Name: Obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microCT) Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj protokół microCT dla bezkręgowców morskich, w tym Actinia equina, Harmothoe sp. i Xenoturbella japonica. Metoda umożliwia obrazowanie różnorodnych morfologii przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Toshihiko Shiroishi za pomoc i zapewnienie środowiska badawczego podczas tego badania. Jesteśmy wdzięczni Kensuke Yanagi i Takato Izumi za porady dotyczące A. equina oraz Masaatsu Tanaka za porady dotyczące okazu Harmothoe sp. Chcielibyśmy podziękować personelowi Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba oraz Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo za pomoc w pobraniu próbek. Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim. Prace te były wspierane przez JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) dla HN oraz JAMBIO, Japońskie Stowarzyszenie Biologii Morskiej.

1. Fiksacja
<ol>
	<li>W przypadku Actinia equina należy zrelaksować zwierzęta w wodzie morskiej o stężeniu 10% MgCl2 przez około 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś do 70% etanolu i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W przypadku Harmothoe sp. znieczulij zwierzęta, umieszczając je w lodowatej wodzie morskiej na około 15 minut. Przenieś do 10% (v/v) roztworu formaliny z wodą morską i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W przypadku Xenoturbella japonica należy zrelaksować zwierzę, stosując 7% MgCl2 w słodkiej wodzie. Utrwal 4% paraformaldehydu (PFA) w przefiltrowanej wodzie morskiej przez noc. Umieścić w 70% etanolu i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
</ol>
2. Barwienie
<ol>
	<li>Przenieść próbki do 50% etanolu i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Zastąp 50% etanolu 25% etanolem i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny 
	UWAGA: Nie jest to konieczne w przypadku próbki Harmothoe sp. w 10% (v/v) roztworze formaliny z wodą morską.</li>
	<li>Zastąp roztwór wodą destylowaną (DW) i przechowuj próbki w DW w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Przygotować 25% płyn Lugola, rozcieńczając roztwór podstawowy (poniżej) do 25% za pomocą DW. Roztwór podstawowy (100% płyn Lugola) zawiera 10 g KI i 5 g I2, dostosowany do 100 ml z DW. 
	UWAGA: Lugol jest płyn wrażliwy na światło, dlatego należy go przechowywać i obchodzić się z nim w sposób chroniony przed światłem. Postępuj zgodnie z przepisami każdego kraju i instytucji dotyczącymi postępowania z jodem i utylizacji odpadów.</li>
	<li>Zdekantować DW z próbek i wlać 25% płyn Lugola. Bejcować przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Montaż sceniczny
<ol>
	<li>Przygotować 0,5% agarozy, rozpuszczając 500 mg agarozy w 100 ml DW w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml w kuchence mikrofalowej (800 W, około 1-3 min). Schłodzić do około 30-40 °C, utrzymując w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Nie przegrzewaj ani nie zamykaj całkowicie kolby podczas podgrzewania, aby zapobiec wykipieniu agarozy.</li>
	<li>Zamontuj duże próbki, takie jak A. equina, za pomocą probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Do mocowania dużych próbek, które nie mieszczą się w "niebieskiej" końcówce mikropipety o pojemności 1 000 μl, należy używać probówek o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Umieść zabarwioną próbkę w naczyniu o średnicy 60 mm z DW, aby zmyć nadmiar roztworu barwiącego z powierzchni.</li>
		<li>Delikatnie wlej 5 ml 0,5% agarozy do probówki o pojemności 50 ml i utwardź agarozę na lodzie. Uważaj, aby w agarozie nie zrobiły się bąbelki.</li>
		<li>Delikatnie dodaj 20 ml 0,5% agarozy do probówki o pojemności 50 ml i umieść na lodzie, aż agaroza zacznie twardnieć. Umieść próbkę w 0,5% agarozie za pomocą kleszczy. Uważaj, aby w agarozie nie zrobiły się bąbelki.</li>
		<li>Dostosuj położenie i orientację próbki za pomocą kleszczy i utwardź agarozę na lodzie.</li>
		<li>Umieść glinę na etapie montażu mikrotomografii komputerowej i ustaw probówkę o pojemności 50 ml na glinie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj małe próbki, takie jak Harmothoe sp. i X. japonica, za pomocą "niebieskiej" końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl. 
	UWAGA: W przypadku mniejszych próbek można użyć "żółtej" końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl. W takim przypadku użyj 30 μl agarozy jako korka i dodaj 200 μl agarozy lub wody destylowanej.
	<ol>
		<li>Pobrać 100 μl 0,5% agarozy do "niebieskiej" końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl i utwardzić agarozę, przytrzymując końcówkę nad lodem, tworząc zatyczkę w końcówce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B-a).</li>
		<li>Przelać zabarwioną próbkę do naczynia o średnicy 60 mm bez użycia kleszczy.</li>
		<li>Delikatnie przenieś próbkę za pomocą pęsety pierścieniowej do innego naczynia o średnicy 60 mm z DW, aby zmyć nadmiar roztworu barwiącego z powierzchni.</li>
		<li>Dodać 1 000 μl 0,5% agarozy lub DW do zatkanej końcówki (krok 3.3.1) za pomocą mikropipety. 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie 0,5% agarozy, ale DW należy stosować do delikatnych lub cennych próbek, w których należy unikać agarozy.</li>
		<li>Delikatnie przenieś próbkę z naczynia o średnicy 60 mm do agarozy lub DW w zatkanej końcówce za pomocą pęsety pierścieniowej.</li>
		<li>Delikatnie dostosuj pozycję i orientację próbki za pomocą igły do ogonków liściowych lub precyzyjnej pęsety. Uważaj, aby nie zrobić bąbelków w podłożu montażowym. Upewnij się, że próbka jest stabilna między ściankami końcówki, gdy DW jest używany jako medium montażowe (Rysunek 2D-b). Umieść końcówkę na lodzie, aby utwardzić agarozę, jeśli jest używana jako medium montażowe.</li>
		<li>Odetnij końcówkę nowej "niebieskiej" końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B-b,c) i włóż końcówkę zatkanej końcówki do nowej końcówki.</li>
		<li>Umieść glinę na etapie montażu mikrotomografii komputerowej i ustaw końcówki z próbką w środku na glinie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C,D). 
		UWAGA: Roztwór barwiący zacznie zmywać próbkę po umieszczeniu jej w DW, więc natychmiast przejdź do następnego kroku skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badanie mikrotomografem komputerowym
<ol>
	<li>Włącz wiązkę promieniowania rentgenowskiego przy napięciu 80 kV, 100 μA.</li>
	<li>Obserwując obraz transmisji promieniowania rentgenowskiego na środku ekranu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A), przesuń stolik tak, aby cała próbka była widoczna, klikając przyciski osi X i Z (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) i ręcznie regulując pokrętło osi Y na stoliku montażowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Ustaw kontrast obrazu tak, aby można było obserwować struktury wewnętrzne, dostosowując warunki kontrastu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A: Kontrast obrazu).</li>
	<li>Dostosuj orientację próbki, zmieniając kąt rurki/końcówki w glinie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Obróć stolik o 90°, ustawiając oś obrotu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) na 90 i klikając przycisk ruchu względnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Wykonaj ten sam manewr cztery razy, aby wykonać pełny obrót. 
	UWAGA: Ręcznie wyłączaj wiązkę promieniowania rentgenowskiego za każdym razem, gdy drzwiczki próbki są otwierane, chyba że system wyłączy ją automatycznie.</li>
	<li>Przesuń stolik tak, aby próbka znalazła się w środku widoku, klikając przycisk osi Z (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) i ręcznie regulując pokrętło osi Y na stoliku montażowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Obróć scenę o 90° i zrób to samo. Obróć stolik o 360° i sprawdź, czy próbka znajduje się w środku view ze wszystkich kierunków.</li>
	<li>Przesuń stolik wzdłuż osi x w kierunku źródła wiązki promieniowania rentgenowskiego, klikając przycisk osi X (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A), aby powiększyć próbkę i dostosować ją w razie potrzeby, aby pasowała do widoku (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3 C).</li>
	<li>Obróć stolik o 360° i dostosuj w razie potrzeby, aby próbka zmieściła się w polu widzenia ze wszystkich kierunków.</li>
	<li>Dostosuj warunki skanowania, jak pokazano w Tabeli 1.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie, które zajmie około 10 minut.</li>
</ol>
5. Rekonstrukcja obrazu
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie akcesoriów systemu microCT (patrz tabela materiałów) i otwórz zeskanowane dane.</li>
	<li>Dostosuj różnice w osi obrotu próbki podczas skanowania, klikając przycisk automatycznego obliczania wartości przesunięcia (Rysunek 4A: zielone pole).</li>
	<li>Dostosuj orientację obrazu, obracając pomarańczowe strzałki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Jeśli orientacja została zmieniona, powtórz krok 5.2.</li>
	<li>Kliknij zakładkę obszaru (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C: pole magenta) i przytnij obszary, w których nie ma próbek (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C: żółte pole).</li>
	<li>Kliknij na zakładkę rekonfiguracji (Rysunek 4D: pole magenta) i ustaw filtry w następujący sposób, aby usunąć szum. Filtr redukujący artefakty pierścienia: Filtr mediany -3; Filtr eliminacji szumów: Filtr średnia-1.</li>
	<li>Wykonaj rekonfigurację, klikając przycisk rekonfiguracji (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D: zielone pole).</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast obrazu, ustawiając wartości czerni i bieli jako wartość czerni 0, wartość bieli 250 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D: niebieskie pole).</li>
	<li>Zapisz zrekonstruowany zestaw danych obrazu TIFF jako 8-bitowy TIFF, klikając przycisk Zapisz. Zmień nazwy plików TIFF na następujące: Date_sample_resolution (μm)_number.tiff. 
	UWAGA: Oryginalne zestawy danych mikrotomografii komputerowej z tego badania są dostępne w repozytorium Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.</li>
</ol>
6. Analizy danych
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie do analizy danych (patrz tabela materiałów) i włącz importowanie plików TIFF, klikając ikonę bazy danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A: pole magenta) i wyłączając pole pokazane w Rysunek 5B.</li>
	<li>Kliknij ikonę importu (Rysunek 5C: pole magenta), wybierz zestaw danych zapisany w sekcji 5 i kliknij przycisk Otwórz.</li>
	<li>Kliknij przycisk kopiowania linków (Rysunek 5D), aby zaimportować dane.</li>
	<li>Wyświetl przekrój 2D, klikając ikonę przeglądarki 2D (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C: niebieskie pole).</li>
	<li>Skalibruj zestaw danych, klikając zakładkę przeglądarki 3D (Rysunek 5E: pole magenta) i wprowadzając wartość rozdzielczości podczas skanowania (która w tym badaniu wynosiła 0,018 [Rysunek 5F]).</li>
	<li>Kliknij ikonę jasności/kontrastu (Rysunek 5E zielone pole). Dostosuj jasność i kontrast, przesuwając kursor wewnątrz wyświetlanego obrazu 2D i zmieniając poziom i szerokość okna (Rysunek 5G).</li>
	<li>Sprawdź inne obrazy przekrojów, przesuwając pasek przewijania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5G: pole).</li>
	<li>Zmień orientację przekroju, klikając ikonę orientacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5E: niebieskie pole) i sprawdź obrazy we wszystkich orientacjach (<silna klasa="xfig">Rysunek 5H).</li>
	<li>Kliknij na wyświetlony obraz i wybierz zakładkę eksportu, aby zapisać obrazy przekrojów.</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Greenbaum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+CLARITY%3A+clearing%2C+imaging%2C+and+computational+analysis+of+osteoprogenitors+within+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow.</a> Science Translational Medicine. 9, (2017).</li>
<li>Konno, A., Okazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous-based+tissue+clearing+in+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Aqueous-based tissue clearing in crustaceans.</a> Zoological Letters. 4, 13(2018).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9, 11(2009).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+3D+phenotyping+of+cardiovascular+development+in+mouse+embryos+by+micro-CT+with+iodine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining.</a> Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomographic+imaging+of+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).</li>
<li>Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+three-dimensional+microscopic+imaging+in+marine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology%22%5BJournal%5D)">The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology.</a> Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).</li>
<li>Mizutani, R., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography in biology.</a> Micron. 43, 104-115 (2012).</li>
<li>Merkle, A. P., Gelb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+3D+X-ray+microscopy+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory.</a> Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).</li>
<li>Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZiegler%2C+A+%22Computation+for+humanity.+Information+technology+to+advance+society%22">Computation for humanity. Information technology to advance society</a>. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).</li>
<li>Gignac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+iodine-based+contrast-enhanced+computed+tomography+%28diceCT%29%3A+an+emerging+tool+for+rapid%2C+high-resolution%2C+3-D+imaging+of+metazoan+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues.</a> Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).</li>
<li>du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+x-ray+micro-computed+tomography%3A+a+user+guideline+for+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples.</a> GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).</li>
<li>Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography%3A+Introducing+new+dimensions+in+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy.</a> ZooKeys. 263, 1-45 (2013).</li>
<li>Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tissues+in+3D+via+X-ray+tomography%3A+simple+contrasting+methods+allow+high+resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging.</a> PLoS One. 8 (9), 75295(2013).</li>
<li>Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sine+Systemate+Chaos%3F+A+Versatile+Tool+for+Earthworm+Taxonomy%3A+Non-Destructive+Imaging+of+Freshly+Fixed+and+Museum+Specimens+Using+Micro-Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography.</a> PLoS One. 9 (5), 96617(2014).</li>
<li>Paterson, G. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+using+micro-computed+tomography+in+gross+and+microanatomical+assessments+of+polychaetous+annelids%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+Museum+Victoria%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids.</a> Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).</li>
<li>Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+micro-CT+become+an+essential+tool+for+the+21st+century+taxonomist%3F+An+evaluation+using+marine+polychaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes.</a> Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).</li>
<li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+limitations+of+X-ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy%3A+a+methodological+and+comparative+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).</li>
<li>Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+describing+brooding+in+three+species+of+South+African+brittle+stars%2C+comprising+seven+high-resolution%2C+micro+X-ray+computed+tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans.</a> GigaScience. 4 (1), 52(2015).</li>
<li>Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+king+crab+Hapalogaster+mertensii+Brandt%2C+1850+%28Anomura%3A+Paguroidea%3A+Hapalogastridae%29+-+new+insights+into+the+evolutionary+transformation+of+hermit+crabs+into+king+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Contributions+to+Zoology%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs.</a> Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).</li>
<li>Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+X-ray+micro-computed+tomography+for+soft-bodied+and+gelatinous+cnidarians+with+emphasis+on+scyphozoan+and+cubozoan+statoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths.</a> Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).</li>
<li>Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+End+of+the+Cold+Loneliness%3A+3D+Comparison+between+Doto+antarctica+and+a+New+Sympatric+Species+of+Doto+%28Heterobranchia%3A+Nudibranchia%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia).</a> PLoS One. 11 (7), 0157941(2016).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 17, 245(2017).</li>
<li>Tsuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KNOTTED1+Cofactors%2C+BLH12+and+BLH14%2C+Regulate+Internode+Patterning+and+Vein+Anastomosis+in+Maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize.</a> Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).</li>
<li>Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+annelid+anatomy+using+micro-computed+tomography%3A+A+taxonomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Zoologischer+Anzeiger%22%5BJournal%5D)">Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach.</a> Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).</li>
<li>Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+avatars+for+Myriapods%3A+Complete+3D+morphology+of+type+specimens+transcends+conventional+species+description+%28Myriapoda%2C+Chilopoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda).</a> PLoS One. 13 (7), 0200158(2018).</li>
<li>Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemones+through+X-rays%3A+visualization+of+two+species+of+Diadumene+%28Cnidaria%2C+Actiniaria%29+using+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Museum+Novitates%22%5BJournal%5D)">Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT.</a> American Museum Novitates. 3907, (2018).</li>
<li>Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+imaging+applied+to+description+of+a+new+species+of+Pagurus+Fabricius%2C+1775+%28Crustacea%3A+Decapoda%3A+Anomura%3A+Paguridae%29%2C+with+selection+of+three-dimensional+type+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data.</a> PLoS One. 13 (9), 0203107(2018).</li>
<li>Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+micro-computed+tomography+as+a+minimally+invasive+tool+for+anatomical+study+of+bivalves+%28Mollusca%3A+Bivalvia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia).</a> Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).</li>
<li>Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSasaki%2C+T+%22Biomineralization%22">Biomineralization</a>. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).</li>
<li>Maeno, A., Tsuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+Tomography+to+Visualize+Vascular+Networks+in+Maize+Stems%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems.</a> Bio-protocol. 8 (1), 2682(2018).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+to%3A+A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 18, 83(2018).</li>
<li>Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+files+from+%27Microfocus+X-ray+computed+tomography+%28microCT%29+imaging+of+Actinia+equina+%28Cnidaria%29%2C+Harmothoe+sp.+%28Annelida%29%2C+and+Xenoturbella+japonica+%28Xenacoelomorpha%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22figshare%22%5BJournal%5D)">MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'.</a> figshare. , (2019).</li>
<li>Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+specimen+shrinkage+in+iodine-enhanced+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT.</a> Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).</li>
<li>Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+shrinkage+of+bone%2C+brain+and+muscle+tissue+in+sample+preparation+for+micro-CT+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM).</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).</li>
<li>Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+of+mechanical+inaccuracies+in+micro-CT+and+nano-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT.</a> Proceedings of SPIE. 7078, 70781(2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiadomo, że utrwalacze wykorzystujące formalinę, takie jak 10% (v/v) roztwór formaliny w wodzie morskiej użyty w tym badaniu, zachowują morfologię różnych bezkręgowców morskich i są często używane do obrazowania mikrotomografii komputerowej 18,24,25,26,28,30,33. Jednak w ostatnich latach w n...

Badacze biologii zazwyczaj musieli tworzyć cienkie przekroje i prowadzić obserwacje za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej, aby zbadać wewnętrzne struktury nieprzezroczystych organizmów. Jednak metody te są destrukcyjne i problematyczne, gdy stosuje się je do rzadkich lub cennych okazów. Co więcej, kilka etapów metody, takich jak osadzanie i cięcie, jest czasochłonnych, a obserwacja próbki może zająć kilka dni, w zależności od protokołu. Co więcej, podczas obsługi wielu sekcji zawsze istnieje możliwość uszkodzenia lub zgubienia niektórych sekcji. Techniki oczyszczania tkanek są dostępne dla niektórych okazów1,2,3,4,5, ale nie mają jeszcze zastosowania do wielu gatunków zwierząt.
Aby przezwyciężyć te problemy, niektórzy biolodzy zaczęli korzystać z obrazowania mikrofokusowej tomografii komputerowej (microCT) rentgenowskiej tomografii komputerowej (microCT)6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. W tomografii rentgenowskiej próbka jest naświetlana promieniami rentgenowskimi pod różnymi kątami, które są generowane przez źródło promieniowania rentgenowskiego poruszającego się wokół próbki, a przesyłane promienie rentgenowskie są monitorowane przez detektor, który również porusza się wokół próbki. Uzyskane dane transmisji promieniowania rentgenowskiego są analizowane w celu rekonstrukcji obrazów przekroju poprzecznego próbki. Metoda ta umożliwia obserwację struktur wewnętrznych bez niszczenia próbki. Ze względu na swoje bezpieczeństwo i łatwość stosowania jest powszechnie stosowany w zastosowaniach medycznych i dentystycznych, a systemy CT można znaleźć w szpitalach i centrach dentystycznych na całym świecie. Co więcej, przemysłowa tomografia rentgenowska jest często stosowana do obserwacji próbek niemedycznych do kontroli i metrologii w przemyśle napędowym. W przeciwieństwie do medycznej tomografii komputerowej, w której źródło promieniowania rentgenowskiego i detektory są ruchome, obie części są zamocowane w przemysłowej tomografii komputerowej, a próbka obraca się podczas skanowania. Przemysłowa tomografia komputerowa na ogół wytwarza obrazy o wyższej rozdzielczości niż medyczna tomografia komputerowa i jest określana jako mikroCT (rozdzielczość na poziomie mikrometrów) lub nanoCT (rozdzielczość na poziomie nanometrów). Ostatnio gwałtownie wzrosła liczba badań z wykorzystaniem mikrotomografii komputerowej w różnych dziedzinach biologii14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34.
Badania biologiczne z użyciem tomografii komputerowej początkowo koncentrowały się na wewnętrznych strukturach, które głównie składają się z twardych tkanek, takich jak kości. Postępy w technikach barwienia przy użyciu różnych środków chemicznych umożliwiły wizualizację tkanek miękkich w różnych organizmach6,7,8,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, 31,32,33,34. Spośród tych odczynników, środki kontrastowe na bazie jodu są stosunkowo bezpieczne, niedrogie i mogą być stosowane do wizualizacji tkanek miękkich w różnych organizmach7,14. Jeśli chodzi o bezkręgowce morskie, mikrotomografia komputerowa jest szeroko stosowana u takich zwierząt jak6,25,32,33, pierścienice18,19,20,28, oraz arthoropods21,23, 29,31. Pojawiło się jednak niewiele doniesień o innych typach zwierząt, takich jak mszywioły6, xenacoelomorphs26 i parzydełkowce24,30. Ogólnie rzecz biorąc, przeprowadzono mniej badań z zastosowaniem mikrotomografii komputerowej na bezkręgowcach morskich niż na kręgowcach. Jednym z głównych powodów tego ograniczonego stosowania u bezkręgowców morskich jest ogromna różnorodność obserwowana u tych zwierząt. Ze względu na ich zróżnicowane rozmiary, morfologie i fizjologie, każdy gatunek inaczej reaguje na różne procedury eksperymentalne. Dlatego tak ważne jest, aby podczas przygotowywania próbki wybrać najodpowiedniejszy odczynnik utrwalający i barwiący oraz ustalić warunki na każdym etapie, dostosowane do każdego gatunku. Podobnie, konieczne jest również ustawienie konfiguracji skanowania, takich jak metoda montażu, napięcie, prąd, powiększenie mechaniczne i moc rozdzielczości przestrzeni, odpowiednio dla każdej próbki. Aby przezwyciężyć ten problem, niezbędna jest prosta i zrozumiała instrukcja, która obejmuje wszystkie niezbędne kroki, wyjaśnia, w jaki sposób każdy krok można dostosować w zależności od próbki, i pokazuje szczegółowe przykłady z wielu próbek.
W niniejszym badaniu opisujemy krok po kroku protokół obrazowania mikrotomografią komputerową, od fiksacji próbki do analizy danych, na użyciu trzech gatunków morskich bezkręgowców. Okazy ukwiału Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) zostały zebrane w pobliżu Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo. Miały one kuliste, miękkie ciało o średnicy około 2 cm (ryc. 1A-C). Próbki Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) pobrano również w pobliżu Misaki Marine Biological Station. Były to smukłe robaki o długości około 1,5 cm, z twardymi chaetae obecnymi na całym ciele (<silna klasa="xfig">Ryc. 1D). Okaz Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) został zebrany w pobliżu Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, podczas 13th JAMBIO Coastal Organism Joint Survey. Był to robak o miękkim ciele, który miał około 0,8 cm długości (ryc. 1E). Szczegółowo wyjaśniono korekty dokonane dla warunków i konfiguracji każdej próbki. Nasze badanie zawiera kilka sugestii, jak wykonywać obrazowanie mikroCT na bezkręgowcach morskich i mamy nadzieję, że zainspiruje biologów do wykorzystania tego protokołu w swoich badaniach.

<table><tbody><tr><td>Kolba Erlenmeyera 250 ml</td><td>Corning</td><td>CLS430183</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Probówka do pobierania próbek ST-500</td><td>BIO-BIK</td><td>103010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka polipropylenowa</td><td>Greiner Bio One International</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>60 mm bez obróbki</td><td>IWAKI</td><td>1010-060</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka ekologiczna (niebieska) 1000 &mikro; l</td><td>BMBio</td><td>BIO1000RF</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>057-00451</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>061-00416</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>094-05421</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Przeglądarka OsiriX DICOM</td><td>Pixmeo SARL</td><td>OsiriX MD v10.0</td><td>https://www.osirix-viewer.com</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Igła Petiolate</td><td>AS ONE</td><td>2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta Pipetman P200</td><td>GILSON</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta Pipetman P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Jodek potasu</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>166-03971</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna 5</td><td>DUMONT</td><td>0302-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka QuickRack MultI fit (żółta) 200 ul</td><td>Sorenson</td><td>10660</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Feather</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta pierścieniowa</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania rentgenowskiego Micro-CT</td><td>Comscantechno</td><td>ScanXmate-E090S105</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microct) actinia equina (cnidaria), harmothoe sp. (annelida) i xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Tradycyjnie, biolodzy musieli polegać na destrukcyjnych metodach, takich jak sekcje, aby badać wewnętrzne struktury nieprzezroczystych organizmów. Nieniszczące obrazowanie rentgenowskiej tomografii komputerowej (microCT) z mikroogniskowaniem stało się potężnym i rozwijającym się protokołem w biologii, ze względu na postęp technologiczny w metodach barwienia próbek i innowacje w sprzęcie do mikrotomografii komputerowej, komputerach przetwarzających i oprogramowaniu do analizy danych. Jednak protokół ten nie jest powszechnie stosowany, jak ma to miejsce w medycynie i przemyśle. Jednym z powodów tego ograniczonego zastosowania jest brak prostej i zrozumiałej instrukcji, która obejmuje wszystkie niezbędne kroki: pobieranie próbek, utrwalanie, barwienie, montaż, skanowanie i analizę danych. Innym powodem jest ogromna różnorodność metazoanów, zwłaszcza bezkręgowców morskich. Ze względu na zróżnicowane rozmiary, morfologie i fizjologię bezkręgowców morskich, kluczowe znaczenie ma dostosowanie warunków eksperymentalnych i konfiguracji sprzętu na każdym etapie, w zależności od próbki. W tym miejscu szczegółowo wyjaśniono metody obrazowania mikrotomografii komputerowej na przykładzie trzech filogenetycznie zróżnicowanych bezkręgowców morskich: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Podano również sugestie dotyczące wykonywania obrazowania mikrotomografią komputerową u różnych zwierząt.

Wykonano obrazowanie mikrotomografią komputerową (microCT) na osobnikach A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) oraz X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) po ich barwieniu 25% roztworem Lugola. Barwienie skutecznie zwiększyło kontrast struktur wewnętrznych we wszystkich próbkach, umożliwiając obserwację miękkich tkanek wewnętrznych (Rycina 6). W połączeniu z wcześniejszymi doniesieniami6,<sup ...

Tutaj szczegółowo wyjaśnione są protokoły wykonywania obrazowania mikrofokusowego tomografii komputerowej (mikroCT) trzech morskich bezkręgowców. W tym badaniu opisano takie etapy, jak utrwalanie próbki, barwienie, montaż, skanowanie, rekonstrukcja obrazu i analiza danych. Podano również sugestie, w jaki sposób protokół może być dostosowany do różnych próbek.

Obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microCT) Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...

Mikrotomografia komputerowa nie jest szeroko stosowana u bezkręgowców morskich ze względu na ich różnorodność morfologiczną. Nasza metoda umożliwia łatwe mocowanie próbek pod dowolnym kątem dostosowanym do ich morfologii. Można go wykonać z typowych materiałów, takich jak woda, glina i probówki, a w razie potrzeby z próbkami o różnych kształtach, od długiego robaka po okrągłą kulę.Procedurę zademonstruje Akiteru Maeno, technik z Narodowego Instytutu Genetyki w Japonii. Na początek przygotuj 0,5% agarozy, rozpuszczając 500 miligramów agarozy w 100 mililitrach wody destylowanej w 250-mililitrowej kolbie stożkowej i umieść kolbę w kuchence mikrofalowej o mocy 800 watów, aby podgrzać około jednej do trzech minut. Schłodzić kolbę w temperaturze pokojowej.Aby zamontować duże próbki, które nie mieszczą się w niebieskiej końcówce mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, takie jak A.equina, najpierw umieść zabarwioną próbkę w 60-milimetrowym naczyniu z wodą destylowaną, aby zmyć nadmiar roztworu barwiącego z powierzchni. W 50-mililitrowej tubie delikatnie wlej pięć mililitrów 0,5% agarozy bez robienia bąbelków. Umieść rurkę na lodzie, aby stwardniała agaroza.Następnie dodaj 20 mililitrów 0,5% agarozy do probówki, umieść na lodzie, aż agaroza zacznie twardnieć, i użyj kleszczy, aby umieścić próbkę w agarozie. Dostosuj pozycję próbki tak, aby jej oś ciała była pionowa. Utwardź agarozę na lodzie.Umieść glinę na stoliku montażowym mikrotomografii komputerowej i ustaw 50-mililitrową rurkę na glinie. Aby zamontować małe próbki, które mieszczą się w niebieskiej końcówce mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, takie jak Harmothoe sp. i X.japonica, należy zdekantować zabarwioną próbkę do 60-milimetrowego naczynia bez użycia kleszczy.Za pomocą pęsety pierścieniowej delikatnie przenieś próbki do innego 60-milimetrowego naczynia wypełnionego wodą destylowaną, aby zmyć nadmiar roztworu barwiącego z powierzchni. Następnie narysuj 100 mikrolitrów 0,5% agarozy do niebieskiej końcówki mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów i umieść ją na lodzie, aby stwardniała. Podczas obchodzenia się z Harmothoe sp.Dodaj 1000 mikrolitrów 0,5% agarozy do korka agarozowego w końcówce. Użyj pęsety pierścieniowej, aby delikatnie przenieść Harmothoe sp. z 60-milimetrowej płytki do roztworu agarozy w końcówce.Za pomocą igły do ogonków liściowych lub precyzyjnej pęsety dostosuj pozycję i orientację Harmothoe sp., aby chaetae nie były nienaturalnie wygięte. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków, a następnie umieść końcówkę na lodzie, aby stwardniała agaroza.Podczas pracy z delikatnymi próbkami, takimi jak X.japonica, użyj mikropipety, aby dodać 1000 mikrolitrów wody destylowanej do niebieskiej końcówki z utwardzoną zatyczką agarozową. Umieść X.Japonica w wodzie destylowanej tak, aby był stabilny między ściankami końcówki. W przypadku mniejszych próbek można użyć żółtej końcówki do mikropipet o pojemności 200 mikrolitrów.W takim przypadku użyj 30 mikrolitrów agarozy do wtyczki i dodaj 200 mikrolitrów agarozy lub wody destylowanej. Następnie odetnij końcówkę od nowej, niebieskiej końcówki do mikropipet o pojemności 1000 mikrolitrów i włóż końcówkę zatkanej końcówki do nowej końcówki. Umieść glinę na stoliku montażowym mikrotomografii komputerowej i ustaw końcówki z próbką w środku na glinie.Natychmiast po zamontowaniu próbek włącz wiązkę promieniowania rentgenowskiego o napięciu 80 kilowoltów i 100 mikroamperach. Obserwując obraz transmisji promieniowania rentgenowskiego, przesuń stolik tak, aby cała próbka była widoczna, klikając przyciski osi x i z oraz ręcznie regulując pokrętło osi y na stoliku montażowym. Dostosuj warunki kontrastu obrazu, aby można było zaobserwować struktury wewnętrzne.Dostosuj orientację próbki, zmieniając kąt rurki w glinie. Obróć stolik o 90 stopni, ustawiając oś obrotu na 90 stopni i klikając przycisk Ruch względny. Wykonaj ten sam manewr cztery razy, aby wykonać pełny obrót.Wiązkę promieniowania rentgenowskiego należy ręcznie wyłączać za każdym razem, gdy drzwiczki próbki są otwierane, chyba że system wyłączy ją automatycznie. Teraz kliknij przycisk osi Z i ręcznie wyreguluj pokrętło osi Y, aby przesunąć stolik montażowy tak, aby próbka znalazła się w środku widoku. Obróć stolik o 90 stopni i ponownie ustaw próbkę do środka.Obróć stolik o 90 stopni jeszcze trzy razy i dostosuj w razie potrzeby, aby mieć pewność, że próbka znajduje się w środku view ze wszystkich kierunków. Następnie kliknij przycisk osi x, aby przesunąć stolik wzdłuż osi x w kierunku źródła wiązki promieniowania rentgenowskiego, aby powiększyć próbkę i dostosować w razie potrzeby, aby po prostu pasował do widoku. Obróć stolik i dostosuj go zgodnie z potrzebami, aby upewnić się, że próbka mieści się w widoku ze wszystkich kierunków.Dostosuj warunki skanowania, a następnie rozpocznij skanowanie. W tym eksperymencie wykonano obrazowanie mikrotomografią końską Actinia equina, Harmothoe sp. i Xenoturbella japonica po barwieniu 25% płynem Lugola.Barwienie z powodzeniem poprawiło kontrast struktur wewnętrznych we wszystkich próbkach, umożliwiając obserwację wewnętrznych tkanek miękkich. Metoda ta ma zastosowanie do delikatnych okazów nawet z uszkodzeniami zewnętrznymi, jak widać na przykładzie okazu X.japonica ze źle uszkodzonym naskórkiem. Pojedynczy zestaw danych o wysokiej rozdzielczości całego okazu został zrekonstruowany dla Harmothoe sp.i X.japonica z wielu skanów wykonanych na różnych, ale nakładających się na siebie częściach próbki. Upewnij się, że umieściłeś próbkę w probówce lub końcówce i zamontuj rurkę lub końcówkę w mikrotomografie komputerowym tak, aby nie poruszała się podczas skanowania. Dane uzyskane w wyniku tej procedury mogą być wykorzystane do rekonstrukcji obrazu 3D, umożliwiając badaczowi pełne zrozumienie zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej morfologii próbki.Wszystkie systemy mikrotomografii komputerowej wykorzystują promieniowanie rentgenowskie, ale specyfika może się różnić w zależności od systemu, dlatego należy ściśle przestrzegać instrukcji każdego systemu.

microfocus-x-ray-ct-microct-imaging-actinia-equina-cnidaria-harmothoe

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Wykorzystaliśmy synchrotronową tomografię rentgenowską w Europejskiej Instalacji Promieniowania Synchrotronowego (ESRF), aby nieinwazyjnie uzyskać trójwymiarowe zbiory danych tomograficznych o rozdzielczości piksela 0.7µm. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do renderowania objętościowego możliwe jest zrekonstruowanie struktur wewnętrznych w ich stanie naturalnym, bez artefaktów powstających podczas sekcjonowania histologicznego.

Nieinwazyjna wizualizacja 3D z rozdzielczością submikronową z wykorzystaniem synchrotronowej tomografii rentgenowskiej

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Źródło: Choi, J. P. et al. Obrazowanie indukcji i mikrotomografii komputerowej malformacji jamistych mózgu na modelu mysim. J. vis. exp. ( 2017)Ten film pokazuje zastosowanie obrazowania mikro-CT do wizualizacji zmian w malformacji jamistych mózgu (CCM) w mózgu myszy. Szczegółowo opisano w nim etapy przygotowania próbki, obrazowania i rekonstrukcji obrazu 3D w celu oceny gęstości i lokalizacji zmian CCM w tkance mózgowej.

Obrazowanie mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym zmian w malformacjach jamistych mózgu w mózgu myszy

Ten artykuł przedstawia metody używane do badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali szpatułki Atractosteus (A. szpatułka) za pomocą nanowgłębienia, spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (X-ray CT). Wyniki eksperymentów wykorzystano do zbadania zasad projektowania ochronnych materiałów biologicznych.

Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM

Zintegrowany zestaw technik obrazowania został zastosowany do określenia morfologii polipów i struktury tkanek u karaibskich koralowców Montastraeaannularis i M. faveolata. Fluorescencja, szeregowa powierzchnia blokowa i dwufotonowa konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa pozwoliły zidentyfikować strukturę płatów, ściany polipów oraz oszacować gęstości i rozkłady chromatoforów i zooksantelli.

Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Opracowaliśmy protokoły i zaprojektowaliśmy niestandardowe urządzenie, aby umożliwić osadzanie próbek w skali milimetrowej. Przedstawiamy procedury przygotowania próbek z naciskiem na zatapianie w rurkach z żywicy akrylowej i poliimidu w celu uzyskania sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania próbek w celu zbadania architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

Szybki fluorometr powtarzalności (FRRf) jest korzystną metodą pomiaru fotofizjologii II fotosystemu i produktywności pierwotnej. W tym miejscu opisujemy protokół pomiaru fotofizjologii PSII alg epizoicznych, Colacium sp. na zooplanktonie substratowym za pomocą FRRf typu kuwetowego.

Pomiar fotofizjologii dołączonego stadium Colacium sp. za pomocą fluorometru kuwetowego o dużej częstotliwości powtarzania

Micro-CT to nieniszczące narzędzie, które może analizować struktury roślin w trzech wymiarach. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbki w celu wykorzystania mikro-CT do analizy struktury i funkcji roślin pasożytniczych. Aby podkreślić zalety tej metody w połączeniu z określonymi preparatami, stosuje się różne gatunki.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem

Poznaj protokół microCT dla bezkręgowców morskich, w tym Actinia equina, Harmothoe sp. i Xenoturbella japonica. Metoda umożliwia obrazowanie różnorodnych morfologii przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów.

Obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microCT) Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha) (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej z mikroogniskowaniem (microCT) Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) i Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Przeglądaj więcej filmów