Name: Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu żółtego białka fluorescencyjnego Oznaczone p62 w strukturach indukowanych agresomami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Poznaj technikę FRAP do pomiaru ruchliwości białek w żywych komórkach ssaczych RAW264.7. Ten protokół umożliwia ilościową analizę dyfuzji białka p62 w strukturach agresomopodobnych, wspierając badania w biologii komórkowej i odkrywanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Sethowi Robii z Uniwersytetu Loyola w Chicago za jego cenne uwagi na temat tego manuskryptu. Praca ta została wsparta grantem NIH 1R01NS073967-01A1 dla Joanny C. Bakowskiej.

<ol><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li>
<li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li>
<li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual+%281st+ed%29%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).</li>
<li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li>
<li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li>
<li>Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747(2012).</li>
<li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+assays+%28FRAP+%26+FLIP%29+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696(2011).</li>
<li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+%28FRAP%29+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568(2011).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP%2C+FLIP%2C+FLAP%2C+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li>
<li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li>
<li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li>
<li>Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCentonze%2C+V+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Zapewniamy kompleksowy, praktyczny i prosty protokół krok po kroku do eksperymentów FRAP na żywych komórkach. W tym przypadku protokół został wykorzystany do pomiaru ruchliwości YFP-p62 w ALIS w makrofagach RAW264.7, ale można go zastosować do wielu systemów laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, które są obecnie dostępne. W przypadku każdego systemu mikroskopowego eksperymenty pilotażowe mają kluczowe znaczenie dla określenia optymalnych parametrów FRAP, w tym akwizycji, wybielacza i kontroli wielkości ROI, intensywności lasera do fotowybielania oraz akwizycji obrazu przed i po wybielaniu. Uzasadnione jest oczekiwanie, że optymalne parametry FRAP będą się różnić dla każdego genetycznie kodowanego białka fluorescencyjnego i linii komórkowej.
Ważne czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania eksperymentu FRAP, obejmują (a) osiągnięcie odpowiedniej głębokości wybielania, (b) zastosowanie krótkiego etapu wybielania, (c) pozostawienie wystarczającej ilości czasu po wybielaniu na zaobserwowanie pełnej funkcji regeneracji, (d) skuteczność fotowybielania, (e) cytotoksyczność przy powtarzającym się FRAP oraz (f) włączenie kontroli utraty fluorescencji z powodu wielokrotnego obrazowania. Zalecamy, aby głębokość wybielania, którą można obliczyć zgodnie z równaniem podanym w sekcji 3.3.1, wynosiła ≥9013. Gdy głębokość wybielacza wynosi <90, stopień odzysku fluorescencji po wybielaniu będzie niedoszacowany, a wartości If, MF i t1/2 będą nieprawidłowe. Chociaż czas trwania i intensywność impulsów laserowych wywołujących wybielanie może się różnić w zależności od eksperymentów FRAP, ważne jest, aby etap fotowybielania był krótki i znacznie szybszy niż funkcja odzyskiwania fluorescencji. Jeśli tak nie jest, podczas etapu wybielania może wystąpić znaczny odzysk fluorescencji. Przy długim czasie wybielania odzyskiwanie fluorescencji na etapie wybielania nie byłoby mierzone, co doprowadziłoby do nieprawidłowych pomiarów If, MF i t1/2. Ponadto, aby uzyskać prawidłowe wartości dla If, MF i t1/2, zwrot z inwestycji w akwizycję należy obserwować po wybielaniu, aż poziom fluorescencji w ROI wybielacza osiągnie plateau. Na przykład w naszych eksperymentach FRAP nie było różnicy między wartościami If, MF i t1/2, gdy zaobserwowaliśmy fluorescencję YFP-p62 w ROI wybielacza przez 32,2 minuty po wybielaniu w porównaniu z tym, gdy zaobserwowaliśmy YFP-p62 w ROI wybielacza przez 15,1 minuty po wybielaniu; W ten sposób doszliśmy do wniosku, że funkcja odzyskiwania osiągnęła plateau po 15,1 min po12 wybielaniu. Jeśli chodzi o skuteczność fotowybielania, fotowybielanie zwiększa się wraz z kwadratem współczynnika zoomu optycznego14. W związku z tym stosowanie soczewek o wysokim zoomie optycznym jest korzystne dla szybkiego fotowybielania, ale może powodować niepożądane fotowybielanie podczas akwizycji; te ostatnie można uwzględnić, obrazując kontrolny zwrot z inwestycji. Należy unikać wielokrotnego fotowybielania, ponieważ może ono prowadzić do wytwarzania cytotoksycznych reaktywnych form tlenu (ROS). Jednak stopień wytwarzania ROS w wyniku ekspozycji na laser o wysokiej intensywności jest niższy w przypadku genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych niż w przypadku fluoroforów chemicznych (np. przeciwciał fluorescencyjnych)15, a wygenerowane ROS są bardziej skłonne do reagowania w genetycznie kodowanym białku fluorescencyjnym niż w przypadku innych cząsteczek w komórce4. Oprócz zwiększonego prawdopodobieństwa wytworzenia cytotoksycznych RFT należy unikać wielokrotnego fotowybielania, ponieważ jest ono trudne do kontrolowania. Wreszcie, chociaż niska transmisja laserowa jest wykorzystywana do pozyskiwania wszystkich obrazów bez wybielacza, niezmiennie występuje pewne fotowybielanie, które należy kontrolować. Możliwe kontrole tego obejmują monitorowanie fluorescencji w kontrolnym ROI w ramach ROI akwizycji, uzyskiwanie obrazów kontrolnych w sąsiedniej niebielonej komórce oraz przeprowadzanie eksperymentów kontrolnych z identycznymi ustawieniami jak te używane w eksperymentach fotowybielania, ale bez zdarzenia fotowybielania.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) to technika mikroskopowa, która może być użyta do ilościowego określenia dynamiki białek w żywych komórkach1,2. Popularność FRAP wzrosła ze względu na powszechną komercyjną dostępność laserowych skaningowych mikroskopów konfokalnych o wysokiej rozdzielczości, szybkości i czułości oraz "tęczy" genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i żółte białko fluorescencyjne (YFP)3. Genetycznie kodowane białka fluorescencyjne są łączone z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić subkomórkową lokalizację białka będącego przedmiotem zainteresowania. W typowym eksperymencie FRAP fluorescencja w stanie ustalonym w obszarze zainteresowania akwizycji (ROI) w komórce jest obserwowana poprzez wielokrotne obrazowanie tego ROI za pomocą światła laserowego o niskiej intensywności. Następnie cząsteczki fluorescencyjne ulegają szybkiemu i nieodwracalnemu osłabieniu we wstępnie zdefiniowanym podzbiorze zwrotu z inwestycji w akwizycję, zwanym dalej zwrotem z inwestycji w wybielacz, przez krótką ekspozycję na światło laserowe o wysokiej intensywności. Ponieważ nowe niebielone białka z czasem uzupełniają wybielone białka, szybkość i intensywność odzyskiwania fluorescencji w zwrocie z inwestycji w wybielacz dostarcza informacji o ruchliwości białek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)4.
Nasze zainteresowanie określeniem ruchliwości białka wiążącego ubikwitynę p62 (znanego również jako sekwestosom-1) w strukturach indukowanych agresomologicznie (ALIS) w mysich makrofagach RAW264.7 po stymulacji lipopolisacharydem (LPS) skłoniło nas do przejrzenia literatury FRAP. Niestety, wiele z istniejących protokołów FRAP jest niekompletnych lub nadmiernie złożonych5,6,7,8,9. Niektóre z nich nie zawierają szczegółowych informacji na temat ustawień lasera, konfiguracji ścieżki wiązki i parametrów akwizycji obrazu5,6,7,8,9. Inni pominęli kluczowe szczegóły dotyczące analizy danych, takie jak sposób rozwiązania problemu dryfu zwrotu z inwestycji w wybielacz6,9 lub jak obliczyć ważne parametry odzyskiwania, w tym frakcję ruchomą (Mf), frakcję nieruchomą (If) i czas połowicznego czasu regeneracji (t1/2)5,7. Z drugiej strony, inni kładli zbyt duży nacisk na złożone wzory matematyczne używane do obliczania Mf, If i t1/25,6,8,9. Dlatego naszym celem jest zapewnienie kompleksowego, praktycznego i prostego protokołu krok po kroku do eksperymentów FRAP na żywych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Wysoki poziom glukozy (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>100 razy;</td></tr><tr><td>Plan-apochromatyczny 63&times;/1,40 Obiektyw olejowy</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td><td>4407629904000000</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>liniowy (MW 25 000)</td></tr><tr><td>RAW 264.7 mysie makrofagi</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu żółtego białka fluorescencyjnego oznaczone p62 w strukturach indukowanych agresomami

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) to technika mikroskopowa, która może być wykorzystana do ilościowego określenia ruchliwości białek w żywych komórkach. W typowym eksperymencie FRAP fluorescencję w stanie ustalonym obserwuje się poprzez wielokrotne obrazowanie światłem laserowym o niskiej intensywności. Następnie cząsteczki fluorescencyjne są szybko i nieodwracalnie osłabiane przez krótką ekspozycję na światło laserowe o dużej intensywności. Informacje o ruchliwości białek uzyskuje się poprzez monitorowanie odzyskiwania fluorescencji. Użyliśmy FRAP do określenia ruchliwości p62 w strukturach indukowanych agresomologicznie (ALIS) w mysich makrofagach po stymulacji lipopolisacharydem (LPS). Ponieważ wiele istniejących protokołów FRAP jest albo niekompletnych, albo złożonych, naszym celem było zapewnienie kompleksowego, praktycznego i prostego protokołu krok po kroku do eksperymentów FRAP na żywych komórkach. Tutaj opisujemy transfekcję makrofagów RAW264.7 z żółtym białkiem fluorescencyjnym-p62 (YFP-p62), indukcję ALIS poprzez wystawienie komórek na LPS oraz metodę krok po kroku do zbierania obrazów FRAP przed i po wybielaniu oraz analizy danych. Na koniec omawiamy ważne czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania eksperymentu FRAP.

Pokazane tutaj są wyniki typowego eksperymentu, w którym użyliśmy FRAP do zbadania stopnia ruchliwości p62 w ALIS w komórkach RAW264.7 traktowanych LPS przez 3-5 h12. Rysunek 3A pokazuje surowe dane uzyskane z ROI wybielacza, kontroli i tła po wyrównaniu stosu obrazów w celu skorygowania o małe ilości (&lt; ~3 μm) dryfu obrazu ALIS. Fluorescencja YFP-p62 w tym ALIS przed i po wybielaniu jest pokazana w <silna klasa="xfig">Rysunek 3E i dodatkowe wideo 1. Rysunek 3B pokazuje te dane po korekcie tła. Rysunek 3C pokazuje te dane po skorygowaniu o fluorescencję w kontrolnym ROI. Rysunek 3D pokazuje te dane znormalizowane do średniej fluorescencji 5 wartości prebleach w ROI wybielacza. Stopień wybielenia był wystarczający w tym eksperymencie (głębokość wybielania = 91,94). Fluorescencja YFP-p62 w tym ALIS rozwijała się powoli, ponieważ t1/2 = 128,27 s (2,14 min). YFP-p62 nie było w tym eksperymencie białkiem zbyt ruchliwym, ponieważ Mf = 21,97 i If = 78,03.</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Diagram komórki RAW264.7 i kroki do analizy obrazu po wyrównaniu obrazów FRAP w celu skorygowania dryfu obrazu ALIS. (A) Diagram komórki RAW264.7 przedstawiający kilka ALIS oraz ROI wybielacza, kontroli i tła w ramach ROI akwizycji. (B) Wyidealizowany obraz surowych danych FRAP uzyskanych w ROI wybielacza, kontroli i tła w panelu A. (C) Wyidealizowany wykres surowych danych FRAP, które zostały skorygowane w tle. (D) Wyidealizowany wykres skorygowanych w tle danych FRAP, które zostały znormalizowane do fluorescencji w kontrolnym ROI. (E) Wyidealizowany wykres znormalizowanych i skorygowanych w tle danych FRAP, które zostały znormalizowane do fluorescencji przed wybielaczem w ROI wybielacza. Skróty: Con = kontrola; BG = tło. Ten rysunek został zmodyfikowany z Rabut and Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Obrazy interfejsu użytkownika w oprogramowaniu AIM (Tabela materiałów) do wyboru lasera, konfiguracji ścieżki wiązki i parametrów akwizycji obrazu dla eksperymentów FRAP. (A) Ekran sterowania laserem pokazujący linie laserowe Argon/2, moc wyjściową i prąd używany w lampie. (B) Ekran sterowania konfiguracją pokazujący zastosowane ustawienia rozdzielacza wiązki i filtra emisji. (C) Ekran sterowania skanowaniem pokazujący ustawienie używane do akwizycji obrazu. (D) Ekran sterowania skanowaniem pokazujący otwór, wzmocnienie detektora, przesunięcie wzmacniacza, wzmocnienie wzmacniacza i ustawienia transmisji dla linii laserowej Argon/2 514 nm. (E) Ekran sterowania szeregami czasowymi przedstawiający używane ustawienia szeregów czasowych. (F) Ekran kontroli wybielacza pokazujący użyte parametry przed i po wybielaniu. Skróty: HFT = Haupt Farb Teiler (główny rozdzielacz wiązki dichroicznej); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (pierwszy wtórny rozdzielacz wiązki dichroicznej); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (drugi wtórny rozdzielacz wiązki dichroicznej); EF = filtr emisji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Reprezentatywny eksperyment FRAP do badania dynamiki YFP-p62 w ALIS w komórkach RAW264.7. (A) Surowe dane dotyczące intensywności fluorescencji dla zwrotu z inwestycji w wybielacz, kontrolę i tło. (B) Dane podane w panelu A po roi wybielacza i kontroli zostały skorygowane o fluorescencję w ROI w tle. (C) Dane podane w panelach A i B po znormalizowaniu intensywności fluorescencji w ROI wybielacza w celu uwzględnienia fluorescencji w kontrolnym ROI skorygowanym w tle. (D) Dane podane w panelach A-C po znormalizowaniu intensywności fluorescencji w znormalizowanym i skorygowanym tle ROI wybielacza do średniej z pierwszych 5 wartości preblefu w ROI wybielacza. Mf = 21,97, If = 78,03, t1/2 = 128,27 s (2,14 min), a głębokość wybielania = 91,94. (E) Obraz ALIS przed wybielaniem (1,5 min) i po wybielaniu (0, 6 i 16 min). Podziałka = 5 μm i obowiązuje dla wszystkich paneli. Skróty: Con = kontrola; BG = tło; Corr. = poprawiony; Norm. = znormalizowany; Średnia = średnia. Ten rysunek został zmodyfikowany z Cabe et al.12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dodatkowe wideo 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> 
Film uzupełniający 1: Typowy ALIS w makrofagu RAW264.7 przed i po fotowybielaniu. Fluorescencja YFP-p62 powoli wraca do normy po fotowybielaczu; W związku z tym p62 nie jest białkiem bardzo ruchliwym. W tym eksperymencie Mf = 25,62, If = 74,38, t1/2 = 442,79 s (7,38 min), a głębokość wybielania = 90,19. Podziałka = 5 μm. Ten film został zmodyfikowany z Cabe et al.12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>

Opisujemy kompleksowy i praktyczny protokół odzyskiwania fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem na żywych komórkach. Chociaż protokół został wykorzystany do pomiaru ruchliwości p62 znakowanego żółtym białkiem fluorescencyjnym w strukturach indukowanych agresomem, można go zastosować do różnych systemów mikroskopowych i białek fluorescencyjnych.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu żółtego białka fluorescencyjnego Oznaczone p62 w strukturach indukowanych agresomami

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Istniejące protokoły FRAP dotyczące odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu są albo niekompletne, albo zbyt złożone. Protokół przedstawiony w tym filmie jest znaczący, ponieważ jest wszechstronny, praktyczny i prosty. Główną zaletą tej techniki FRAP jest to, że pozwala ona na ilościowe określenie ruchliwości białek w obrębie i między przedziałami subkomórkowymi w żywych komórkach.FRAP jest badany zarówno w celach terapeutycznych, jak i diagnostycznych. Jednym z takich zastosowań jest ilościowe określenie dyfuzji w systemach dostarczania leków w różnych tkankach in vivo. Informacje te mogą być wykorzystane do optymalizacji struktury i składu leku.Technika mikroskopii FRAP dostarczyła informacji w szerokim zakresie dziedzin, w których zrozumienie zjawiska dyfuzji jest interesujące. Należą do nich biologia komórkowa i molekularna, biologia rozwojowa, neuronauka, materiałoznawstwo, zaawansowane biomateriały i odkrywanie leków. Chociaż opisany protokół jest przeznaczony do użytku z komórkami ssaków, koncepcje można zastosować do innych systemów, takich jak komórki roślinne, komórki drożdży i bakterie.Osoba, która nigdy nie stosowała tej techniki, może mieć trudności z określeniem optymalnych parametrów akwizycji obrazu, stworzeniem obszaru zainteresowania akwizycją, który jest odpowiedni dla jej eksperymentu, oraz obliczeniem ruchomej frakcji i połowy czasu rekonwalescencji. Próbując wykonać tę procedurę po raz pierwszy, należy wykonać kilka eksperymentów pilotażowych, aby zoptymalizować protokół w kontekście celów eksperymentu. Procedurę zademonstrują Maleen Cabe, technik z mojego laboratorium, oraz David Rademacher, kierownik głównego zakładu obrazowania.Na początek przygotuj płytkę z transfekowanymi RAW264.7 makrofagami YFP-p62 i potraktuj je lipopolisacharydem, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Następnie przepłucz potraktowane komórki lodowatym buforem Tyrode'a jeden raz. Następnie dodaj dwa mililitry buforu Tyrode'a uzupełnionego nokodazolem do płytki i pozwól płytkom inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut przed obrazowaniem i analizą FRAP.Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut przed obrazowaniem i analizą FRAP. W konfiguracji obrazowania wybierz linię 514 nanometrów lasera Argon/2, ponieważ marker fluorescencji ma szczytowe wzbudzenie przy 512 nanometrach i szczytową emisję przy 527 nanometrach. Następnie w oknie Laser Control kliknij Argon/2, 458, 477, 488, 514, a następnie kliknij przycisk Standby.Po odczekaniu około trzech minut, aż laser się rozgrzeje, kliknij przycisk Włącz. Następnie ustaw moc lasera na 100% i naciśnij Enter. Następnie ustaw transmisję linii laserowej na 5%Na mikroskopie przejdź do obiektywu olejowego Plan-Apochromat z 63-krotnym powiększeniem 1,40.Obejrzyj próbkę przez okular mikroskopu i umieść indukowaną strukturę podobną do aggresomu w środku pola widzenia. Następnie w oprogramowaniu do akwizycji ustaw rozmiar klatki na 512 na 512 pikseli, prędkość skanowania na osiem, a głębię danych na 12 bitów. Ustaw również średnią skanowania na jeden, powiększenie optyczne na trzy i naciśnij Enter.Następnie ustaw otwór na 1,95 jednostki błędu i wzmocnienie detektora na 582, czyli tuż poniżej nasycenia. Utwórz obszar zainteresowania w kształcie kwadratu do akwizycji obrazu o wymiarach 150 na 150 pikseli. Ustaw szeregi czasowe w taki sposób, aby obszar zainteresowania był skanowany 35 razy, raz na 30 sekund.Następnie ustaw kontrolkę wybielacza w taki sposób, aby fotowybielanie nastąpiło po skanowaniu numer pięć, aby zebrać pięć obrazów przed wybielaniem obszaru zainteresowania. Naciśnij Enter, aby potwierdzić. Następnie przejdź do okna Bleach Regions i utwórz interesujący obszar wybielania w kształcie koła w obszarze struktury indukowanej aggresomem o średnicy 10 pikseli.Teraz ustaw liczbę iteracji na 300 i ponownie naciśnij Enter. Następnie ustaw linię lasera na 100% mocy i wprowadź 100 w polu procentu transmisji dla lasera i naciśnij Enter. Na koniec uruchom program do akwizycji obrazu, aby zebrać dane FRAP z 10 indukowanych agresomów struktur w 10 komórkach o dryfcie mniejszym niż około trzech mikronów.Aby rozpocząć analizę danych, najpierw prześlij pliki AIM lsm do komputera osobistego w celu analizy danych. Korygowanie dryfu obrazu przez wyrównanie lub dopasowanie stosu obrazów szeregów czasowych obszaru zainteresowania akwizycji przez otwarcie każdego pliku AIM lsm za pomocą programu do przetwarzania obrazów. Następnie wybierz Wtyczki, Rejestracja, StackReg i Tłumaczenie, a następnie wybierz Wtyczki, Rejestracja, StackReg, a następnie Sztywna treść.Następnie skonfiguruj menedżera regionu zainteresowania, aby zmierzyć intensywność sygnału w obszarze wybielacza. W tym celu wybierz narzędzie do owalu, a następnie narysuj okrąg w obszarze wybielania o średnicy 10 pikseli, a następnie kliknij przycisk Dodaj. Po dodaniu skonfiguruj program do pomiaru intensywności sygnału w obszarze kontrolnym zainteresowania.Wybierz narzędzie prostokąta, a następnie narysuj kwadrat o wymiarach 20 na 20 pikseli w obszarze sterowania i kliknij przycisk Dodaj. Na koniec skonfiguruj menedżera regionu zainteresowania, aby mierzyć intensywność sygnału w obszarze zainteresowania w tle. Wybierz narzędzie prostokąta, narysuj kwadrat o wymiarach 20 na 20 pikseli w obszarze tła, a następnie kliknij przycisk Dodaj.Po dodaniu regionów do analizy w Menedżerze ROI zmień ich nazwy odpowiednio na ROI Bleach, ROI Control i ROI w tle. Zmierz natężenie sygnału w każdym regionie. Aby to osiągnąć, wybierz opcję Bleach ROI, Control ROI i Background ROI, a następnie przejdź do pozycji Więcej i wybierz opcję Multi Measure.Wklej wyniki do arkusza kalkulacyjnego w kolumnach oznaczonych odpowiednio Bleach ROI, Control ROI i Background ROI. Zacznij od skorygowania w tle intensywności sygnału w ROI Bleach i ROI Control, odejmując wartości w kolumnie oznaczonej Zwrot z inwestycji w tle od wartości w kolumnie oznaczonej Bleach ROI i kolumnie oznaczonej Control ROI. Oznacz te nowe kolumny jako Skorygowany zwrot z inwestycji w wybielacz i Skorygowany zwrot z inwestycji w kontrolę.Następnie znormalizuj sygnał w Bleach ROI do sygnału skorygowanego w tle w Control ROI. Podziel wartości w kolumnie oznaczonej Skorygowany zwrot z inwestycji w wybielacz przez wartości w kolumnie oznaczonej Skorygowany zwrot z inwestycji w kontrolę. Oznacz tę nową kolumnę jako Znormalizowany poprawiony zwrot z inwestycji w wybielacz.Następnie znormalizuj sygnał w kolumnie Znormalizowany skorygowany zwrot z inwestycji w wybielacz do średniej z pięciu wartości prebleach w ROI wybielacza. Podziel wartości w kolumnie oznaczonej Znormalizowany skorygowany zwrot z inwestycji w wybielacz przez średnią z pięciu wartości prebleach w ROI wybielacza. Oznacz tę nową kolumnę jako Znormalizowany skorygowany średni zwrot z inwestycji w wybielacz.Na koniec otwórz program do przetwarzania obrazu. Dopasuj krzywą do znormalizowanych i skorygowanych danych zwrotu z inwestycji w wybielacz, kopiując znormalizowane skorygowane wartości zwrotu z inwestycji po wybielaniu i odpowiadające im wartości czasu. Wklej je do okna Curve Fitter, wybierz opcję Wykładnicze odzyskiwanie z menu rozwijanego Curve Fitter i wybierz opcję Dopasuj.Pokazano tutaj typowy film przedstawiający odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu komórek RAW264.7 poddanych działaniu LPS. Odzyskiwanie fluorescencji w obszarze struktury indukowanej agresomem jest powolne. W tym eksperymencie wykorzystano fotowybielanie do zbadania stopnia ruchliwości p62.Fluorescencja p62 w strukturach indukowanych agresomami, przed wybielaniem i po wybielaniu, jest pokazana tutaj. Jak opisano w tym filmie, intensywność fluorescencji można śledzić w czasie. Po korekcji i normalizacji tła fluorescencję p62 można obliczyć, aby opisać frakcję ruchomą jako 22%, frakcję nieruchomą jako 78% i opisuje okres połowicznego powrotu do zdrowia w strukturach indukowanych agresomem jako 2,14 minuty.Należy pamiętać, że szczególnie ważne jest prawidłowe zdefiniowanie obszaru zainteresowania nabycia, tak aby zawierał on ALIS będący przedmiotem zainteresowania, kontrolny obszar zainteresowania i tło obszaru zainteresowania. Po tej procedurze można zastosować inne ilościowe techniki mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak utrata fluorescencji w fotowybielaniu, FLIP i selektywne fotowybielanie. Podczas gdy FLIP mierzy stopień ciągłości i komunikacji między przedziałami subkomórkowymi, selektywne fotowybielanie dostarcza informacji kinetycznych na temat aktywnego i biernego transportu białek do organelli lub między obszarami bogatymi w białko.FRAP został początkowo opracowany w celu ilościowego określenia bocznego ruchu białek w błonach komórkowych. Następnie wykorzystano go do ilościowego określenia mobilności białek w obrębie różnych przedziałów subkomórkowych i między nimi, co utorowało naukowcom drogę do odpowiedzi na pytania z różnych dziedzin, w tym biologii komórkowej i molekularnej, biologii rozwojowej, neuronauki, materiałoznawstwa, zaawansowanych biomateriałów i odkrywania leków.

fluorescence-recovery-after-photobleaching-yellow-fluorescent-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda FRAP była wykorzystywana do ilościowego określania mobilności białek znakowanych zieloną białko fluorescencyjnym (GFP) w hodowlach komórkowych. Zbadaliśmy frakcje mobilne i niemobilne GFP, analizując procent odzysku fluorescencji po fotowybielaniu. W niniejszym badaniu FRAP przeprowadzono w kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Ten film demonstruje obrazowanie i kwantyfikację agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila. Mózgi są naprawiane, myte i traktowane środkiem zapobiegającym blaknięciu przed zamontowaniem. Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i oznaczane ilościowo w celu obserwacji transmisji zmutowanych agregatów białkowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Poznaj technikę FRAP do pomiaru ruchliwości białek w żywych komórkach ssaczych RAW264.7. Ten protokół umożliwia ilościową analizę dyfuzji białka p62 w strukturach agresomopodobnych, wspierając badania w biologii komórkowej i odkrywanie leków.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu żółtego białka fluorescencyjnego Oznaczone p62 w strukturach indukowanych agresomami (Wideo) | JoVE Journal

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu żółtego białka fluorescencyjnego Oznaczone p62 w strukturach indukowanych agresomami

Przeglądaj więcej filmów