstalowany w skaningowym mikroskopie elektronowym krio-unit (cryo-SEM) umożliwia obserwację próbek w temperaturach poniżej zera i jest używany do badania dystrybucji wody w tkankach roślinnych w połączeniu z technikami wiązania zamrażania przy użyciu ciekłego azotu (LN2). Jednak w przypadku gatunków drzewiastych przygotowania do obserwacji powierzchni cięcia poprzecznego ksylemu wiążą się z pewnymi trudnościami ze względu na orientację włókien drzewnych. Ponadto wyższe napięcie w słupie wody w przewodach ksylemowych może czasami powodować sztuczne zmiany w dystrybucji wody, zwłaszcza podczas utrwalania i pobierania próbki. W tym badaniu demonstrujemy skuteczną procedurę obserwacji dystrybucji wody w ksylemie roślin drzewiastych in situ przy użyciu kriostatu i krio-SEM. Na początku, podczas pobierania próbki, pomiar potencjału wodnego ksylemu powinien określić, czy w przewodach ksylemu występuje wysokie napięcie. Gdy potencjał wodny ksylemu jest niski (< ok. −0,5 MPa), konieczna jest procedura relaksacji naprężeń, aby ułatwić lepsze zachowanie stanu wody w przewodach ksylemu podczas utrwalania próbki przez zamrożenie. Następnie wokół pnia drzewa mocuje się wodoszczelny kołnierz i wypełnia LN2 w celu zamrożenia stanu wody ksylemu. Po zbiorach należy dołożyć starań, aby zapewnić, że próbka jest zakonserwowana w stanie zamrożonym podczas wykonywania procedur przygotowania próbki do obserwacji. Kriostat służy do wyraźnego odsłonięcia powierzchni cięcia poprzecznego ksylemu. W obserwacjach krio-SEM wymagana jest korekta czasu dla trawienia przez zamrożenie, aby usunąć pył szronowy i zaakcentować krawędź ścian komórkowych na powierzchni widokowej. Nasze wyniki wskazują na możliwość zastosowania technik krio-SEM do obserwacji dystrybucji wody w ksylemie na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Połączenie cryo-SEM z nieniszczącymi technikami obserwacji in situ znacznie poprawi badania dynamiki przepływu wody w roślinach drzewiastych.

Reprezentatywne obrazy powierzchni przekrojów poprzecznych ksylemu drzew iglastych i liściastych, obserwowane za pomocą cryo-SEM, przedstawiono na Rysunku 2. Przy małym powiększeniu czarny obszar na obrazach wskazuje jamy, z których woda znika całkowicie lub częściowo, a obszar szary wskazuje ściany komórek ksylemu, cytoplazmę i wodę (Rysunek 2A). Przy dużym powiększeniu widoczne jest, że woda nie znika całkowici...

Obserwacja rozkładu wody w ksylemie dostarcza istotnych informacji na temat dynamiki przepływu wody w roślinach drzewiastych. W tym badaniu demonstrujemy praktyczne podejście do obserwacji dystrybucji wody ksylemu in situ przy użyciu kriostatu i krio-SEM, co eliminuje sztuczne zmiany stanu wody podczas przygotowywania próbki.

Dystrybucja wody ksylemu w roślinach drzewiastych wizualizowana za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie nam rozdzielczości elektromikroskopowej rozkładu wody w różnych rodzajach komórek ksylemu in situ. Metoda ta została wykorzystana do obserwacji wody w ksylemie w celu wyjaśnienia dystrybucji wody i zmieniających się reżimów wodnych, sezonowych zmian dystrybucji wody, wpływu cykli zamrażania/rozmrażania, rozkładu wody w mokrym drewnie oraz kawitacji wywołanej pewnymi stresami biotycznymi. Zamarzanie żywego pnia pod wpływem wysokich naprężeń hydraulicznych czasami powoduje sztuczne kawitacje, które są obserwowane przez cryo-SEM jako pęknięte kryształki lodu w świetle przewodu.Ta zaktualizowana procedura koncentruje się na uzyskaniu wysokiej jakości mikrofotografii aerotomowych ksylemu bez artefaktu w procedurze pobierania próbek. Realna demonstracja ma kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje wiele ważnych szczegółów, których nie można łatwo wyjaśnić. Jednocześnie uzyskanie szkolenia nie jest łatwe, ponieważ tylko kilka laboratoriów na całym świecie praktykuje tę metodę.Aby rozpocząć tę procedurę, należy dołączyć gałąź i liście do pobierania próbek w czarną plastikową torbę, aby zrównoważyć potencjał wodny między ksylemem a liśćmi na więcej niż dwie godziny przed pobraniem próbki. Korzystając z komory ciśnieniowej, należy określić potencjał wodny co najmniej dwóch liści z próbki. Gdy potencjał wodny jest wyższy niż około minus 0,5 megapaskala, próbkę można pobrać po zamrożeniu.Gdy potencjał wodny jest mniejszy niż minus 0,5 megapaskali należy przystąpić do zabiegu relaksacyjnego. Zamocuj wodoszczelny kołnierz wokół łodygi, która zostanie wypełniona wodą. Za pomocą sekatora lub piły odetnij łodygę pod powierzchnią wody i trzymaj odcięty koniec próbki pod wodą.Przenieś próbkę do innego pojemnika z wodą tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować wystawienie odciętego końca na działanie powietrza. W przypadku gatunków szerokolistnych należy zapewnić, aby długość od miejsca, w którym zostanie uzyskana próbka kriogeniczna do SEM, do krawędzi cięcia zebranej łodygi była dłuższa niż maksymalna długość naczynia próbki, aby zapobiec powstawaniu artefaktów spowodowanych naprężeniem w krioample. Następnie przykryj próbkę czarną plastikową torbą, aby zmniejszyć transpirację.Trzymaj odcięty koniec próbki w wodzie i utrzymuj ten stan przez około 30 minut, aby rozluźnić napięcie ksylemu. Następnie ponownie zmierz potencjał wody, aby potwierdzić rozluźnienie napięcia ksylemu. Najpierw użyj nożyczek lub noża uniwersalnego, aby przeciąć i otworzyć jedną stronę wodoszczelnej obroży.Przymocuj kołnierz ciasno wokół trzpienia za pomocą taśmy klejącej, trzymając otwór poziomo. Załóż rękawice izolacyjne i bezpiecznie trzymaj naczynie z ciekłym azotem. Wlej ciekły azot do kołnierza, aż będzie pełny i utrzymuj go napełniony, stopniowo dodając dodatkowy ciekły azot, aby całkowicie zamrozić wodę w ksylemie.Po upływie wystarczającego czasu zamrażania odczepić kołnierz od zamrożonej części trzpienia próbki w celu usunięcia ciekłego azotu. Natychmiast użyj cienkiej piły ręcznej, aby zebrać próbkę. Następnie przykryj zamrożoną próbkę kawałkiem folii aluminiowej lub włóż ją z powrotem do probówki z próbką.Pobraną próbkę należy szybko umieścić w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia obserwacji. Na początek ustaw temperaturę komory na próbki kriostatu na minus 30 stopni Celsjusza, która zwykle jest wystarczająco niska, aby utrzymać sok ksylemu większości roślin w stanie zamrożonym.Użyj ostrego noża lub piły o drobnych zębach, aby przyciąć próbkę na mały kawałek, który można dostosować do uchwytu próbki krio-SEM. Zamontuj przycięty element na uchwycie, uchwycie na kriostat, z medium do zamrażania tkanek do kriosekcji. Przymocuj uchwyt do uchwytu na próbkę mikrotomu kriostatu.Przytnij powierzchnię, wielokrotnie goląc odcinki o grubości od pięciu do siedmiu mikrometrów. Odcięcie od 1 000 do 2 000 mikrometrów całkowitej głębokości do początkowej powierzchni jest przydatne do eliminacji uszkodzonej części próbki spowodowanej wstępnym cięciem. Po zgrubnym przycięciu powierzchni próbki, wyreguluj nieużywaną część ostrza mikrotomu nad powierzchnią próbki.Nieznacznie poszerz odległość między powierzchnią próbki a ostrzem. I wytnij powierzchnię tylko raz lub dwa razy. Następnie ponownie wsuń ostrze i umieść nieużywaną część ostrza na powierzchni próbki.Powtórz tę obróbkę cięcia trzy do czterech razy, aby uzyskać czystą powierzchnię bez śladów noża. Po ostatnim cięciu ustaw pozycję ostrza z dala od próbki, aby zapobiec przywieraniu pyłu do próbki. I odłącz uchwyt od mikrotomu.Następnie przymocuj próbkę do uchwytu na próbki cryo-SEM z podłożem do zamrażania tkanek w komorze kriostatu. Najpierw użyj ciekłego azotu, aby utrzymać temperaturę poniżej minus 120 stopni Celsjusza w komorze próbki cryo-SEM zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia. Następnie umieść uchwyt na próbkę z przygotowaną próbką w pojemniku izolacyjnym wypełnionym ciekłym azotem w komorze kriostatu.Użyj pręta do wymiany próbek, aby przytrzymać uchwyt próbki pod ciekłym azotem. Szybko przenieś uchwyt próbki do komory wstępnej ewakuacji komory próbek cryo-SEM, gdy tylko rozpocznie się opróżnianie komory wstępnej ewakuacji. Aby rozpocząć, włącz napięcie przyspieszenia pistoletu elektrycznego.Następnie podnieś temperaturę etapu próbki do minus 100 stopni Celsjusza. Odczekaj kilka minut, aż pył szronowy zostanie usunięty i aż poziom powierzchni lodu w komórkach ksylemu nieznacznie się zmniejszy w porównaniu ze ścianami komórkowymi. Następnie obniż temperaturę etapu speiumen do minus 120 stopni Celsjusza.W tym badaniu metody obserwacji cryo-SEM są wykorzystywane do wyraźnej wizualizacji dystrybucji wody w skali komórkowej. Przy małym powiększeniu obszar na obrazach wskazuje jamy, z których całkowicie lub częściowo znika woda, podczas gdy szary obszar wskazuje ściany komórkowe ksylemu, cytoplazmę i wodę. Przy dużym powiększeniu staje się oczywiste, że woda nie jest całkowicie tracona ze światła trzech tchawicy, co wskazuje na występowanie makropęcherzyków w soku ksylemu in situ.W przypadku gatunków szerokolistnych występowanie kawitacji jest łatwe do wykrycia w naczyniach, podczas gdy obecność wody jest trudna do rozróżnienia we włóknach, zwłaszcza przy małym powiększeniu. Komórki cytoplazmy i miąższu można odróżnić od wody w tchawicach lub naczyniach dzięki teksturze płaszczyzny lodu. Analiza wpływu temperatury na proces trawienia przez zamrażanie pokazuje, że pył szronowy jest stopniowo sublimowany, a błony wgłębień śródśladowych stają się jaśniejsze w wyniku postępu sublimacji wraz ze wzrostem temperatury.Pozostałe duże cząsteczki pyłu szronowego można usunąć poprzez dalsze trawienie przez zamrażanie. Ale może to być problematyczne, ponieważ niepotrzebnie zmniejsza poziom powierzchni lodu w przewodach ksylemowych. Wysoką jakość obserwacji osiąga się w dużej mierze dzięki dokładnemu przygotowaniu próbki.Szczególnie ważne jest wygładzenie powierzchni ostrym ostrzem mikrotomu. Niedostateczne wygładzenie zużytym ostrzem może czasami tworzyć szorstką powierzchnię, która przypomina ślady noża lub może powodować liczne wystąpienia kurzu z nacięć. Zamrożenie próbki bez rozluźnienia ujemnego ciśnienia słupa wody spowoduje sztuczną indukcję kawitacji w przewodach ksylemu.Skupione kryształki lodu obserwuje się w naczyniach próbek, w których próbka nie została rozluźniona. Dla kontrastu, w zrelaksowanych próbkach o podobnym potencjale wodnym nie obserwuje się skupionych kryształków lodu. Zastosowanie utrwalania przez zamrożenie do transpiracyjnych żywych roślin, które cierpią z powodu suszy, może wywołać artefakty oparte na wynikach, takie jak skupione kryształki lodu.Artefakty te prowadzą do błędnych interpretacji stanu wody w kanale ksylemowym. Dlatego ważne jest, aby najpierw potwierdzić potencjał wodny próbek przed utrwaleniem przez zamrożenie. Chociaż procedura ta zapewnia obraz tego, jaki jest stan w przewodzie ksylemowym, żywe drzewo musi zostać zniszczone w celu obserwacji.Połączenie innych nieinwazyjnych metod obserwacji, takich jak rezonans magnetyczny lub mikrotomografia komputerowa, z obserwacją obrazową na poziomie pomocniczym pogłębi nasze zrozumienie natury między transportem wodnym a jego wykorzystaniem. Obserwacja stanu wody wprowadzona w tym artykule dostarczy również metody wyjaśnienia związku między wodą zmieszaną w komórkach a innymi reakcjami anatomicznymi na stres abiotyczny lub biotyczny. Cryo-SEM wyposażony w spektroskopię rentgenowską z dyspersją energii lub top sim został wykorzystany do badania rozkładu pierwiastków na powierzchni próbki zawierającej wodę.Połączenie analizy elementarnej i tej procedury w tym podobnym schemacie może dać nam głęboką wiedzę na temat zachowania komórek ksylemu związanego ze stanem wody. Używając ciekłego azotu do zamrażania próbek w pomieszczeniu, nie zapomnij przewietrzyć pomieszczenia, aby uniknąć niedoboru tlenu.

xylem-water-distribution-woody-plants-visualized-with-cryo-scanning

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Rentgenowska tomografia komputerowa (HRCT) o wysokiej rozdzielczości to nieniszcząca technika obrazowania diagnostycznego, która może być wykorzystana do badania struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin w 3D. Pokazujemy, w jaki sposób HRCT ułatwia eksplorację sieci ksylemu w szerokim zakresie tkanek i gatunków roślin.

Wykorzystanie tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji trójwymiarowej struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak pobierać próbki z drewnianych próbek w celu ogólnej oceny ich struktur wzrostu. Opisano makro- i mikroskopowe techniki preparacji i wizualizacji niezbędne do wygenerowania dobrze odwzorowanych i wysoce rozdzielczych zbiorów danych anatomicznych i dendroekologicznych drewna.

Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

Tutaj opisujemy procedurę badania tkanek roślinnych pękniętych przez lók. Wysokociśnieniowe próbki zamrożonych liści są pękane przez zamrażanie i powlekane dwuwarstwowo, co daje dobrze zachowane zamrożone i uwodnione próbki, które są obrazowane za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego przy dużych powiększeniach przy minimalnym uszkodzeniu wiązki.

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Oferujemy nowatorską metodę poprawy kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego tkanki kukurydzy, odpowiednią do zwykłego skanowania metodą tomografii mikrokomputerowej. Na podstawie obrazów CT wprowadzamy zestaw procesów przetwarzania obrazów dla różnych materiałów kukurydzianych, aby skutecznie wyodrębnić mikroskopijne fenotypy wiązek naczyniowych kukurydzy.

Techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową

Ten protokół pokazuje, jak na żywo obrazować i analizować merystemy wierzchołkowe pędów z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Micro-CT to nieniszczące narzędzie, które może analizować struktury roślin w trzech wymiarach. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbki w celu wykorzystania mikro-CT do analizy struktury i funkcji roślin pasożytniczych. Aby podkreślić zalety tej metody w połączeniu z określonymi preparatami, stosuje się różne gatunki.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę obserwacji histologicznej galasów indukowanych przez Plasmodiophora brassicae. Skrawki wibratomu hipokotyli są oczyszczane przed obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania udziału czynników transkrypcyjnych i fitohormonów podczas progresji choroby. Protokół ten przezwycięża ograniczenia związane z zatapianiem żywicy, umożliwiając wizualizację białek fluorescencyjnych w plantach.

Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Tutaj pokazujemy, jak przetwarzać rdzenie drzew za pomocą łańcucha narzędzi do tomografii komputerowej rentgenowskiej. Z wyjątkiem ekstrakcji chemicznej do niektórych celów, nie jest wymagana dalsza fizyczna obróbka laboratoryjna. Łańcuch narzędzi może być używany do szacowania biomasy, do uzyskiwania danych MXD/szerokości słojów drzew, a także do uzyskiwania ilościowych danych dotyczących anatomii drewna.

Analiza rdzenia drzewa za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej

Poznaj metodę obserwacji dystrybucji wody w naczyniach ksylemu roślin drzewiastych za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego. Technika ta eliminuje artefakty przygotowania próbek i pozwala badać dynamikę przepływu wody.

Dystrybucja wody ksylemu w roślinach drzewiastych wizualizowana za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego

Przeglądaj więcej filmów