Przejściowa ekspresja w buraka ćwikłowym biofarmaceutycznej szczepionki kandydackiej przeciwko cukrzycy typu 1

Spośród różnych strategii produkcji rekombinowanego białka w roślinach, zdekonstruowana ekspresja VERS na bazie roślin zapewnia doskonałą wydajność, prowadząc do wysokich plonów w stosunkowo krótkim czasie. Powtórzenie tej technologii w celu produkcji szczepionki doustnej ma ogromny potencjał, aby w niedalekiej przyszłości stać się alternatywą dla konwencjonalnych szczepionek. Liofilizowane liście buraka ćwikłowego przejściowo przekształcają się w ilość fotoantygenów odpowiednich do indukcji tolerancji doustnej w profilaktyce cukrzycy typu pierwszego.

Ten protokół eksperymentalny może zostać rozszerzony na wiele różnych gatunków jadalnych po indywidualnej ocenie akumulacji białek rekombinowanych. Procedurę zademonstrują Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo i Roberta Zampieri. Aby rozpocząć tę procedurę, uprawiaj buraka ćwikłowego i szpinak w komorze wzrostowej, jak opisano w protokole tekstowym.

Po wykiełkowaniu nasion rośliny nawozić dwa razy w tygodniu roztworem dostępnego w handlu nawozu w stężeniu jednego grama na litr. Do agroinfiltracji użyj pięciotygodniowego szpinaku i sześciotygodniowych buraków ćwikłowych. Po skonstruowaniu roślinnych wektorów ekspresyjnych należy zaszczepić trzy transformanty A.tumefaciens w 50 mililitrach pożywki LB zawierającej ryfampicynę w stężeniu 50 mikrogramów na mililitr i antybiotyki specyficzne dla wektora, jak opisano w protokole tekstowym.

Rosną przez potrząsanie przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnego dnia osadzaj kultury bakteryjne przez odwirowanie w temperaturze 4500 razy G przez 20 minut. Zawiesić osad w 100 mililitrach buforu infiltracyjnego zawierającego 10 milimolowy MES i 10-milimolowy siarczan magnezu.

Inkubować zawiesiny w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Wymieszać równą objętość zawiesiny bakteryjnej zawierającej jeden z pokazanych tutaj modułów z pięcioma modułami głównymi i modułem integrazy. Za pomocą strzykawki bez igły pobrać pięć mililitrów mieszaniny zawiesiny.

Dociśnij końcówkę strzykawki do spodniej strony liścia rośliny, jednocześnie delikatnie wywierając przeciwny nacisk na drugą stronę liścia. Naciekaj pierwsze trzy całkowicie rozwinięte liście, zaczynając od wierzchołka, dla każdej rośliny. Oznacz liście przesączone przez agroinfiltrację papierową etykietą na łodydze liścia.

Następnie włóż rośliny z powrotem do komory wzrostowej w standardowych warunkach. W dniach od czwartego do 14 po infekcji zbierz agroinfiltrowane liście i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowuj tę tkankę roślinną w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po pierwsze, oddzielnie hoduj trzy transformanty A.tumefaciens w 50 mililitrach pożywki LB zawierającej ryfampicynę w stężeniu 50 mikrolitrów na mililitr i odpowiednie antybiotyki specyficzne dla wektora, wstrząsając przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnego dnia osadzaj kultury bakteryjne przez odwirowanie w temperaturze 4500 razy G przez 20 minut. Zawiesić osad w 1 litrze buforu infiltracyjnego do OD600 0,35 i inkubować zawiesiny w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.

Następnie dodaj 0,01% detergentu do każdej zawiesiny. Zmieszać równą objętość zawiesiny bakteryjnej zawierającej jeden z pokazanych tutaj modułów z pięcioma modułami głównymi i modułem integrazy. Włożyć jedną sześciotygodniową sadzonkę buraka ćwikłowego do uchwytu.

Odwrócić uchwyt i umieścić go na zlewce zawierającej dwa litry kąpieli infiltracyjnej, aby zanurzyć liście w zawiesinie infiltracyjnej. Następnie przenieś kąpiel infiltracyjną z zanurzoną rośliną do komory infiltracyjnej i zamknij ją. Włączyć pompę próżniową i otworzyć zawór wlotu podciśnienia w komorze rozsączającej.

Gdy ciśnienie w komorze spadnie do 90 milibarów, utrzymuj próżnię przez trzy minuty. Następnie zwolnij odkurzacz na 45 sekund. Gdy komora powróci do ciśnienia atmosferycznego, otwórz komorę i usuń naciekającą roślinę z kąpieli bakteryjnej.

Zwróć roślinę do komory wzrostowej. W dniu maksymalnej ekspresji należy zebrać naciekane liście i zamrozić je w ciekłym azocie, jak opisano wcześniej. Najpierw zbierz próżniowo przesiąknięty delta 87 GAD65mut wyrażający liście buraka ćwikłowego w szczycie ekspresji i zamroź je w ciekłym azocie.

Liofilizuj zamrożone liście w temperaturze minus 50 stopni Celsjusza i 0,04 milibara przez 72 godziny. Następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, zmiel liście na drobny proszek i przechowuj w temperaturze pokojowej w szczelnie zamkniętym pojemniku z żelem krzemionkowym, aby wykluczyć wilgoć.

Aby przeprowadzić symulację trawienia żołądka, zważ 100 miligramów drobno zmielonych liofilizowanych liści buraka ćwikłowego i umieść je ponownie w sześciu mililitrach PBS. Użyj sześciomolowego kwasu solnego, aby dostosować pH próbki do dwóch. Dodaj cztery miligramy na mililitr pepsyny z błony śluzowej żołądka świń i 10 milimolowy kwas solny, aby uzyskać końcowe stężenie pepsyny wynoszące jeden miligram na mililitr.

Potrząsać próbką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 120 minut. Następnie użyj wodorotlenku sodu, aby dostosować pH próbki do ośmiu i dezaktywować pepsynę. Przenieść 750 mikrolitrów podwielokrotności każdej próbki do probówek do mikrowirówek i odwirować podwielokrotności w temperaturze 20 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Zebrać każdy supernatant oddzielnie i ponownie zawiesić każdy osad w jednej objętości supernatantu bufora ładującego. Następnie przeanalizować zarówno supernatant, jak i zawieszony osad za pomocą analizy Western blot. Do analizy integralności komórek należy przygotować dwie próbki po 100 miligramów drobno zmielonych liofilizowanych liści buraka ćwikłowego i ponownie zawiesić je w sześciu mililitrach PBS.

Użyj sześciomolowego kwasu solnego, aby dostosować pH jednej próbki do dwóch. Wstrząsać obiema próbkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 120 minut. Następnie porcjować 750 mikrolitrów każdej próbki do probówek mikrowirówek.

Wirować w temperaturze 20 000 razy G i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 20 minut. Zebrać każdy supernatant oddzielnie i ponownie zawiesić każdy osad w jednej objętości supernatantu bufora ładującego. Następnie przeanalizować zarówno supernatant, jak i zawieszony osad za pomocą analizy Western blot.

Najpierw zważ 100 miligramów drobno zmielonych liofilizowanych liści buraka ćwikłowego i ponownie zawieś je w ośmiu mililitrach sterylnego PBS. Wiruj przez jedną minutę. Umieść jeden mililitr każdego liofilizowanego homogenatu liściowego w jednym z pięciu przygotowanych selektywnych pożywek LB.

Inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy dni. Następnie policz kolonie agrobacterium wyhodowane na każdej płytce i oblicz resztkowy ładunek bakteryjny jako liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr liofilizowanego homogenatu liści. W tej pracy opracowano doustną szczepionkę w jadalnej tkance roślinnej.

Rośliny buraka ćwikłowego i szpinaku są ręcznie agroinfiltrowane zawiesinami A. tumefaciens przenoszącymi rekombinowane wektory ekspresyjne EGFP, a ekspresja białek fluorescencyjnych jest wizualizowana za pomocą analizy Western blot i oznaczana ilościowo w świetle UV. System buraka ćwikłowego charakteryzuje się wyższą ekspresją EGFP, osiągającą około 544 mikrogramy na gram masy świeżych liści po dziewięciu dniach od zakażenia, podczas gdy szpinak osiągnął maksymalny poziom około 113,4 mikrogramów na gram masy świeżych liści dopiero 11 dni po zakażeniu. Z tego powodu burak ćwikłowy jest wybierany jako gospodarz wyrażenia we wszystkich kolejnych eksperymentach.

Rośliny są następnie infiltrowane próżniowo za pomocą zawiesiny A.tumefaciens. Po ekstrakcji TSP z liści agroinfiltracji próbki są analizowane za pomocą Western blot, a rekombinowane białko jest względnie oznaczane ilościowo za pomocą analizy densytometrycznej. Na koniec oceniane są parametry potrzebne do opracowania potencjalnej szczepionki doustnej.

Jak widać tutaj, białko docelowe jest stabilne po procesie liofilizacji. Trawienie żołądka symuluje się poprzez dodanie enzymu żołądkowego pepsyny świńskiej do liofilizowanego materiału, do końcowego stężenia jednego miligrama na mililitr lub w stosunku jeden do 20 do TSP. Oba warunki leczenia trawiennego powodują degradację rekombinowanego białka.

Brak specyficznego sygnału w próbkach granulek po trawieniu pepsyny sugeruje, że po liofilizacji komórki roślinne utraciły swoją integralność, a to doprowadziło do degradacji białka docelowego. Procedura powinna być starannie dostosowana do gatunku rośliny pod względem infiltracji próżniowej oraz do docelowego białka rekombinowanego pod względem analizy przebiegu w czasie. Procedura demonstracyjna może być również wykorzystana do produkcji biofarmaceutyków przeznaczonych do podawania doustnego, takich jak szczepionka i przeciwciała.