Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa otacza naczynia krwionośne i reguluje fizjologię układu krążenia. Protokół ten służy do odpowiedzi na kluczowe pytania związane z funkcją przodków tkanki tłuszczowej człowieka w mikrośrodowisku naczyniowym. Komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej różnią się w zależności od ich anatomicznego położenia.

Pokazujemy, że populację multipotencjalnych komórek progenitorowych można z powodzeniem wyprowadzić z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej od pacjentów z chorobami układu krążenia. Procedurę zademonstruje Spencer Scott, student medycyny z mojego laboratorium. Z sali operacyjnej należy pobrać 500-miligramowy fragment ludzkiej okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej lub PVAT, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przenieś świeży ludzki PVAT z DMEM do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 25 mililitrów roztworu antybiotyku. Inkubuj z kołysaniem przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas gdy PVAT znajduje się w roztworze antybiotyku, rozmrozić porcję buforu dysocjacyjnego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj 50 mikrolitrów 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku do pięciu mililitrów buforu dysocjacyjnego i sterylizuj za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 mikrona. Dodaj jeden mililitr roztworu żelatyny do jednego dołka 24-dołkowej płytki. W okapie z przepływem laminarnym użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby przenieść PVAT z roztworu antybiotyku na sterylną szalkę Petriego.

Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego buforu dysocjacyjnego do tkanki. Drobno zmiel całą tkankę na zawiesinę za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Przenieś jeden mililitr zawiesiny do czterech mililitrów buforu dysocjacyjnego.

Inkubuj probówkę na boku we wstępnie ogrzanej wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obr./min przez jedną godzinę. Po godzinie nie powinny być widoczne żadne fragmenty tkanki, a roztwór pojawi się jako mętna zawiesina komórek. Przefiltruj roztwór przez sitko o średnicy 70 mikronów umieszczone na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów.

Przepłucz sitko dodatkowymi 10 mililitrami roztworu antybiotyku, aby uchwycić jak najwięcej komórek. Nie ściskaj sitka. Teraz granuluj komórki przez 12 minut w temperaturze 300 razy g w wirówce z odchylanym wiadrem.

Po odwirowaniu probówka zostanie oddzielona na tłuszczową górną warstwę adipocytów, interfazę i osad. Osad jest frakcją naczyniową zrębu zawierającą komórki śródbłonka, komórki odpornościowe, komórki krwi i komórki progenitorowe. Zawiesić osad w 10 mililitrach HBSS i wirować przez pięć minut w temperaturze 300 razy g.

Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania w HBSS. Teraz odessać żelatynę z płytki 24-dołkowej. Delikatnie umyj studzienkę raz HBSS, aby usunąć niezwiązaną żelatynę.

Zawiesić osad frakcji zrębu naczyniowego z nienaruszonymi krwinkami czerwonymi w jednym mililitrze pożywki wzrostowej i wysiewać nasiona na dołku pokrytym żelatyną. Następnie dodaj ludzki FGF2 do końcowego stężenia 25 nanogramów na mililitr w pożywce hodowlanej. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Po wyhodowaniu komórek przez 24 godziny usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki pięciokrotnie HBSS. Ten etap mycia usuwa czerwone krwinki i martwe komórki. Następnie dodaj jeden mililitr świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej 25 nanogramami na mililitr FGF2 do każdej studzienki.

Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, upewniając się, że za każdym razem uzupełniasz 25 nanogramów na mililitr świeżego FGF2. Komórki pasażowe, gdy osiągną 100% zbiegu, siedem do 10 dni po eksplantacji. W tym celu należy odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie umyć monowarstwę jednym mililitrem HBSS.

Odessać wszystkie HBSS ze studzienek i dodać kilka kropli roztworu do dysocjacji komórek. Postukaj i zakręć płytką kilka razy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez pięć do siedmiu minut, aby podnieść komórki. Następnie dodaj około jednego mililitra świeżej pożywki hodowlanej do oderwanych komórek.

Rozprowadzić 500 mikrolitrów odłączonych komórek do dwóch dołków 24-dołkowej płytki, z których każda zawiera 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej i 25 nanogramów FGF2. Należy również przeprowadzić hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych ludzkiego szpiku kostnego lub kolonii MSC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na płytce należy umieścić odpowiednią liczbę komórek pochodzących ze szpiku kostnego i PVAT na zagłębienie na płytce 12-dołkowej.

W przypadku stanów adipogennych i osteogennych należy umieścić około 200 000 do 225 000 komórek na studzienkę. Natomiast w warunkach chondrogenicznych płytkę od 150 000 do 175 000 komórek na studzienkę. Następnie należy oddzielić komórki zarówno od populacji ludzkich komórek progenitorowych PVAT, jak i populacji MSC ludzkiego szpiku kostnego, dodając roztwór do odrywania komórek.

Inkubować komórki w roztworze odłączającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez pięć minut. Przeciągnij populacje do oddzielnych stożkowych fiolek o pojemności 15 mililitrów. Obracać fiolki w dół z prędkością 500 razy g przez siedem minut, aby granulować komórki.

Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS i użyj hemocytometru, aby oszacować liczbę komórek. Umieść komórki w 12-dołkowych naczyniach, tak jak poprzednio. Zapewnij osobne naczynia dla indukowanych i nieindukowanych stanów adipogennych i osteogennych.

I dodaj 1,5 mililitra adipogennych i osteogennych pożywek przewodzących do każdego dołka wywołanego stanu. Następnie dodaj 1,5 mililitra adipogennych i osteogennych pożywek nieindukcyjnych do każdej studzienki stanu nieindukowanego. Rozpocznij inkubację populacji komórek indukowanych i nieindukowanych adipogennie i osteogennych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Odwiruj pozostałą objętość ludzkich komórek progenitorowych PVAT i ludzkich MSCs szpiku kostnego przez siedem minut w temperaturze 500 razy g. Określ objętość potrzebną do ponownego zawieszenia pozostałego szpiku kostnego i granulek komórek pochodzących z PVAT, aby osiągnąć gęstość 100 000 komórek na 10 mikrolitrów. Następnie ponownie zawieś granulki w obliczonej objętości pożywki wzrostowej MSC w celu indukcji linii chondrogennej.

Delikatnie przesuwaj objętość komórek w górę i w dół za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie. Teraz odpipetuj 10 mikrolitrów kropli stężonego roztworu komórkowego do środka każdej studzienki, aby utworzyć mikromasę 100 000 komórek. Umieść jeden mililitr sterylnej wody w sąsiedniej studzience, aby zapobiec parowaniu.

Inkubuj kultury mikromasowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aby umożliwić agregację mikromasy. Po dwóch godzinach ostrożnie dodaj chondrogenne pożywki różnicujące wzbogacone o 10 nanogramów na mililitr ludzkiego TGF-beta-jednego do każdej z indukowanych studzienek stanowych. Teraz ostrożnie dodaj 1,5 mililitra pożywki nieindukcyjnej do studzienek w stanie nieindukowanym.

Zeskrobać lub wlać mikromasę w indukowanym stanie chondrogennym do kasety w celu odwodnienia, zatopienia i zabarwienia próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Badania różnicowania adipogennego prowadzono równolegle z ludzkimi komórkami progenitorowymi pochodzącymi ze szpiku kostnego MSC i PVAT. W stanie nieindukowanym nie jest widoczna akumulacja lipidów.

Jest to przeciwieństwo stanu indukowanego pokazanego po barwieniu obojętnych lipidów za pomocą Oil Red O. Chociaż stopień zróżnicowania w ludzkich komórkach pochodzących z PVAT aorty jest bardziej solidny, oba źródła komórek ludzkich wykazały zdolność do różnicowania się dla linii adipogennej. Protokół różnicowania osteogennego zastosowano w przypadku komórek MSC pochodzących ze szpiku kostnego i komórek pochodzących z PVAT. Komórki nieindukowane nie barwiły się czerwienią alizarynową.

Po protokole różnicowania osteogennego, u ludzkich MSCs rozwinęły się zwapniałe guzki, które zabarwiały się czerwienią alizarynową, podczas gdy ludzkie komórki PVAT aorty nie. Komórki pochodzące zarówno z MSCs ludzkiego szpiku kostnego, jak i ludzkiego PVAT wykazywały cechy charakterystyczne dla różnicowania chondrogennego z obfitą akumulacją kolagenu w mikromasie. Mikromasa jest utworzona z ludzkich MSCs szpiku kostnego i komórek pochodzących z PVAT w aorcie, które również wykazywały obfite nagromadzenie glikozaminoglikanów, na co wskazuje barwienie Alcian Blue.

Morfologicznie wykryto struktury podobne do luk z komórkami znajdującymi się w jamach otoczonych odkładaniem się kolagenu. Bardzo ważne jest, aby drobno zmielić okołonaczyniową tkankę tłuszczową przed dysocjacją enzymatyczną i zapewnić odpowiednią gęstość komórek dla każdego testu różnicowania linii. Zgodnie z tą procedurą, ilościowy PCR w połączeniu z western blot i cytometrią przepływową powinien być stosowany w celu scharakteryzowania specyficznych dla linii markerów zróżnicowanych komórek progenitorowych z okołonaczyniowych źródeł tkanki tłuszczowej i szpiku kostnego.

Dzięki tej technice możemy zacząć rozumieć mechanizmy regulujące rozrost i dysfunkcję okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej podczas otyłości oraz implikacje, jakie komórki progenitorowe mają na funkcjonowanie naczyń krwionośnych i choroby sercowo-naczyniowe.