Name: Identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj techniki immunoperoksydazy i immunofluorescencji do lokalizacji oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych Danio rerio. Ta metoda pozwala badać zmiany ekspresji białek w warunkach patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, University of Sannio.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przygotowanie próbki
Przygotowanie próbki jest pierwszym krytycznym krokiem w IHC. Niezawodny protokół pozwala na utrzymanie morfologii komórek, architektury tkanek i antygenowości. Ten etap wymaga prawidłowego pobrania, utrwalenia i przekroju tkanek22,23. Celem utrwalenia jest zachowanie tkanki i zmniejszenie działania enzymów tkankowych lub mikroorganizmów. W szczególności etap utrwalania zachowuje składniki k...

Immunohistochemia (IHC) jest dobrze znaną klasyczną techniką używaną do identyfikacji składników komórkowych lub tkankowych (antygenów) poprzez interakcję antygen-przeciwciało1,2. Może być używany do identyfikacji lokalizacji i rozmieszczenia docelowych biomolekuł w tkance. IHC wykorzystuje reakcje immunologiczne i chemiczne do wykrywania antygenów w skrawkach tkanki3. Głównymi markerami używanymi do wizualizacji interakcji antygen-przeciwciało są barwniki fluorescencyjne (immunofluorescencja) i reakcje barwne enzyma-substrat (immunoperoksydaza), oba sprzężone z przeciwciałami4. Za pomocą obserwacji mikroskopowej możliwe jest określenie lokalizacji znakowanej tkanki, która w przybliżeniu odpowiada lokalizacji docelowego antygenu w tkance.
Istnieją dwie metody wykrywania białek w reakcjach fluorescencyjnych lub chromogenicznych: metoda bezpośredniego wykrywania, w której specyficzne przeciwciało pierwszorzędowe jest bezpośrednio znakowane; oraz metoda wykrywania pośredniego, w której przeciwciało pierwszorzędowe jest niesprzężone, podczas gdy przeciwciało drugorzędowe nosi etykietę5,6,7. Metoda pośrednia ma pewne zalety, którymi jest przede wszystkim wzmocnienie sygnału. Ponadto, w przeciwieństwie do innych technik molekularnych i komórkowych, dzięki immunofluorescencji możliwe jest uwidocznienie dystrybucji, lokalizacji i koekspresji dwóch lub więcej białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach i tkankach7. Wybór zastosowanej metody wykrywania zależy od szczegółów eksperymentalnych.
Do tej pory IHC jest szeroko stosowany w badaniach podstawowych jako potężne i niezbędne narzędzie do zrozumienia dystrybucji i lokalizacji biomarkerów oraz ogólnego profilowania różnych białek w tkance biologicznej od człowieka do bezkręgowców8,9,10,11. Technika ta pomaga wyświetlić mapę ekspresji białek w dużej liczbie normalnych i zmienionych narządów zwierzęcych oraz różnych typów tkanek, pokazując możliwą regulację ekspresji w dół lub w górę wywołaną zmianami fizjologicznymi i patologicznymi. IHC to bardzo czuła technika, która wymaga dokładności i właściwego doboru metod w celu uzyskania optymalnych wyników12. Po pierwsze, wiele różnych czynników, takich jak fiksacja, reaktywność krzyżowa, pobieranie antygenu i wrażliwość przeciwciał, może prowadzić do fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych sygnałów13. Selekcja przeciwciał jest jednym z najważniejszych etapów IHC i zależy od swoistości antygenu oraz jego powinowactwa do badanego białka i gatunków7.
Ostatnio zoptymalizowaliśmy technikę IHC do wykrywania elementów systemów oreksyny/hipokretyny i endokannabinoidów w tkance dorosłego danio pręgowanego. Skupiliśmy się głównie na fiksacji, osadzaniu tkanek przy użyciu dwóch różnych podejść, sekcji i montażu (co może wpływać na rozdzielczość i szczegółowość podczas analizy mikroskopowej) oraz blokowaniu (aby zapobiec fałszywym alarmom i zmniejszyć tło)14. Inne ważne cechy to swoistość i selektywność przeciwciał oraz odtwarzalność poszczególnych protokołów IHC. Kluczem do zapewnienia swoistości przeciwciał jest zastosowanie kontroli ujemnych (w tym braku pierwszorzędowych przeciwciał lub tkanki, o której wiadomo, że nie wykazuje ekspresji białek docelowych), a także kontroli pozytywnych (w tym tkanki, o której wiadomo, że wyraża białka docelowe)15. Wybór przeciwciał do IHC jest dokonywany na podstawie ich specyficzności gatunkowej (prawdopodobieństwa, z jakim reagują z interesującym antygenem) oraz stosowanych systemów wykrywania wiązania antygen-przeciwciało4,5,6,7. W przypadku immunoperoksydazy o barwie reakcji decyduje dobór chromogenu wytrącającego się, zwykle diaminobenzydyny (brązowej)16. Z drugiej strony, i mmunofluorescencja wykorzystuje przeciwciała sprzężone z fluoroforem do wizualizacji ekspresji białek w zamrożonych skrawkach tkanek i pozwala na łatwą analizę wielu białek w odniesieniu do chromogennego systemu detekcji5,7.
W technice immunoperoksydazy, przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z biotyną, cząsteczką łącznikową zdolną do rekrutacji chromogennej cząsteczki reporterowej [kompleks awidyna-biotyna (ABC)], co prowadzi do wzmocnienia sygnału barwienia. W przypadku metody reporterowej ABC enzym peroksydaza reaguje z 3,3'-diaminobenzydyną (DAB), wytwarzając intensywnie brązowe zabarwienie, w którym enzym wiąże się z przeciwciałem drugorzędowym, które można następnie przeanalizować za pomocą zwykłego mikroskopu świetlnego. Barwienie ABC, ze względu na wysokie powinowactwo awidyny do biotyny, daje szybką i optymalną reakcję, z niewielką liczbą przeciwciał drugorzędowych przyłączonych do miejsca reaktywności przeciwciała pierwotnego. Ta metoda detekcji chromogennej pozwala na analizę densytometryczną sygnału, dostarczając danych półilościowych opartych na korelacji poziomów sygnału brązowego z poziomami ekspresji białek18.
Dzięki technikom immunofluorescencji, jednoczesne wykrywanie wielu białek jest możliwe dzięki zdolności różnych fluorochromów do emitowania światła na unikalnych długościach fal, ale ważne jest, aby wybierać fluorochromy ostrożnie, aby zminimalizować nakładanie się widm5. Co więcej, zastosowanie przeciwciał pierwszorzędowych u różnych gatunków gospodarzy minimalizuje trudności związane z reaktywnością krzyżową. W tym przypadku każde przeciwciało drugorzędowe specyficzne dla gatunku rozpoznaje tylko jeden typ przeciwciała pierwszorzędowego. Reportery fluorescencyjne to małe cząsteczki organiczne, w tym komercyjne pochodne, takie jak barwniki Alexa Fluor.
Wiele modeli zwierzęcych służy do zrozumienia szczególnych warunków fizjologicznych i patologicznych. Do tej pory ustalono, że wiele szlaków metabolicznych jest zachowanych w trakcie ewolucji. W związku z tym badania IHC na organizmach modelowych, takich jak danio pręgowany, mogą dostarczyć informacji na temat genezy i utrzymywania się stanów patologicznych i niepatologicznych17. Celem tego raportu jest zilustrowanie protokołów IHC, które można wykonać na tkance dorosłego zebry pręgowanego i wykorzystać do uzyskania szczegółowych obrazów rozmieszczenia i lokalizacji OXA, OX-2R i CB1R na poziomie peryferyjnym i centralnym. Opracowano również protokoły dotyczące stosowania dwóch głównych metod pośrednich IHC w tkankach obwodowych i centralnych dorosłych ryb danio pręgowanego. Opisano metodę pośrednią, która pozwala na amplifikację sygnału w przypadkach, gdy przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym (metoda immunofluorescencyjna) lub reporterem enzymu (metoda immunoperoksydazy). Zarówno metody detekcji chromogenicznej, jak i fluorescencyjnej mają swoje wady i zalety. W tym protokole opisano zastosowanie IHC, głównie immunofluorescencji, u dorosłego danio pręgowanego, modelu zwierzęcego szeroko stosowanego do badania systemów, które są ewolucyjnie konserwatywne w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Anti CB1</td><td>Abcam</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>Anti OX-2R</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-OXA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>Merck</td><td>1,085,620,050</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany królik anty-kozi</td><td>Vector Lab</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>kwas cytrynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Leica Biosystem</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>do mikroskopu konfokalnego</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty koza Alexa fluor 488-sprzężony wtórny przeciwciała</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe przeciw kozom osła Alexa fluor 594 sprzężone</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe przeciw ośłowi królikowi Alexa fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty królik Alexa fluor 594-sprzężone przeciwciała drugorzędowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>VWR</td><td>20,821,330</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka do sekcji mrożonych</td><td>Leica Biosystem</td><td>FSC 22 Sekcja mrożona Media</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20,252,290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT</td><td>DAB Vector lab</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Biosystem</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystem</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Normalne serum osła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Normalne serum królika</td><td>Vector lab</td><td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td>wosk parafinowy</td><td>Carlo Erba</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>Paraphormaldeyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>cytrynian sodu dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Analytical</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain Elite ABC Kit</td><td>Vector lab</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen Czysty</td><td>Carlo Erba</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunohistochemia (IHC) to bardzo czuła i specyficzna technika związana z wykrywaniem docelowych antygenów w skrawkach tkanek z oznakowanymi przeciwciałami. Jest to wieloetapowy proces, w którym optymalizacja każdego kroku jest kluczowa dla uzyskania optymalnego sygnału specyficznego. Dzięki IHC można wykryć rozmieszczenie i lokalizację określonych biomarkerów, co ujawnia informacje na temat ochrony ewolucyjnej. Co więcej, IHC pozwala zrozumieć zmiany ekspresji i dystrybucji biomarkerów w stanach patologicznych, takich jak otyłość. IHC, głównie technika immunofluorescencji, może być stosowana u dorosłych danio pręgowanego do wykrywania organizacji i dystrybucji filogenetycznie zachowanych cząsteczek, ale standardowy protokół IHC nie jest ustalony. Oreksyna i endokannabinoid to dwa wysoce konserwatywne systemy zaangażowane w kontrolę spożycia pokarmu i patologii otyłości. Przedstawiono tutaj protokoły stosowane w celu uzyskania informacji na temat lokalizacji i dystrybucji peptydu oreksyny (OXA), receptora oreksyny (OX-2R) i receptora kannabinoidowego (CB1R) w jelitach i mózgu normalnych i indukowanych dietą otyłych (DIO) modeli dorosłych danio pręgowanego. Opisano również metody immunoperoksydazy i podwójnej immunofluorescencji, a także przygotowania odczynników, utrwalania, zatapiania parafiny i krioprotekcji tkanki danio pręgowanego oraz przygotowania do endogennego etapu blokowania aktywności i przeciwbarwienia tła. Pełny zestaw parametrów uzyskano z poprzednich eksperymentów IHC, dzięki którym pokazaliśmy, w jaki sposób immunofluorescencja może pomóc w zrozumieniu rozmieszczenia, lokalizacji i zachowania ekspresji OXs, OX-2R i CB1R w tkankach dorosłego danio pręgowanego. Uzyskane obrazy o bardzo specyficznej intensywności sygnału doprowadziły do potwierdzenia, że danio pręgowany jest odpowiednim modelem zwierzęcym do badań immunohistochemicznych nad rozmieszczeniem, lokalizacją i ewolucyjną ochroną określonych biomarkerów w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Przedstawione tutaj protokoły są zalecane do eksperymentów IHC na dorosłych danio pręgowanym.

Reprezentatywne dane dla barwienia immunoperoksydazy są pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2. Analiza immunohistochemiczna rozmieszczenia OX-A i OX-2R w jelicie dorosłego danio pręgowanego wykazała różne miejsca lokalizacji OX-A i OX-2R oraz ich wzrost ekspresji w komórkach jelitowych danio pręgowanego DIE. Intensywne brązowe zabarwienie dla OX-A zaobserwowano w komórkach jelita przyśrodkowego i przedniego (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A, A1). Immunoekspresj...

Przedstawione są tutaj protokoły immunohistochemicznej charakterystyki i lokalizacji peptydu oreksyny, receptorów oreksyny i receptorów endokannabinoidowych w jelitach i mózgach dorosłych dorosłych ryb pręgowanych z normalną i indukowaną dietą (DIO) przy użyciu metod immunoperyxidazy i podwójnej immunofluorescencji.

Identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Obecnie immunohistochemia jest coraz częściej stosowana do identyfikacji obecności specyficznych markerów molekularnych i ich zmian w przypadku patologii, dając podstawę do wykonania analizy ilościowej. Immunohistochemia, głównie technika immunofluorescencji, jest stosowana w modelu zwierzęcym larw i dorosłego danio pręgowanego, ale niewiele wiadomo o dobrym standardowym protokole immunohistochemicznym dla danio pręgowanego. W tym miejscu opisujemy i ilustrujemy protokół, który można wykorzystać do badania ewolucyjnej ochrony ważnych białek u dorosłych ryb pręgowanych.Dobry protokół immunohistochemiczny u dorosłych ryb danio pręgowanego może pomóc w ustaleniu przydatności tego modelu zwierzęcego do badania morfologicznej ekspresji i rozmieszczenia wysoce konserwatywnych biomolekuł. Metoda ta może również pomóc w analizie możliwych zmian tych biomolekuł spowodowanych stanami patologicznymi skorelowanymi z fizjopatologią człowieka. Procedurę zademonstruje dr Lea Tunisi, doktorantka z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś przygotowane zamrożone bloki tkanek do kriostatu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wytnij blok w odcinkach koronalnych lub strzałkowych o długości 10 mikrometrów. Następnie zbierz tkanki w naprzemiennych odcinkach seryjnych na samoprzylepnych szkiełkach podstawowych odpowiednich do immunohistochemii i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do kontynuowania.Najpierw użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby wyznaczyć obszar tkanki na szkiełku. Przepłukać skrawki trzy razy przez pięć minut każda, używając 0,1-molowego buforu fosforanowego. Następnie rozpuść 0,3 mililitra Triton X-100 w 100 mililitrach 0,1-molowego buforu fosforanowego, aby przygotować Triton X-100 0,3%Rozpuść 0,1% normalną surowicę osła w buforze fosforanowym zawierającym 0,3% Triton X-100, aby przygotować roztwór blokujący.Skrawki inkubować roztworem normalnej surowicy osła rozpuszczonej w buforze permeabilizacyjnym PB-Triton X-100 0,3% przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności błony komórkowej i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania. Najpierw przepłucz skrawki trzy razy przez pięć minut każda 0,1-molowym buforem fosforanowym. Dodać mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w PB-T i inkubować skrawki przez noc w wilgotnym pudełku w temperaturze pokojowej.Następnego dnia przepłukać skrawki trzy razy przez pięć minut, każdy 0,1-molowym buforem fosforanowym. Inkubować skrawki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w odpowiedniej mieszance przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w PB-T. Na początek przepłucz skrawki trzy razy przez pięć minut, każdy 0,1-molowym buforem fosforanowym.Rozpuść 1,5 mikrolitra DAPI w trzech mililitrach buforu fosforanowego, aby przygotować barwnik jądrowy DAPI. Przeciwbarwić sekcje w barwniku. Następnie użyj podłoża montażowego do nakrycia szkiełek, aby ustabilizować tkankę i zabarwić do długotrwałego użytkowania.Próbki fluorescencyjne można przechowywać w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórzyć protokół immunofluorescencji i albo pominąć pierwszorzędowe lub drugorzędowe przeciwciało, albo zastąpić pierwszorzędową lub drugorzędową surowicę buforem fosforanowym w celu przygotowania kontroli ujemnej. Następnie powtórz protokół immunofluorescencji i wstępnie wchłonij każde przeciwciało pierwszorzędowe z nadmiarem odpowiedniego peptydu.Powtórz protokół immunofluorescencji na wycinkach mózgu myszy, aby przygotować kontrolę pozytywną. Za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w zmotoryzowany stolik X-Y-Z, kamerę cyfrową oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy, obserwuj i analizuj wybarwione immunologicznie odcinki. Uzyskuj obrazy cyfrowe za pomocą obiektywów 5x, 20x i 40x.Rób zdjęcia każdej sekcji w małym powiększeniu w każdym z dostępnych kanałów, aby skomponować montaż w małym powiększeniu. Znormalizuj obrazy fluorescencyjne do maksymalnego kontrastu i nałożenia. W całym obszarze zainteresowania zbierz szeregowe stosy obrazów Z przez sześć płaszczyzn ogniskowych z krokami ogniskowymi od jednego do 1,8 mikrometra.Wykonaj tę kolekcję dla każdego kanału osobno. Następnie użyj oprogramowania do dekonwolucji obrazowania, aby zdekonwoluować obrazy za pomocą aplikacji 10 iteracji i zwinąć szeregowe obrazy płaszczyzny Z w jeden maksymalny obraz projekcyjny. Użyj odpowiedniego oprogramowania do edycji obrazu, aby dostosować mikrofotografie do światła i kontrastu.Analiza immunohistochemiczna rozmieszczenia OX-A i OX-2R w jelicie dorosłego danio pręgowanego pokazuje różne miejsca lokalizacji OX-A i OX-2R oraz ich wzrost ekspresji w komórkach jelitowych danio pręgowanego DIO. Intensywne brązowe zabarwienie OX-A obserwuje się w komórkach jelita przyśrodkowego i przedniego. Immunoekspresja OX-A daje wyraźne sygnały w różnych przedziałach jelitowych, zmniejszając się od przodu w kierunku jelita przyśrodkowego.Podobne wyniki obserwuje się dla immunoekspresji OX-2R w jelicie danio pręgowanego DIO i grupy kontrolnej. Zwiększonemu sygnałowi OX-A u dorosłych danio pręgowanych DIO towarzyszy nadekspresja OX-2R w innych przedziałach jelitowych. Dokładna analiza obrazów immunofluorescencyjnych pokazuje wzrost kolokalizacji OX-2R/CB1R w jelicie dorosłego danio pręgowanego DIO w porównaniu z danio pręgowanym w diecie kontrolnej.Podobną sytuację obserwuje się w różnych obszarach mózgu, takich jak kresomózgowie grzbietowe, podwzgórze, tektum nerwu wzrokowego, torus lateralis i rozlane jądro płata dolnego. Poprzez podwójne barwienie immunologiczne z kolokalizacją oreksyny-A i CB1R obserwuje się, że nastąpił wzrost kolokalizacji w neuronach oreksynergicznych podwzgórza, któremu towarzyszy wzrost sygnału fluorescencyjnego oreksyny-A. Wyniki te pokazują, w jaki sposób podwójna immunofluorescencja może pomóc w identyfikacji fizjologicznie zachowanej ekspresji białek, kolokalizacji białek docelowych oraz ich dystrybucji i / lub zmian ekspresji w różnych stanach patologicznych.Za pomocą immunofluorescencji możemy lepiej zrozumieć kodystrybucję i koekspresję biomolekuł, ich możliwe interakcje, a także możemy mieć widoczny obraz ich zmian w przypadku różnych patologii. Co więcej, neuroanatomiczny rozkład ekspresji enzymów metabolicznych lub receptorów może dodatkowo ujawnić rolę sygnalizacji białkowej w tkankach. Obecne prace techniczne wprowadziły podejście immunofluorescencyjne do badania dwóch wysoce konserwatywnych układów, oreksyny i endokannabinoidów, przy użyciu modelu dorosłego grybonego.Korzystając z tego opisanego tutaj protokołu po raz pierwszy w mózgu dorosłego danio pręgowanego, anatomiczna dystrybucja i koekspresja receptorów oreksyny-2 i receptorów endokannabinoidowych-CB1 nie została określona. Zalecamy opisane tutaj protokoły do eksperymentów immunohistochemicznych oraz do wykrywania przestrzennego rozmieszczenia i organizacji receptorów w peptydach u dorosłych danio pręgowanego, aby lepiej zrozumieć ich funkcje.

identification-orexin-endocannabinoid-receptors-adult-zebrafish-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje protokół badania kolokalizacji receptorów oreksyny i kannabinoidów w tkance mózgowej dorosłego danio pręgowanego z normalną i wywołaną dietą (DIO) za pomocą immunofluorescencji.

Wykrywanie kolokalizacji oreksyny i receptora kannabinoidowego u otyłych danio pręgowanych wywołanych dietą

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Obiekt dla danio pręgowanego nadający się do hodowli i badań in vivo jest zbudowany w łatwy i niedrogi sposób. Konserwacja jest minimalna. To miejsce jest idealne do angażowania studentów i niezależnych badań.

Budowa niedrogiego i łatwego w budowie obiektu do połowu danio pręgowanego

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj techniki immunoperoksydazy i immunofluorescencji do lokalizacji oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych Danio rerio. Ta metoda pozwala badać zmiany ekspresji białek w warunkach patologicznych.

Identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów