Name: Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj potencjał różnicowania okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty. Metoda ta umożliwia izolację wielopotencjalnych komórek i ich analizę w kontekście chorób układu krążenia oraz medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za pomoc Działu Nawigacji Badawczej w Maine Medical Center za pomoc w pozyskiwaniu tkanek klinicznych, oraz Podstawy Histopatologii i Histomorfometrii (wspieranej przez 1P20GM121301, L. Liaw PI) w Instytucie Badawczym Maine Medical Center w zakresie sekcji i barwienia. Prace te były wspierane przez grant NIH R01 HL141149 (L. Liaw).

Użycie tkanek ludzkich w tym badaniu zostało ocenione i zatwierdzone przez Institutional Review Board of Maine Medical Center, a cały personel przeszedł odpowiednie szkolenie przed eksperymentem.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Sporządzić bufor dysocjacyjny, odtwarzając 50 mg bezzwierzęcego roztworu kolagenazy/mieszaniny dispazy I w 1 ml nanoczystegoH2O. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 mg/ml, dodając 49 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającego 1% w/v BSA do odtworzonego roztworu kolagenazy/dypazy. Przed użyciem przechowywać 5 ml porcji roboczych w temperaturze -20 °C i ogrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór antybiotyku, dodając 1 ml 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku (końcowe stężenie to 200 jednostek/ml penicyliny, 200 jednostek/ml streptomycyny i 0,5 μg/ml fungizone) do 49 ml HBSS i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór żelatyny (0,2% w/v) rozpuszczając 200 mg żelatyny ze skóry bydlęcej w 100 ml nanoczystegoH2O. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki wzrostowej PVAT: DMEM/F12 o wysokiej zawartości glukozy z suplementem glutaminy, pirogronianem sodu i wodorowęglanem sodu, uzupełnionymi 10% FBS i 100 μg/ml środka przeciwdrobnoustrojowego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj 50 ml adipogenicznej pożywki indukcyjnej: 40,8 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 7,5 ml pożywki wzrostowej PVAT, 500 μL 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku (końcowe stężenie to 100 jednostek/ml penicyliny, 100 jednostek/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM zapasu w 0,1 M NaOH), 1 μM deksametazonu (1 mM zapasu w etanolu), 5 μM rozyglitazon (5 mM zapas w DMSO), 33 μM biotyna (66 mM zapas w DMSO), 100 nM insulina (200 μM zapas w 0,1% kwasie octowym) i 20 μM kwas pantotenowy (100 mM zapas w H2O).</li>
	<li>Przygotuj 50 ml kontrolnej pożywki indukcyjnej dla linii adipogennej: 40,8 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 7,5 ml pożywki wzrostowej PVAT i 500 μl paciorkowca (100x zapas).</li>
	<li>Przygotuj 50 ml adipogennej pożywki podtrzymującej: 41,5 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 7,5 ml pożywki wzrostowej PVAT z kroku 1.3, 500 μL pen-strep (100x zapas), 1 μM deksametazon (1 mM zapas w EtOH), 33 μM biotyna (66 mM zapas w DMSO), 100 nM insulina (200 μM zapas w 0,1% kwasie octowym), i 20 μM kwasu pantotenowego (100 mM zapas wH2O).</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki wzrostowej dla linii osteogennych i chondrogennych: αMEM o wysokim poziomie glukozy uzupełniony 10% FBS, 1x suplement glutaminy (patrz Tabela materiałów) i 5 ml pen-strep (100x zapas).</li>
	<li>Przygotować 50 ml pożywki indukcyjnej dla linii osteogennej: 50 ml pożywki wzrostowej MSC szpiku kostnego uzupełnionej 10 nM deksametazonem i 10 mM β-glicerofosforanem.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml pożywki indukcyjnej dla linii chondrogennej: 50 ml pożywki wzrostowej MSC szpiku kostnego uzupełnionej 100 nM deksametazonem, 50 μg/ml askorbinian-2-fosforanu sodu i 10 ng/ml TGFβ1. W stanach osteogennych i chondrogennych pożywka wzrostu MSC szpiku kostnego będzie służyć jako pożywka nieindukcyjna.</li>
</ol>
2. Protokół 1: Hodowla ludzkich komórek PVAT z frakcji naczyniowej zrębu
UWAGA: PVAT jest wycinany z miejsca zespolenia przeszczepu na aorcie wstępującej u znieczulonych pacjentów poddawanych zabiegom pomostowania aortalno-wieńcowego. PVAT aorty umieszcza się w stożkowym zbiorniku o pojemności 15 ml zawierającym 10 ml lodowato zimnego DMEM F12 o wysokiej zawartości glukozy i przenosi z sali operacyjnej do laboratorium w ciągu 2 godzin od resekcji. PVAT aorty jest tkanką odrzucaną podczas procedury pomostowania i została uznana za badanie nieprzeznaczone dla ludzi przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną Maine Medical Center.
<ol>
	<li>Ten protokół dotyczy ~500 mg kawałka ludzkiego PVAT (około 3 x 1 x 0,5 cm3). Przenieść świeży ludzki PVAT z DMEM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu antybiotyku. Inkubować z kołysaniem przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Gdy PVAT znajduje się w roztworze antybiotyku, rozmrozić porcję buforu dysocjacyjnego w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku do 5 ml buforu dysocjacyjnego i sterylizuj za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Dodaj 1 ml roztworu żelatyny do 1 dołka 24-dołkowej płytki. W okapie z przepływem laminarnym użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby przenieść PVAT z roztworu antybiotyku na sterylną szalkę Petriego. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego buforu dysocjacyjnego do tkanki i drobno zmiel całą tkankę na zawiesinę (nie kawałki większe niż ~2 x 2 mm2) za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek do preparowania.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę o objętości 1 ml do buforu dysocjacyjnego o pojemności 4 ml i inkubować probówkę na boku we wstępnie ogrzanej wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 °C przy prędkości obrotowej 200 obr./min przez 1 godzinę. Po 1 godzinie nie będzie widocznych kawałków tkanki, a roztwór pojawi się jako mętna zawiesina komórek.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przepłucz sitko dodatkowymi 10 ml roztworu antybiotyku, aby uchwycić jak najwięcej komórek. Nie ściskaj sitka.</li>
	<li>Granulować komórki przez 12 minut przy 300 x g w wirówce z odchylanym wiadrem. 
	nuta: Po odwirowaniu probówka zostanie oddzielona na tłuszczową górną warstwę adipocytów, interfazę i osad. Osad jest frakcją naczyniową zrębu zawierającą komórki śródbłonka, komórki odpornościowe, komórki krwi i komórki progenitorowe.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml HBSS i odwirowywać przez 5 minut przy 300 x g. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie 2 prania w HBSS. Po ostatnim umyciu nie należy lizować czerwonych krwinek. Wielokrotne próby z kilkoma dostępnymi na rynku i czasami inkubacji doprowadziły do znacznego zmniejszenia przyczepiania i żywotności komórek progenitorowych.</li>
	<li>Odessać żelatynę z płytki 24-dołkowej. Delikatnie umyj studzienkę 1x HBSS, aby usunąć niezwiązaną żelatynę.</li>
	<li>Zawiesić osad frakcji zrębu naczyniowego z nienaruszonymi krwinkami czerwonymi w 1 ml pożywki wzrostowej i nasion na studzience pokrytej żelatyną. Dodać ludzki FGF2 (ponownie zawieszony w PBS uzupełniony 0,01% BSA w/v) do końcowego stężenia 25 ng / ml w pożywce. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową i przemyj studzienki 5 razy HBSS, aby usunąć czerwone krwinki i martwe komórki. Dodać 1 ml świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej 25 ng/ml FGF2.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, upewniając się, że za każdym razem uzupełniasz 25 ng/ml świeżego FGF2.</li>
	<li>Komórki zazwyczaj osiągają 100% konfluencji 7-10 dni po eksplantacji; komórki pasażujące wtedy:
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę wzrostową i przemyć monowarstwę 2x w 1 ml HBSS. Odessać wszystkie HBSS ze studzienek i dodać kilka kropli roztworu do dysocjacji komórek.</li>
		<li>Postukać i zakręcić płytką kilka razy, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5–7 minut w celu podniesienia komórek. Dodaj ~ 1 ml świeżej pożywki hodowlanej do oderwanych komórek i rozprowadź 500 μl do 2 dołków 24-dołkowej płytki, z których każda zawiera 500 μl pożywki wzrostowej i 25 ng FGF2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj ekspansję ludzkich komórek pochodzących z PVAT, jak wskazano w poprzednim kroku. Każdy fragment nie powinien być większy niż podział 1:2. Komórki są pasażowane 5–7 razy przed przydzieleniem do testów różnicowania.</li>
</ol>
3. Protokół 2: Hodowla Ludzkich Kolonii Szpiku Kostnego MSC
UWAGA: MSC ludzkiego szpiku kostnego są izolowane zgodnie z opisem8 i przechowywane jako zamrożone materiały do wczesnego pasażu w pożywkach do zamrażania (70% FBS, 20% bazowe DMEM i 10% DMSO) w ~100 000 komórek/ml w płynie N2.
<ol>
	<li>Szybko rozmrozić fiolkę z MSC szpiku kostnego z cieczy N2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i płytce do jednego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 3 ml pożywki wzrostowej MSC i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia odessać pożywkę hodowlaną MSC i przemyć komórki 3x w 2 ml HBSS. Przy 100% konfluencji odessać pożywkę wzrostową i przemyć komórki 3x w 2 ml HBSS. Dodać 500 μl/roztwór do oddzielania komórek studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut. Postukaj w płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte i równomiernie rozprowadź zawartość do 2 dołków 6-dołkowej płytki zawierającej 2 ml pożywki wzrostowej MSC.</li>
	<li>Rozszerzać ludzki szpik kostny i MSC pochodzące z PVAT równolegle przez około 5–7 pasaży lub do momentu, gdy zostaną osiągnięte ilości wystarczające do badania.</li>
</ol>
4. Protokół 3: Płytka i indukcja linii adipogennych, osteogennych i chondrogennych
<ol>
	<li>Na płytce 12-dołkowej należy umieścić odpowiednią liczbę komórek pochodzących ze szpiku kostnego i PVAT na basenie oraz odpowiednie kontrpróby dla każdego warunku doświadczalnego. W stanach adipogennych i osteogennych potrzeba ~200 000–225 000 komórek/studzienkę, w stanach chondrogennych potrzeba 150 000–175 000 komórek/studzienkę. 
	nuta: Przeprowadziliśmy co najmniej N = 3 powtórzone studnie dla warunków kontrolnych i indukowanych dla każdej linii eksperymentalnej, w sumie 2 niezależne serie (N = łącznie 6 powtórzeń).</li>
	<li>Odłącz komórki zarówno od populacji ludzkich komórek progenitorowych PVAT, jak i populacji MSC ludzkiego szpiku kostnego za pomocą roztworu do oddzielania komórek i inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut. Pulić populacje w oddzielnych stożkowych fiolkach o pojemności 15 ml. Obracać fiolkę w temperaturze 500 x g przez 7 minut, aby otoczkować komórki. Ponownie zawiesić w 1 ml PBS i użyć hemocytometru, aby oszacować liczbę komórek.</li>
	<li>Umieść komórki w 12-dołkowych naczyniach, jak wskazano w kroku 4.1. Zapewnij oddzielne szalki dla indukowanych i nieindukowanych stanów adipogennych, osteogennych i takich, aby stan nieindukowany mógł zostać naprawiony we wcześniejszym punkcie czasowym bez zakłócania ciągłej hodowli stanu indukowanego.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml adipogennej i osteogennej pożywki indukcyjnej do każdego dołka indukowanego stanu. Dodaj 1,5 ml adipogennej i osteogennej pożywki nieindukcyjnej do każdego dołka stanu nieindukowanego. Rozpocząć inkubację populacji komórek indukowanych i nieindukowanych adipogennie i osteogennych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Odwirowywać pozostałą objętość ludzkich komórek progenitorowych PVAT i MSCs ludzkiego szpiku kostnego przez 7 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Określ objętość potrzebną do ponownego zawieszenia pozostałego szpiku kostnego i granulek komórek pochodzących z PVAT, aby osiągnąć gęstość 100 000 komórek/10 μL (10,6 komórek/ml). Zawiesić osady w obliczonej objętości pożywki wzrostowej MSC w celu indukcji linii chondrogennej. Delikatnie przesuwaj objętość komórek w górę i w dół za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodny rozkład.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl kropli stężonego roztworu komórkowego do środka każdej studzienki, aby utworzyć mikromasę 100 000 komórek. Umieść 1 ml sterylnegoH2Ow sąsiedniej studzience, aby zapobiec parowaniu. Inkubować kultury mikromasy przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić agregację mikromasy.</li>
	<li>Po 2 godzinach ostrożnie dodaj chondrogenne pożywki różnicujące wzbogacone 10 ng / ml ludzkiego TGFβ1 do każdej z dołków o stanie indukowanym. Ostrożnie dodać 1,5 ml pożywki nieindukcyjnej (pożywki do wzrostu MSC szpiku kostnego) do studzienek w stanie nieindukowanym. Użyj oddzielnych płytek 12-dołkowych dla warunków indukowanych i nieindukowanych, tak aby stan nieindukowany można było ustalić we wcześniejszym punkcie czasowym.</li>
</ol>
5. Protokół 4: Hodowla linii adipogennych, osteogennych i chondrogennych przez 14 dni
<ol>
	<li>Hodowla warunków indukowanych i nieindukowanych wszystkich trzech linii przez 4 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , odświeżanie pożywek co 2 dni. W dniu 4 zmień stan indukowanej linii adipogennej z pożywki indukcyjnej na pożywkę podtrzymującą na pozostałą część testu.</li>
	<li>Napraw wszystkie niewywołane stany w 10% formalinie przez 12 godzin. Wyrzuć formalinę i umyj wszystkie stałe studzienki 2x w PBS, aby usunąć wszelkie ślady formaliny. Przechowywać płytki w PBS w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.</li>
	<li>Hodowla indukowanych warunków przez łącznie 14 dni, odświeżanie pożywki co 2 dni. Dodawać świeży TGFβ1 w końcowym stężeniu 10 ng/ml przy każdym odświeżeniu chondrogenicznej pożywki indukcyjnej. Kontynuuj hodowlę linii adipogennej w pożywce podtrzymującej adipogennej i pożywce indukcyjnej linii osteogennej, odświeżając co 2 dni. W dniu 14 ustal wszystkie wywołane warunki przez 12 godzin w 10% formalinie do barwienia.</li>
	<li>Zeskrob lub wlej mikromasę w indukowanym stanie chondrogeniznym do kasety w celu zatopienia. Odwodnić mikromasę w serii coraz bardziej skoncentrowanych kąpieli alkoholowych przez 5 minut, zaczynając od 70%, następnie 80%, dwa razy w 95% i jeszcze dwa razy w alkoholu bezwodnym. Umieść kasetę w środku dealkoholizującym, a następnie na koniec zanurz kasetę w wosku parafinowym w celu przekrojenia i barwienia.</li>
</ol>
6. Protokół 5: Barwienie stanu adipogennego za pomocą czerwonego oleju O
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy czerwieni olejowej O, rozpuszczając 350 mg czerwonej oliwy o w 100 ml 100% izopropanolu. Mieszać przez 2 godziny za pomocą mieszadła i odkurzyć przez filtr 0,2 μm. Roztwór podstawowy można przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 rok.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy Oil Red O, mieszając 3 części roztworu podstawowego z 2 częściami diH20 (np. 60 ml roztworu podstawowego na 40 ml diH20). Końcowe stężenie czerwonego oleju O w roztworze roboczym wynosi 2,1 mg/ml.</li>
	<li>Usuń cały płyn ze studzienek. Umyj każdą studzienkę 2x 60% izopropanolem, upewniając się, że całkowicie usunąłeś całą wodę z boków studzienek. Odessać 60% izopropanolu i szybko dodać roztwór roboczy Oil Red O, nie dotykając ścianek studzienek, aby przykryć dno. Bardzo ważne jest, aby ten krok został wykonany szybko, aby studnie nie wyschły.</li>
	<li>Po dodaniu czerwonego oleju O inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.</li>
	<li>Usuń cały czerwony olej O i natychmiast dodaj destylowany H2O. Myj destylowanym H2O przez 10 m, aby rozpocząć usuwanie niezwiązanego czerwonego oleju O. Po 10 minutach odessać Oil Red O i powtórzyć procedurę prania 3x.</li>
	<li>Po zakończeniu mycia dodaj PBS i zobrazuj komórki. Barwione komórki przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Protokół 6: Barwienie stanu osteogennego za pomocą czerwieni alizarynowej
<ol>
	<li>Usuń cały płyn z każdej studzienki. Dodaj odpowiednią objętość 2% roztworu czerwonego barwnika Alizaryny do każdego dołka (1,5 ml na studzienkę dla płytki 12-dołkowej) i delikatnie przechylaj płytkę na boki, aż roztwór całkowicie pokryje dno studzienki.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń Alizarin Red ze studzienek. Delikatnie przepłukać każdą studzienkę cztery razy destylowanymH2O, uważając, aby nie usunąć kryształów wapnia. Pozostawić do wyschnięcia.</li>
</ol>
8. Protokół 7: Barwienie stanu chondrogennego za pomocą trichromu Massona
<ol>
	<li>Piec szkiełka w suchym piekarniku w temperaturze 60 °C przez 30 minut. Odparafinować i uwodnić sekcje do wody destylowanej.
	<ol>
		<li>Aby się nawodnić, umieść szkiełka w trzech 5-minutowych inkubacjach ze środkami dealkoholizującymi, a następnie 5-minutowe inkubacje w malejących stężeniach alkoholu w następujący sposób: dwie w 100% (absolutny etanol), dwie w 95% alkoholu, dwie w 80%, dwie w 70% i wreszcie dwie w destylowanymH2O. Szkiełka mogą pozostać w H2O, podczas gdy utrwalacz Bouina jest przygotowany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 40 ml utrwalacza Bouina w plastikowym słoiku coplin do kuchenki mikrofalowej (bez przykrycia). Kuchenka mikrofalowa na wysokim poziomie, aby doprowadzić temperaturę do 55 °C. Umieścić szkiełko w podgrzanym roztworze na 20 minut; Pozostaw na blacie przykrytym. Myj pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut lub do momentu, gdy cały żółty kolor zniknie.</li>
	<li>Zabarwić skrawki w hematoksylinie Weigerta przez 10 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 10 min.</li>
	<li>Skrawki plamić w roztworze szkarłatnej fuksyny kwasu szkarłatnego Beibricha przez 10 min. Myć 3x 10 min w wodzie z kranu. Zaprawa ślizga się w roztworze kwasu fosfowolframowego/fosfomolibdynowego przez 10 minut. Nie spłukiwać.</li>
	<li>Umieść szkiełka bezpośrednio w roztworze błękitu anilinowego na 10 minut. Spłucz dwoma krótkimi zanurzeniami w wodzie z kranu.</li>
	<li>Umieść szkiełka w 1% roztworze kwasu octowego na 3 do 5 minut. Myj w wodzie z kranu przez 1 minutę. Umieść w 95% etanolu na 1 minutę. Odwodnić zgodnie ze wskazówkami w kroku 5.4 i zamontuj z żywicą syntetyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+biology+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li>
<li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis%3A+identifying+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li>
<li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease%3A+a+review+of+current+research+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li>
<li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adipose+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li>
<li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li>
<li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li>
<li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+shades+of+white%3A+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li>
<li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes%3A+To+What+Extent+Are+They+Related%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li>
<li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitia+and+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li>
<li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Ecancermedicalscience%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822(2018).</li>
<li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+and+Hemotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li>
<li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li>
<li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li>
<li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Using+human+adipose-derived+stem%2Fstromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li>
<li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej z różnych depozytorów różnią się znacznie pod względem fenotypu i potencjału różnicowania9. Hodowla komórek progenitorowych pochodzących z PVAT od jednego dawcy pacjenta w jednoczesnej indukcji w dół trzech różnych linii, adipogennej, osteogennej i chondrogenicznej, pozwala na dobrze kontrolowane badanie zdolności pluripotencjalnych tej nowej populacji komórek progenitorowych. Metodologia opisana w tym raporcie może być wykorzystana do zbadania zdolności ró...

Tkanka tłuszczowa jest bogatym źródłem wielu silnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) zdolnych do różnicowania się w linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne1. Tkanka ta rozszerza się poprzez przerost dojrzałych adipocytów i różnicowanie de novo rezydentnych MSC do adipocytów. Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa (PVAT) otacza naczynia krwionośne i reguluje pracę naczyń krwionośnych2,3. Wywołana otyłością ekspansja PVAT zaostrza patologie sercowo-naczyniowe. Chociaż potencjał multipotencjalny MSC z ludzkich podskórnych magazynów tkanki tłuszczowej został dobrze zbadany4,5, żadne badania nie eksplantowały i nie oceniały zdolności różnicowania ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z PVAT, prawdopodobnie ze względu na inwazyjność pobierania. W związku z tym celem tej pracy jest przedstawienie metodologii eksplantacji i rozmnażania komórek progenitorowych z ludzkiego aorty PVAT od pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi oraz przetestowanie ich skłonności do różnicowania się do linii osteogennych, chondrogenicznych i adipogennych. Źródłem PVAT jest miejsce zespolenia pomostowania aortalnego na aorcie wstępującej u otyłych pacjentów poddawanych operacji pomostowania aortalno-wieńcowego. Świeżo wyizolowany PVAT jest dysocjowany enzymatycznie, a frakcja naczyniowa zrębu jest izolowana i rozmnażana in vitro, co pozwala nam po raz pierwszy przetestować zdolność różnicowania ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z PVAT.
Korzystając z pierwotnej hodowli ludzkiej frakcji zrębu zrębowego PVAT, przetestowaliśmy trzy testy mające na celu indukowanie komórek macierzystych/progenitorowych do różnicowania się w kierunku linii adipogennych, osteogennych lub chondrogennych. Nasze poprzednie badanie zidentyfikowało populację komórek CD73+, CD105+ i PDGFRa+ (CD140a), które mogą silnie różnicować się w adipocyty6, chociaż ich wielomoc nie została przetestowana. PVAT bezpośrednio reguluje napięcie naczyniowe i stan zapalny7. Uzasadnieniem dla testowania potencjału różnicowania tej nowej populacji komórek jest rozpoczęcie zrozumienia wyspecjalizowanego wpływu PVAT na funkcję naczyń krwionośnych i mechanizmy ekspansji PVAT podczas otyłości. Metodologia ta poszerza naszą wiedzę na temat funkcji komórek progenitorowych pochodzących z tkanki tłuszczowej oraz umożliwia identyfikację i porównanie podobieństw i różnic między komórkami progenitorowymi z różnych źródeł tkankowych. Opieramy się na uznanych i zatwierdzonych podejściach do izolowania i różnicowania MSC w kierunku różnych linii i optymalizujemy procedury, aby zmaksymalizować żywotność ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z PVAT. Techniki te mają szerokie zastosowanie w dziedzinie badań nad komórkami macierzystymi i progenitorowymi oraz rozwoju tkanki tłuszczowej.

<table><tbody><tr><td>Mieszanka kolagenazy i dispazy bez produktów pochodzenia zwierzęcego I &nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCR139</td><td>50mg</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>NewComerSupply</td><td>1003A</td><td>1% roztwór wodny pH 2,5</td></tr><tr><td>Alizarin Red</td><td>Amresco</td><td>9436-25G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td></td></tr><tr><td>Aniline Blue</td><td>NewComerSupply</td><td>10073C</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Fuksyna szkarłatna Beibricha</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A3908-25G</td><td></td></tr><tr><td>b-glicerofosforan</td><td>Milipore-Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biebrich Scarlet</td><td>EKI</td><td>2248-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Milipore-Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz Bouina</td><td>NewComerSupply</td><td>1020A</td><td></td></tr><tr><td>Bydło albumina surowicy</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td>przechowywana w temperaturze 4 stopni C</td></tr><tr><td>Roztwór do odłączania komórek</td><td>Accutase</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Sitko dzwonkowe (70 mm)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Milipore-Sigma</td><td>D4902-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/L glukozy, L-glut i pirogronian</td></tr><tr><td>DMEM/F12 średni</td><td>ThermoFisher</td><td>10565-042</td><td>wysoka glukoza, glutamax, sód bikarbinian</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp;</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>NewComerSupply</td><td>1090</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry bydlęcej</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>suplement glutaminy</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>10-547F</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I5879-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Olej czerwony O</td><td>Millipore-Sigma</td><td>O0625-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pantotenowy</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5155-100G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>15240062 100ml</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu fosfowolframowego/fosfoomybdiowego</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P4006-100G/221856-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Odczynnik przeciwdrobnoustrojowy do pożywek hodowlanych.</td></tr><tr><td>Rozyglitazon</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R2408-10MG</td><td></td></tr><tr><td>TGFb1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Weigerta</td><td>EKI</td><td>4880-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Tkanka tłuszczowa jest bogatym źródłem wielu silnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) zdolnych do różnicowania się w linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne. Różnicowanie adipogenne komórek progenitorowych jest głównym mechanizmem napędzającym ekspansję i dysfunkcję tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na otyłość. Zrozumienie zmian w okołonaczyniowej tkance tłuszczowej (PVAT) jest zatem klinicznie istotne w chorobach metabolicznych. Jednak wcześniejsze badania przeprowadzono głównie na myszach i innych modelach zwierzęcych. W protokole tym wykorzystuje się ludzkie próbki PVAT klatki piersiowej pobrane od pacjentów poddawanych operacji pomostowania aortalno-wieńcowego. Pobrano tkankę tłuszczową z aorty wstępującej i wykorzystano do eksplantacji zrębowej frakcji naczyniowej. Wcześniej potwierdziliśmy obecność komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej w ludzkim PVAT ze zdolnością do różnicowania się w adipocyty zawierające lipidy. W tym badaniu dalej analizowaliśmy potencjał różnicowania komórek z frakcji zrębu naczyniowego, przypuszczalnie zawierających multipotencjalne komórki progenitorowe. Porównaliśmy komórki pochodzące z PVAT z ludzkim szpikiem kostnym MSC w celu różnicowania na linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne. Po 14 dniach różnicowania wykorzystano specyficzne barwniki do wykrycia nagromadzenia lipidów w adipocytach (czerwień olejowa O), złogów zwapnienia w komórkach osteogennych (czerwień alizarynowa) lub glikozaminoglikany i kolagen w komórkach chondrogenicznych (trichrom Massona). Podczas gdy MSC szpiku kostnego skutecznie różnicował się we wszystkich trzech liniach, komórki pochodzące z PVAT miały potencjał adipogenny i chondrogeniczny, ale brakowało im silnego potencjału osteogennego.

Izolacja frakcji naczyniowo-stromalnej z ludzkiej PVAT
Rysunek 1A przedstawia schemat obszaru anatomicznego, z którego pobrano tkankę PVAT pokrywającą aortę wstępującą. Wcześniej opisaliśmy grupy pacjentów poddawanych pomostowaniu tętnic wieńcowych, od których pochodziły te próbki6. Rysunek 1B przedstawia przykład ludzkiej tkanki...

Celem tego protokołu jest przetestowanie zdolności komórek progenitorowych pochodzących z ludzkiej okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Różnicowanie porównano z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z ludzkiego szpiku kostnego, o których wiadomo, że różnicują się w linie adipocytów, osteocytów i chondrocytów.

Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa otacza naczynia krwionośne i reguluje fizjologię układu krążenia. Protokół ten służy do odpowiedzi na kluczowe pytania związane z funkcją przodków tkanki tłuszczowej człowieka w mikrośrodowisku naczyniowym. Komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej różnią się w zależności od ich anatomicznego położenia.Pokazujemy, że populację multipotencjalnych komórek progenitorowych można z powodzeniem wyprowadzić z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej od pacjentów z chorobami układu krążenia. Procedurę zademonstruje Spencer Scott, student medycyny z mojego laboratorium. Z sali operacyjnej należy pobrać 500-miligramowy fragment ludzkiej okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej lub PVAT, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przenieś świeży ludzki PVAT z DMEM do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 25 mililitrów roztworu antybiotyku. Inkubuj z kołysaniem przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas gdy PVAT znajduje się w roztworze antybiotyku, rozmrozić porcję buforu dysocjacyjnego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj 50 mikrolitrów 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku do pięciu mililitrów buforu dysocjacyjnego i sterylizuj za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 mikrona. Dodaj jeden mililitr roztworu żelatyny do jednego dołka 24-dołkowej płytki. W okapie z przepływem laminarnym użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby przenieść PVAT z roztworu antybiotyku na sterylną szalkę Petriego.Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego buforu dysocjacyjnego do tkanki. Drobno zmiel całą tkankę na zawiesinę za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Przenieś jeden mililitr zawiesiny do czterech mililitrów buforu dysocjacyjnego.Inkubuj probówkę na boku we wstępnie ogrzanej wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obr./min przez jedną godzinę. Po godzinie nie powinny być widoczne żadne fragmenty tkanki, a roztwór pojawi się jako mętna zawiesina komórek. Przefiltruj roztwór przez sitko o średnicy 70 mikronów umieszczone na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów.Przepłucz sitko dodatkowymi 10 mililitrami roztworu antybiotyku, aby uchwycić jak najwięcej komórek. Nie ściskaj sitka. Teraz granuluj komórki przez 12 minut w temperaturze 300 razy g w wirówce z odchylanym wiadrem.Po odwirowaniu probówka zostanie oddzielona na tłuszczową górną warstwę adipocytów, interfazę i osad. Osad jest frakcją naczyniową zrębu zawierającą komórki śródbłonka, komórki odpornościowe, komórki krwi i komórki progenitorowe. Zawiesić osad w 10 mililitrach HBSS i wirować przez pięć minut w temperaturze 300 razy g.Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania w HBSS. Teraz odessać żelatynę z płytki 24-dołkowej. Delikatnie umyj studzienkę raz HBSS, aby usunąć niezwiązaną żelatynę.Zawiesić osad frakcji zrębu naczyniowego z nienaruszonymi krwinkami czerwonymi w jednym mililitrze pożywki wzrostowej i wysiewać nasiona na dołku pokrytym żelatyną. Następnie dodaj ludzki FGF2 do końcowego stężenia 25 nanogramów na mililitr w pożywce hodowlanej. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Po wyhodowaniu komórek przez 24 godziny usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki pięciokrotnie HBSS. Ten etap mycia usuwa czerwone krwinki i martwe komórki. Następnie dodaj jeden mililitr świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej 25 nanogramami na mililitr FGF2 do każdej studzienki.Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, upewniając się, że za każdym razem uzupełniasz 25 nanogramów na mililitr świeżego FGF2. Komórki pasażowe, gdy osiągną 100% zbiegu, siedem do 10 dni po eksplantacji. W tym celu należy odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie umyć monowarstwę jednym mililitrem HBSS.Odessać wszystkie HBSS ze studzienek i dodać kilka kropli roztworu do dysocjacji komórek. Postukaj i zakręć płytką kilka razy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez pięć do siedmiu minut, aby podnieść komórki. Następnie dodaj około jednego mililitra świeżej pożywki hodowlanej do oderwanych komórek.Rozprowadzić 500 mikrolitrów odłączonych komórek do dwóch dołków 24-dołkowej płytki, z których każda zawiera 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej i 25 nanogramów FGF2. Należy również przeprowadzić hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych ludzkiego szpiku kostnego lub kolonii MSC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na płytce należy umieścić odpowiednią liczbę komórek pochodzących ze szpiku kostnego i PVAT na zagłębienie na płytce 12-dołkowej.W przypadku stanów adipogennych i osteogennych należy umieścić około 200 000 do 225 000 komórek na studzienkę. Natomiast w warunkach chondrogenicznych płytkę od 150 000 do 175 000 komórek na studzienkę. Następnie należy oddzielić komórki zarówno od populacji ludzkich komórek progenitorowych PVAT, jak i populacji MSC ludzkiego szpiku kostnego, dodając roztwór do odrywania komórek.Inkubować komórki w roztworze odłączającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez pięć minut. Przeciągnij populacje do oddzielnych stożkowych fiolek o pojemności 15 mililitrów. Obracać fiolki w dół z prędkością 500 razy g przez siedem minut, aby granulować komórki.Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS i użyj hemocytometru, aby oszacować liczbę komórek. Umieść komórki w 12-dołkowych naczyniach, tak jak poprzednio. Zapewnij osobne naczynia dla indukowanych i nieindukowanych stanów adipogennych i osteogennych.I dodaj 1,5 mililitra adipogennych i osteogennych pożywek przewodzących do każdego dołka wywołanego stanu. Następnie dodaj 1,5 mililitra adipogennych i osteogennych pożywek nieindukcyjnych do każdej studzienki stanu nieindukowanego. Rozpocznij inkubację populacji komórek indukowanych i nieindukowanych adipogennie i osteogennych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.Odwiruj pozostałą objętość ludzkich komórek progenitorowych PVAT i ludzkich MSCs szpiku kostnego przez siedem minut w temperaturze 500 razy g. Określ objętość potrzebną do ponownego zawieszenia pozostałego szpiku kostnego i granulek komórek pochodzących z PVAT, aby osiągnąć gęstość 100 000 komórek na 10 mikrolitrów. Następnie ponownie zawieś granulki w obliczonej objętości pożywki wzrostowej MSC w celu indukcji linii chondrogennej.Delikatnie przesuwaj objętość komórek w górę i w dół za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie. Teraz odpipetuj 10 mikrolitrów kropli stężonego roztworu komórkowego do środka każdej studzienki, aby utworzyć mikromasę 100 000 komórek. Umieść jeden mililitr sterylnej wody w sąsiedniej studzience, aby zapobiec parowaniu.Inkubuj kultury mikromasowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aby umożliwić agregację mikromasy. Po dwóch godzinach ostrożnie dodaj chondrogenne pożywki różnicujące wzbogacone o 10 nanogramów na mililitr ludzkiego TGF-beta-jednego do każdej z indukowanych studzienek stanowych. Teraz ostrożnie dodaj 1,5 mililitra pożywki nieindukcyjnej do studzienek w stanie nieindukowanym.Zeskrobać lub wlać mikromasę w indukowanym stanie chondrogennym do kasety w celu odwodnienia, zatopienia i zabarwienia próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Badania różnicowania adipogennego prowadzono równolegle z ludzkimi komórkami progenitorowymi pochodzącymi ze szpiku kostnego MSC i PVAT. W stanie nieindukowanym nie jest widoczna akumulacja lipidów.Jest to przeciwieństwo stanu indukowanego pokazanego po barwieniu obojętnych lipidów za pomocą Oil Red O. Chociaż stopień zróżnicowania w ludzkich komórkach pochodzących z PVAT aorty jest bardziej solidny, oba źródła komórek ludzkich wykazały zdolność do różnicowania się dla linii adipogennej. Protokół różnicowania osteogennego zastosowano w przypadku komórek MSC pochodzących ze szpiku kostnego i komórek pochodzących z PVAT. Komórki nieindukowane nie barwiły się czerwienią alizarynową.Po protokole różnicowania osteogennego, u ludzkich MSCs rozwinęły się zwapniałe guzki, które zabarwiały się czerwienią alizarynową, podczas gdy ludzkie komórki PVAT aorty nie. Komórki pochodzące zarówno z MSCs ludzkiego szpiku kostnego, jak i ludzkiego PVAT wykazywały cechy charakterystyczne dla różnicowania chondrogennego z obfitą akumulacją kolagenu w mikromasie. Mikromasa jest utworzona z ludzkich MSCs szpiku kostnego i komórek pochodzących z PVAT w aorcie, które również wykazywały obfite nagromadzenie glikozaminoglikanów, na co wskazuje barwienie Alcian Blue.Morfologicznie wykryto struktury podobne do luk z komórkami znajdującymi się w jamach otoczonych odkładaniem się kolagenu. Bardzo ważne jest, aby drobno zmielić okołonaczyniową tkankę tłuszczową przed dysocjacją enzymatyczną i zapewnić odpowiednią gęstość komórek dla każdego testu różnicowania linii. Zgodnie z tą procedurą, ilościowy PCR w połączeniu z western blot i cytometrią przepływową powinien być stosowany w celu scharakteryzowania specyficznych dla linii markerów zróżnicowanych komórek progenitorowych z okołonaczyniowych źródeł tkanki tłuszczowej i szpiku kostnego.Dzięki tej technice możemy zacząć rozumieć mechanizmy regulujące rozrost i dysfunkcję okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej podczas otyłości oraz implikacje, jakie komórki progenitorowe mają na funkcjonowanie naczyń krwionośnych i choroby sercowo-naczyniowe.

differentiation-capacity-human-aortic-perivascular-adipose-progenitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Protokół pozwala na generowanie czystej populacji adipocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kwas retinowy służy do różnicowania iPSC w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które są wykorzystywane do produkcji adipocytów. Następnie stosuje się podejście sortowania oparte na barwieniu czerwienią nilową w celu uzyskania czystych adipocytów.

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Tutaj opisujemy izolację, hodowlę i indukcję adipogenną preadipocytów pochodzących z frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej okołoaortalnej, co pozwala na badanie funkcji okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej i jej związku z komórkami naczyniowymi.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna preadipocytów pochodzących z frakcji zrębu naczyniowego z mysiej tkanki tłuszczowej okołooortalnej

Poznaj potencjał różnicowania okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty. Metoda ta umożliwia izolację wielopotencjalnych komórek i ich analizę w kontekście chorób układu krążenia oraz medycyny regeneracyjnej.

Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Przeglądaj więcej filmów