Name: Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metody obrazowania wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans. Techniki te pozwalają badać homeostazę wapnia i sprzężenie pobudzenia z skurczem w organizmie modelowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Alexandrowi Gottschalkowi za ZX1659, RCaMP i szczep rodopsyny kanałowej, Dr. Hongkyun Kimowi za szczep robaka slo-1(eg142) oraz National Bioresource Project za szczep robaka sca-1(tm5339).

1. Ustawienie mikroskopu
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu złożonego z możliwościami fluorescencji. Na potrzeby tego badania dane zebrano na mikroskopie pionowym (Tabela materiałów) wyposażonym w diody LED do wzbudzenia.</li>
	<li>Aby prawidłowo zobrazować zmiany fluorescencyjne w mięśniach ścian ciała, należy użyć obiektywu o dużym powiększeniu.
	<ol>
		<li>Do preparowania preparatów należy użyć obiektywu 60x NA 1.0 do zanurzenia w wodzie (tabela materiałów).</li>
		<li>Do preparatów z użyciem nanogranulek należy użyć obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 60x NA 1,4 (tabela materiałów). Takie powiększenie zapewnia wystarczającą rozdzielczość mięśni na matrycy aparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj kamery o wysokiej czułości dołączonej do mikroskopu, aby rejestrować obrazy z dużą liczbą klatek na sekundę w celu śledzenia szybkich zmian poziomu wapnia. Na potrzeby tego badania obraz za pomocą systemu sCMOS (Table of Materials) zdolnego do obrazowania pełnoklatkowego przy 100 Hz, ponieważ czasy narastania dla sygnałów Ca2+ mogą wynosić nawet kilkadziesiąt milisekund.</li>
	<li>Kontroluj akwizycję kamery i wzbudzenie fluorescencji LED za pomocą oprogramowania mikro-menedżera działającego w ImageJ10 zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj wtyczki platformy elektronicznej typu open source, która łączy zewnętrzną płytkę mikrokontrolera typu open source (tabela materiałów), aby zarządzać zewnętrznymi impulsami czasowymi w celu kontrolowania wzbudzenia fluorescencji. 
	UWAGA: Wyjścia cyfrowe są dostępne z pinów cyfrowych od 8 do 13 zapewniających bity wyjściowe od 0 do 5. Mogą one być adresowane jako wartości o podstawie 2 1, 10, 100 itd. Ustawienia portu szeregowego są wskazane w Tabeli 1 i dostępne na stronie internetowej mikro-menedżera (Tabela materiałów). Firmware dla płytki mikrokontrolera jest również dostępny na tej stronie internetowej.</li>
	<li>Aby sterować logiką taktowania, aktywuj protokół akwizycji mikromenedżera w oprogramowaniu zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów). 
	UWAGA: Spowoduje to jednoczesne zainicjowanie zaprogramowanego czasu trwania klatki kamery i liczby klatek, które mają być aktywowane, a także migawki logicznej i zaprogramowanej bursztynowej diody LED do wzbudzenia fluorescencyjnego. W tym przypadku pomarańczowy przełącznik półprzewodnikowy LED jest sterowany przez wyjście bitu 1 mikrokontrolera przez pin 9. Kamera wykadrowuje TTL (złącze back plate out 3), wyzwala stymulator. W ten sposób precyzyjnie synchronizowana jest aktywacja niebieskiego światła LED w celu aktywacji rodopsyny kanałowej w określonym czasie po aktywacji sekwencji obrazowania.</li>
	<li>Aby stymulować rodopsynę kanałową światłem niebieskim i rejestrować zmiany RCaMP, należy użyć dwóch diod LED. Aktywuj rodopsynę kanałową za pomocą diody LED o szczytowej długości fali emisji 470 nm i filtrze pasmowoprzepustowym (455 do 490 nm) i wzbudz RCaMP za pomocą diody LED o szczytowej długości fali emisji 594 nm i filtrze pasmowoprzepustowym (570 do 600 nm).</li>
	<li>Aby jednocześnie aktywować rodopsynę kanałową i uchwycić zmiany w poziomach fluorescencji RCaMP, należy współoświetlić obie diody LED i skierować światło na tę samą ścieżkę optyczną za pomocą dichroicznego sumatora wiązki.</li>
	<li>Kontroluj czas oświetlenia LED za pomocą przełączników półprzewodnikowych (tabela materiałów) sterowanych sygnałami TTL (maksymalny znamionowy czas włączenia, 1 ms, czas wyłączenia 0,3 ms: od 0 do 90% czas włączenia i wyłączenia < 100 μs).</li>
	<li>Ustaw intensywność diody LED za pomocą sterowanych prądem niskoszumowych zasilaczy liniowych (tabela materiałów).</li>
	<li>Aby zapewnić dokładny czas diody LED światła niebieskiego, aktywuj ją bezpośrednio impulsem TTL do przekaźnika półprzewodnikowego ze stymulatora. Zaprogramuj protokół stymulacji światłem niebieskim w stymulatorze (Tabela materiałów), który działa jak precyzyjny zegar od początku akwizycji obrazu do niebieskiego oświetlenia LED. W tym eksperymencie włącz stymulację światłem niebieskim po 2 sekundach od uchwycenia tylko fluorescencji RCaMP i użyj ciągu 5, 2 ms impulsów światła niebieskiego z interimpulsami 50 ms, aby aktywować rodopsynę kanałową. 
	UWAGA: Opóźnienie przed impulsami światła niebieskiego, czas trwania impulsów światła niebieskiego, czas między impulsami oraz liczba impulsów w pociągu mogą być ustawione w tym momencie i powinny odzwierciedlać określone parametry będące przedmiotem zainteresowania eksperymentalnego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki C. elegans i akwizycja danych
<ol>
	<li>Aby optycznie stymulować neurony presynaptyczne, uzyskaj zwierzęta wyrażające rodopsynę kanałową w pobudzających neuronach cholinergicznych, napędzanych regionem promotora unc-17 i RCaMP wyrażanego we wszystkich mięśniach ściany ciała napędzanych regionem promotora myo-3<klasa sup = "xref">2. 
	UWAGA: Zaleca się wyłącznie stosowanie zwierząt ze zintegrowanymi transgenami i solidnymi poziomami fluorescencji, ponieważ zmienna ekspresja w odpowiednich typach komórek może wpływać na wiarygodność pozyskiwania danych.</li>
	<li>Przygotować zapas roboczy z retinalu all-trans, rozcieńczając proszek siatkówki (tabela materiałów) w etanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C. Ten zapas roboczy będzie stabilny przez około rok.</li>
	<li>Stworzyć zapas OP50 E. coli, hodowany w pożywce LB, uzupełniony retinalem all-trans z materiału roboczego wykonanego w kroku 2.2, w końcowym stężeniu 80 μM. Objętość użyta do opaski siatkówkowej OP50+ będzie zależała od liczby płytek niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu.</li>
	<li>Pożywki nasienne z nicieni (NGM) należy umieścić na płytkach około 300 μl materiału siatkowego OP50+ i pozostawić płytki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Uprawiaj szczepy C. elegans do pożądanego wieku w ciemności na płytkach siatkówki OP50 + NGM w temperaturze 20 °C. Do tego eksperymentu użyj dorosłych robaków.
	<ol>
		<li>Do eksperymentu z użyciem wypreparowanego preparatu należy używać wyłącznie dorosłych robaków ciężarnych, ponieważ przeprowadzenie sekcji na młodszych, mniejszych zwierzętach jest niezwykle trudne. Pozostaw zwierzęta na płytkach siatkówkowych OP50 na co najmniej 3 dni, aby uzyskać skuteczną aktywację rodopsyny kanałowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli używasz preparowanego preparatu8,11 (Rysunek 1A), wykonuj sekcje w słabym świetle.
	<ol>
		<li>Umieść zwierzęta w naczyniu preparacyjnym z pokrytą silikonem podstawą szkiełka nakrywkowego, która jest wypełniona 1 mM Ca2+ roztworem zewnątrzkomórkowym składającym się ze 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM glukozy, 5 mM sacharozy i 15 mM HEPES (pH 7,3, -340 Osm).</li>
		<li>Przyklej zwierzęta za pomocą płynnego miejscowego kleju do skóry o niebieskim zabarwieniu wzdłuż grzbietowej strony robaka i wykonaj boczne nacięcie naskórka wzdłuż granicy kleju / robaka za pomocą szklanych igieł.</li>
		<li>Użyj pipety do ust, aby usunąć wewnętrzne wnętrzności z jamy robaka.</li>
		<li>Przyklej płat naskórka zwierzęcia, aby odsłonić brzuszne mięśnie przyśrodkowej ściany ciała do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku korzystania z preparatu z nanokulek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
	<ol>
		<li>Przygotować stopiony 5% roztwór agarozy za pomocą ddH2O do końcowej objętości 100 ml.</li>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura umieść kroplę stopionego roztworu agarozy na szkiełku podstawowym i natychmiast umieść drugie szklane szkiełko na górze, prostopadle do pierwszego, delikatnie naciskając, aby uzyskać równą podkładkę agarozową. Zdejmij górny suwak przed użyciem.</li>
		<li>Dodaj około 4 μl nanokulek polistyrenu (tabela materiałów) na środek podkładki agarozowej.</li>
		<li>W słabym świetle zbierz 4-6 C. elegans do roztworu nanokulek, upewniając się, że zwierzęta nie leżą jeden na drugim, i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść przygotowane szkiełko lub naczynie separacyjne na mikroskopie, a następnie znajdź robaka i ustaw na nim ostrość, korzystając z 10-krotnego powiększenia i słabego oświetlenia jasnego pola.</li>
	<li>Przełącz się na powiększenie 60x i wzbudzenie fluorescencyjne RCaMP, aby zidentyfikować mięsień brzuszno-przyśrodkowy ściany ciała, który znajduje się przed sromem i znajduje się we właściwej płaszczyźnie ogniskowej. 
	UWAGA: Mięśnie przednie do sromu są wybierane, ponieważ odzwierciedlają mięśnie powszechnie stymulowane w eksperymentach elektrofizjologicznych.</li>
	<li>Zmień ścieżkę obrazu od okularu do aparatu, pociągając przełącznik i klikając na żywo w oprogramowaniu do akwizycji danych (tabela materiałów). 
	UWAGA: Upewnij się, że szlak stymulacji światłem niebieskim jest w tym momencie wyłączony, aby upewnić się, że rodopsyna kanałowa nie zostanie aktywowana przed zrobieniem zdjęć.</li>
	<li>Ustaw ostrość obrazu w oprogramowaniu do akwizycji danych za pomocą precyzyjnej ostrości mikroskopu.</li>
	<li>Gdy mięsień jest wyraźnie ostry, wyłącz obraz na żywo, odznaczając przycisk Na żywo.</li>
	<li>Kliknij przycisk ROI w oprogramowaniu do akwizycji danych i utwórz ramkę wokół mięśnia, na którym się skupiasz.</li>
	<li>Na stymulatorze włącz ścieżkę stymulacji światłem niebieskim, która została wcześniej zaprogramowana w kroku 1.10.</li>
	<li>Kliknij przycisk Acquire (Pobieraj) w oprogramowaniu do obrazowania, aby przechwycić obraz za pomocą kamery CMOS. Aby to zrobić, ustaw czas naświetlania na 10 s z 1,000 klatek i 2x binningiem.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik danych w oprogramowaniu do obrazowania (Tabela materiałów) i za pomocą narzędzia Polygon Tool nakreśl interesujący Cię mięsień. To jest zwrot z inwestycji.</li>
	<li>Przejdź do obrazu | Stosy | Wykreśl profil osi Z i wyeksportuj wynikowe punkty danych do arkusza kalkulacyjnego (Tabela materiałów). Ta funkcja wykreśla średnią wartość wyboru ROI w funkcji punktu czasowego.</li>
	<li>Przesuń ROI mięśni utworzony za pomocą narzędzia Polygon na zewnątrz zwierzęcia, aby uzyskać pomiar fluorescencji tła, wykonując czynności opisane w 3.2. Wyeksportuj dane wynikowe do skoroszytu arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>W skoroszycie arkusza kalkulacyjnego odejmij wartości fluorescencji tła od wartości fluorescencji mięśni w każdym punkcie czasu. Zapewnia to odjęty sygnał fluorescencyjny tła.</li>
	<li>Uśrednij fluorescencję odjętą od tła dla pierwszych 2 s punktów danych. To da podstawowy pomiar fluorescencji, F.</li>
	<li>Użyj podstawowego pomiaru fluorescencji, aby obliczyć znormalizowany poziom fluorescencji w każdym punkcie czasowym. Aby to zrobić, użyj równania (ΔF/F)+1. ΔF oznacza (F(t)-F), gdzie F(t) jest pomiarem fluorescencji w dowolnym punkcie czasowym, a F jest wartością bazową. Wartość +1 jest dodawana jako odsunięcie osi y.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.6 dla każdego zebranego obrazu mięśnia. Użycie jednej lub wielu komórek mięśniowych na obrazie zależy od uznania badacza. N eksperymentu można wyznaczyć, wykonując analizę mocy.</li>
	<li>Korzystając z przetworzonych danych z kroków 3.2-3.6, należy narysować ślady wartości fluorescencyjnych w oprogramowaniu do tworzenia wykresów zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów).</li>
	<li>Na podstawie tego śladu zmierz kinetykę stanu przejściowego wapnia, taką jak czas narastania do szczytu i czas połowicznego zaniku, korzystając z narzędzi dostarczonych w oprogramowaniu do tworzenia wykresów zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+analysis+of+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li>
<li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li>
<li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+umanager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li>
<li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li>
<li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+isoforms+of+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+%28SERCA%29+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li>
<li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2%2B+ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li>
<li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium-ATPases+%28SERCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serca+pumps+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling+and+Disease%3A+Molecular+Pathology+of+Calcium%22%5BJournal%5D)">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li>
<li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA+pump+isoforms%3A+Their+role+in+calcium+transport+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li>
<li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle%3A+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li>
<li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li>
<li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li>
<li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li>
<li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+differentially+modulates+Ca2%2B+transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li>
<li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li>
<li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li>
<li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li>
<li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-type+voltage-dependent+Ca2%2Bchannel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li>
<li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

GECI są potężnym narzędziem w neurobiologii C. elegans. W poprzednich pracach wykorzystano techniki obrazowania wapnia do zbadania szerokiej gamy funkcji zarówno neuronów, jak i komórek mięśniowych, w tym reakcji sensorycznych i behawioralnych, przy użyciu różnych metod stymulacji. W niektórych badaniach stosowano bodźce chemiczne do wyzwalania stanów przejściowych wapnia w neuronach czuciowych ASH22,23 lub do indukowania fal wapniowych w mięśniach gardł...

Ten artykuł przedstawia metody obrazowania in vivo wapnia mięśni ścian ciała C. elegans przy użyciu optogenetycznej stymulacji neuronalnej. Sparowanie genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) w mięśniu ze światłem niebieskim wywołało depolaryzację neuronów i zapewnia system do wyraźnej obserwacji wywołanych postsynaptycznych stanów przejściowych wapnia. Pozwala to uniknąć stosowania stymulacji elektrycznej, co pozwala na nieinwazyjną analizę mutantów wpływających na postsynaptyczną dynamikę wapnia.
Jednofluoroforowe GECIs, takie jak GCaMP, używają pojedynczej cząsteczki białka fluorescencyjnego połączonej z domeną M13 kinazy łańcucha lekkiego miozyny na jej N-końcowym końcu i kalmoduliny (CaM) na C-końcu. Po związaniu wapnia, domena CaM, która ma wysokie powinowactwo do wapnia, ulega zmianie konformacyjnej, indukując późniejszą zmianę konformacyjną w białku fluorescencyjnym, prowadzącą do wzrostu intensywności fluorescencji1. Fluorescencja GCaMP jest wzbudzana przy długości fali 488 nm, co sprawia, że nie nadaje się do stosowania w połączeniu z rodopsyną kanałową, która ma podobną długość fali wzbudzenia 473 nm. Tak więc, aby połączyć pomiary wapnia ze stymulacją rodopsyny kanałowej, zielone białko fluorescencyjne GCaMP musi zostać zastąpione białkiem czerwonej fluorescencji, mRuby (RCaMP). Wykorzystanie RCaMP wyrażanego w mięśniach, w połączeniu z ekspresją rodopsyny kanałowej w cholinergicznym neuronie ruchowym, umożliwia badania w zespole nerwowo-mięśniowym robaka (NMJ) z jednoczesnym wykorzystaniem optogenetyki i obrazowania funkcjonalnego w obrębie tego samego zwierzęcia2.
Użycie rodopsyny kanałowej omija potrzebę elektrycznej stymulacji depolaryzacji połączeń nerwowo-mięśniowych C. elegans, co można osiągnąć tylko w preparatach preparowanych, co czyni tę technikę zarówno łatwiejszą do zastosowania, jak i bardziej precyzyjną przy celowaniu w konkretne tkanki. Na przykład rodopsyna kanałowa była wcześniej stosowana u C. elegans do odwracalnej aktywacji określonych neuronów, co prowadzi do silnej aktywacji neuronów pobudzających lub hamujących3,4. Zastosowanie depolaryzacji stymulowanej światłem pozwala również ominąć problem uszkodzenia neuronów spowodowanego bezpośrednią stymulacją elektryczną. Daje to możliwość zbadania wpływu wielu różnych protokołów stymulacji, w tym długotrwałych i powtarzanych stymulacji, na postsynaptyczną dynamikę wapnia4.
Przezroczystość C. elegans sprawia, że idealnie nadaje się do analizy funkcjonalnej obrazowania fluorescencyjnego. Jednak podczas stymulacji pobudzających neuronów acetylocholiny w NMJ, oczekuje się, że zwierzęta zareagują natychmiastowym skurczem mięśni4, co sprawia, że unieruchomienie robaków ma kluczowe znaczenie w wizualizacji dyskretnych zmian wapnia. Tradycyjnie, do paraliżowania zwierząt stosowano środki farmakologiczne. Jednym z takich leków jest lewamizol, cholinergiczny agonista receptora acetylocholiny5,6,7. Ponieważ lewamizol prowadzi do trwałej aktywacji podtypu receptorów mięśni pobudzających, odczynnik ten nie nadaje się do badania dynamiki wapnia w mięśniach. Działanie lewamizolu indukuje depolaryzację postsynaptyczną, podnosząc poziom cytozolowego wapnia i blokując obserwacje po stymulacji presynaptycznej. Aby uniknąć stosowania leków paraliżujących, zbadaliśmy dwie alternatywne metody unieruchamiania C. elegans. Zwierzęta były albo przyklejane, a następnie rozcinane, aby odsłonić mięśnie ściany ciała, podobnie jak w przypadku istniejącej metody elektrofizjologii C. elegans NMJ8, lub nanokulki były używane do unieruchamiania nienaruszonych zwierząt9. Obie procedury pozwoliły na powtarzalne pomiary spoczynkowych i wywołanych stanów przejściowych wapnia w mięśniach, które były łatwe do zmierzenia.
Metody opisane w tym artykule mogą być użyte do pomiaru wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i stanów przejściowych w postsynaptycznych komórkach mięśniowych ściany ciała u C. elegans. Podano przykłady danych, w których zastosowano dwie różne techniki unieruchomienia. Obie techniki wykorzystują optogenetykę do depolaryzacji komórek mięśniowych bez użycia stymulacji elektrycznej. Przykłady te pokazują wykonalność tej metody w ocenie mutacji, które wpływają na postsynaptyczne obchodzenie się z wapniem u robaków i wskazują na zalety i wady dwóch podejść do immobilizacji.

<table><tbody><tr><td>all-trans siatkówka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td>Niezbędny do wzbudzenia kanału rodopsyny</td></tr><tr><td>Bursztynowa dioda LED</td><td></td><td></td><td>Oświetlenie RCaMP</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>Mouser</td><td>782-A000066</td><td>Sterowanie oświetleniem fluorescencyjnym</td></tr><tr><td>Niebieska dioda LED</td><td></td><td></td><td>oświetlenie rodopsyny kanałowej</td></tr><tr><td>Mikroskop BX51WI</td><td>Olympus</td><td></td><td>Mikroskop złożony w stanie stałym</td></tr><tr><td>Sterowany prądem zasilacz liniowy o niskim poziomie szumów</td><td>Ametek</td><td>Sorenson</td><td>Kontroluje intensywność diod LED</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>Wavemetrics.com</td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>LUMFLN 60x woda NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Cel zanurzenia w wodzie dla preparowany preparat</td></tr><tr><td>Master-8 Stymulator</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td>Główny zegar do akwizycji obrazu i oświetlenia LED</td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td></td><td>micro-manager.org</td><td>Steruje akwizycją kamery i wzbudzeniem LED</td></tr> Microsoft <tr><td>Excel</td> Oprogramowanie <td>Microsoft</td><td></td><td>Spreadsheet</td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 CMOS kamera</td><td>pco.</td><td>4.2</td><td>Kamera szybkotnąca</td></tr><tr><td>PlanApo N 60x olej NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Obiektyw zanurzeniowy Oil do przygotowania nanokulek</td></tr><tr><td>Polybead microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876-15</td> Do przełączników półprzewodnikowych <td>do unieruchamiania ślimaków</td></tr><tr><td></td><td>Sensata Technologies</td><td>Crydom CMX100D6</td><td>Kontroluje czas oświetlenia LED</td></tr><tr><td>Szczep transgeniczny, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td>SY1627</td><td>Pobudzający kanał neuronalnyrodopsyna i mięśnie ściany ciała RCaMP eksprymująca linię robaka z mutantem allelu SERCA</td></tr><tr><td>Szczep transgeniczny, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td></td><td>Pobudzający kanał neuronalnyrodopsyna i mięśnie ściany ciała RCaMP eksprymujące linię robaka z aktywowanym wapniem allelem zmutowanego kanału potasowego BK</td></tr><tr><td>Szczep transgeniczny, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Gottschalk Lab</td><td>ZX1659</td><td>Pobudzający kanał neuronalnyrodopsyna i mięsień ściany ciała RCaMP wyrażający linię robaka</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała c. elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Organizm modelowy C. elegans dostarcza doskonałego systemu do wykonywania obrazowania wapnia in vivo. Jego przezroczysty korpus i możliwość manipulacji genetycznej pozwalają na ukierunkowaną ekspresję genetycznie kodowanych czujników wapnia. Protokół ten przedstawia zastosowanie tych czujników do obrazowania in vivo dynamiki wapnia w docelowych komórkach, w szczególności w mięśniach ścian ciała robaków. Wykorzystując koekspresję presynaptycznej rodopsyny kanałowej, stymulacja uwalniania acetylocholiny z pobudzających neuronów ruchowych może być indukowana za pomocą impulsów światła niebieskiego, co powoduje depolaryzację mięśni i powtarzalne zmiany w cytoplazmatycznym poziomie wapnia. Omówiono dwie techniki unieruchamiania robaków o różnym stopniu trudności. Porównanie tych technik pokazuje, że oba podejścia zachowują fizjologię połączenia nerwowo-mięśniowego i pozwalają na powtarzalne ilościowe oznaczanie stanów przejściowych wapnia. Łącząc optogenetykę i funkcjonalne obrazowanie wapnia, można ocenić zmiany w postsynaptycznym obchodzeniu się z wapniem i homeostazie w różnych zmutowanych tłach. Przedstawione dane potwierdzają obie techniki immobilizacji, a w szczególności badają rolę siatkowatej ATPazy wapniowej C. elegans i aktywowanego wapniem kanału potasowego BK aktywowanego wapniem w regulacji wapnia w ścianie ciała.

Technika ta służyła do oceny zmian u mutantów, u których przypuszczano zaburzenia gospodarki wapniowej lub depolaryzacji mięśni. Wizualizowano podstawowe poziomy fluorescencji oraz przejścia fluorescencyjne, a następnie oceniono spoczynkowe stężenie wapnia w cytozolu oraz kinetykę wapnia w mięśniach. Istotne jest, aby zwierzęta były hodowane na all-trans-retinalu przez co najmniej trzy dni w celu zapewnienia skutecznego wbudowania retinalu, co w konsekwencji aktywuje channelropsynę (<stro...

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Protokół ten zapewnia dwie metody mobilizacji C.Elegans do wykonania obrazowania in vivo wapnia mięśni ściany ciała. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania związane z homeostazą wapnia i jego obsługą oraz dostępną synapsą w genetycznie podatnym organizmie. Technika ta może zapewnić lepsze zrozumienie mechanizmów regulujących homeostazę wapnia w mięśniach, a zatem może być ważna w identyfikacji warunków lub szlaków molekularnych, które wpływają na sprzężenie skurczu wzbudzenia poprzez nieprawidłową regulację obiegu wapnia.Metody te mogą zapewnić wgląd w obszary badań, w tym między innymi neurobiologię, biologię rozwojową i biologię komórki. Techniki te można zaadaptować do badania różnych typów komórek i C.elegans, innych pokrewnych nicieni, a także larw filsafat. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, aby eksperymentator mógł zrozumieć technikę sekcji i był w stanie dokładnie ocenić stany przejściowe wapnia od prawidłowo unieruchomionych zwierząt.Zacznij od ustawienia mikroskopu do obrazowania fluorescencyjnego. Użyj naukowej kamery CMOS zdolnej do pełnoklatkowego obrazowania z częstotliwością 100 Hz, aby śledzić szybkie zmiany poziomu wapnia. Kontroluj akwiz

in-vivo-calcium-imaging-in-c-elegans-body-wall-muscles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Zgłoszono tutaj system do obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami. System ten pozwala naukowcom na wywoływanie niezlokalizowanych wibracji o dobrze kontrolowanych właściwościach przy przemieszczeniu w skali nano oraz na ilościowe określenie prądów wapniowych podczas reakcji C. elegans na wibracje.

Obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami

Kolce dendrytyczne są ważnymi cechami komórkowymi układu nerwowego. W tym miejscu opisano metody obrazowania na żywo służące do oceny struktury i funkcji kolców dendrytycznych u C. elegans. Podejścia te wspierają rozwój zmutowanych badań przesiewowych dla genów, które definiują kształt lub funkcję kolców dendrytycznych.

Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Poznaj metody obrazowania wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans. Techniki te pozwalają badać homeostazę wapnia i sprzężenie pobudzenia z skurczem w organizmie modelowym.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Przeglądaj więcej filmów