Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych
September 28th, 2019
Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.
Techniki zautomatyzowanej mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym. Etap ograniczający szybkość w procesie prowadzącym do wygenerowania biologicznych modeli trójwymiarowych przetwarzania obrazu. Nasz protokół zawiera wskazówki krok po kroku, jak uzyskać gęstszą konstrukcję objętości obrazu w ciągu zaledwie kilku dni.
W połączeniu z podejściem do pomiarów ilościowych z wykorzystaniem modeli trójwymiarowych. Dzięki tej technice struktura 3D tkanek, innych niż mózg, może być potencjalnie analizowana w celu zidentyfikowania zaburzeń strukturalnych typowych dla niektórych chorób i ulepszenia strategii diagnostycznej. Segmentacja to żmudny krok.
Poświęć trochę czasu, aby uczynić go tak dokładnym, jak to tylko możliwe, aby uniknąć korekty złej segmentacji i konieczności ponownego uruchomienia całego procesu. Projekt oprogramowania czasami nie jest zbyt przyjazny dla użytkownika. Dlatego ważne jest, aby zobaczyć początek prac nad segmentacją.
Otwórz stos obrazów, przeciągając i upuszczając plik natywny z mikroskopu zawierającego stos lub kup, przeciągając i upuszczając folder zawierający cały stos obrazów do okna oprogramowania Po otwarciu stosu przejdź do obrazu, właściwości, aby upewnić się, że rozmiar wokseli został odczytany z metadanych. Przekształć obraz w 8-bitowy, klikając obraz, wpisz i wybierz 8-bitowy. Jeśli oryginalny stos został pozyskany jako różne płytki, zastosuj zszywanie w TrakEM2.
W razie potrzeby utwórz nowy projekt TrakEM2 przy użyciu nowych, TrakEM2 przy użyciu interesujących Cię struktur segmentów osadzonych funkcji TrakEM2. W lepkim TrakEM2 kliknij prawym przyciskiem myszy"na cokolwiek"pod oknem szablonu i wybierz dodaj nową listę obszarów podrzędnych"Przeciągnij i upuść wszystko"do folderu, pod obiektami projektu"i jedno cokolwiek"pojawi się tam. Przeciągnij i upuść, listę obszarów"od szablonu do czegokolwiek"znajduje się pod obiektami projektu"W rzutni stosu obrazów wybierz przestrzeń Z"za pomocą kursora.
Pojawi się lista obszarów z unikalnym numerem identyfikacyjnym. Wybierz pędzelnarzędzie na górze i użyj myszy, aby podzielić strukturę na segmenty, wypełniając jej cytozol na całym stosie Z. Eksportuj podzieloną na segmenty masę, która ma być używana w Ilastik jako ziarno do rzeźbienia.
Aby to zrobić, kliknij prawym przyciskiem myszy'albo na obiekcie listy obszarów na liście Z-space, albo na masce w porcie widoku, i wybierz eksport'lista obszarów'jako etykiety T-I-F. W zależności od rozdzielczości potrzebnej do dalszych rekonstrukcji, zmniejsz rozmiar piksela stosu obrazów, zmniejszając próbkowanie. Weź pod uwagę wymagania dotyczące pamięci oprogramowania, które będzie używane do segmentacji i rekonstrukcji.
Ilastik obsługuje stosy do pięciuset pikseli w formacie X-Y. Weź pod uwagę, minimalny rozmiar, który obiekty nadal wydają się rozpoznawalne, a tym samym mogą być segmentowane. Użyj obrazu"Dostosuj rozmiar"Aby zwiększyć kontrast i pomóc w segmentacji, można zastosować filtr maski wyostrzającej, aby membrany były wyraźniejsze.
Użyj procesu'filtry'nieostra masa'Eksportuj stos obrazów jako pojedyncze obrazy'do dalszego przetwarzania w oprogramowaniu do segmentacji, za pomocą pliku'zapisz jako'sekwencja obrazów'i wybierz TIFF'format. W głównym lepkim Ilastik wybierz moduł rzeźbienia. Załaduj stos obrazów, używając opcji dodaj nowy'i dodaj pojedynczy wolumin 3D/4D z sekwencji'Wybierz cały katalog'i wybierz folder zawierający stos obrazów zapisany jako pojedyncze pliki'U dołu nowego okna, w którym dostępne są opcje ładowania obrazów, upewnij się, że masz Z"wybrany.
W kolejnych krokach wszystkie operacje i przyciski można znaleźć po lewej stronie głównego lepkiego oprogramowania. Na karcie przetwarzania wstępnego użyj już zaznaczonych opcji standardowych. Używaj jasnych linii"bogate filtry" i utrzymuj skalę filtra na poziomie 1.600.
Ten obwód może być później modyfikowany. Po zakończeniu przetwarzania wstępnego wybierz następną stronę z menu rozwijanego modułu etykietowania. Domyślnie obecny jest jeden obiekt i jedno tło.
Wybierz ziarno obiektu, klikając na nie i narysuj linię na szczycie interesującej Cię struktury. Następnie wybierz ziarno tła i narysuj jedną lub wiele linii na zewnątrz obiektu, który chcesz zrekonstruować. Teraz kliknij segment'i czekać.
W zależności od mocy komputera i wielkości stosu, segmentacja może trwać od kilku sekund do kilku godzin. Gdy to zrobisz, na szczycie segmentowanej struktury powinna pojawić się półprzezroczysta maska podkreślająca segmentację. Przewiń stos, aby sprawdzić segmentację.
Segmentacja może nie być dokładna, jeśli nie podąża za strukturą zainteresowania lub wylewa się z niej. Skoryguj wszelkie rozlania, umieszczając ziarno tła na rozlanej segmentacji. I dodaj ziarno obiektu do niezrekonstruowanego segmentu obiektu zainteresowania.
Dokładna korekta wizualna segmentacji za pomocą Ilastik może być żmudna, ale ważne jest, aby upewnić się, że eksportowane obiekty nie zawierają artefaktów. Jeśli segmentacja nadal nie jest poprawna, spróbuj zmodyfikować ją za pomocą parametru bias, który zwiększy lub zmniejszy liczbę akceptowanych niepewnych sklasyfikowanych pikseli. Domyślnie jego wartość to 0,95.
Zmniejsz go, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się lub zwiększyć, jeśli segmentacja jest zbyt konserwatywna. Inną możliwością jest kliknięcie na przetwarzanie wstępne" i zmodyfikowanie rozmiaru filtra. Zwiększenie wartości zminimalizuje efekty przypominające szum soli i pieprzu, ale także sprawi, że membrany będą bardziej rozmyte, a mniejsze szczegóły trudniejsze do wykrycia.
Może to ograniczyć rozprzestrzenianie się wirusa. Powtarzaj tyle, ile to konieczne, o ile wszystkie pożądane obiekty zostały podzielone na segmenty. Gdy obiekt zostanie ukończony, przejdź do segmentu'i kliknij zapisz bieżący obiekt'Pojawią się dwa nowe nasiona, aby rozpocząć segmentację nowego obiektu.
Abstrakcyjne pomiary powierzchni od razu jako pliki O-B-J, klikając eksport wszystkich siatek'Aby zwizualizować ręcznie segmentowane modele w 3D w TrakEM2, kliknij prawym przyciskiem myszy listę obszarów, a następnie wybierz pokaż w 3D'Wyższa wartość wygeneruje siatkę o niższej rozdzielczości. Na koniec wyeksportuj siatkę 3D jako WaveFront O-B-J", wybierając z menu plik"eksport powierzchni"WaveFront"Po zainstalowaniu zestawu narzędzi neuro morph zgodnie z opisem w protokole tekstowym otwórz blendera. Zaimportuj obiekty za pomocą importu wsadowego neuro morph, klikając import obiektów'w menu sceny, aby zaimportować wiele obiektów jednocześnie.
Upewnij się, że aktywowałeś, użyj ponownie siatki i gładkiego cieniowania. Wybierz interesujący Cię obiekt z outlinera i zmodyfikuj Octree Depth funkcji re-mesh w menu modyfikatora. Pracuj iteracyjnie, aby zminimalizować liczbę wierzchołków i uniknąć utraty szczegółów w rozdzielczości i poprawnej morfologii.
Podczas zmiany głębokości Octree siatka na głównej lepkości odpowiednio się zmieni. Po zakończeniu kliknij Zastosuj, aby sfinalizować proces. Przejdź do menu neuromorfozy na lewym panelu i użyj interakcji stosu obrazów narzędzia do nakładania obrazów, aby załadować stos obrazów.
Upewnij się, że wpisałeś fizyczny rozmiar stosu obrazów dla X, Y i Z i wybierz ścieżkę stosu, klikając źródło Z.X i Y są płaszczyznami ortogonalnymi. Są one opcjonalne i zostaną załadowane tylko wtedy, gdy użytkownik wstawi prawidłową ścieżkę. Następnie wybierz siatkę w porcie widoku, klikając ją prawym przyciskiem myszy.
Wejdź w tryb edycji, naciskając Tab, wybierz jeden lub więcej wierzchołków za pomocą kliknięcia prawym przyciskiem myszy, a na koniec kliknij pokaż obraz w wierzchołku. Jedna lub więcej płaszczyzn cięcia z mikrofotografią pojawi się nałożona na wierzch siatki. Wybierz płaszczyznę cięcia, klikając ją prawym przyciskiem myszy.
Następnie naciśnij Y i przewiń po modelu 3D za pomocą przewijania myszy. Może to być również wykorzystane jako metoda korekty. Pokazano tutaj segmentację i rekonstrukcję przy użyciu TrakEM2 i Ilastik.
Lepki TrakEM2 jest pokazany z obiektami ręcznie podzielonymi na segmenty na czerwono. Wyeksportowana maska może być następnie wykorzystana jako dane wejściowe do półautomatycznej segmentacji. Z Ilastik maski można dalej eksportować do TrakEM2 w celu ręcznej korekty.
Maski można eksportować jako trójkątne siatki 3D, aby odsłonić zrekonstruowane struktury. W tym przykładzie cztery neurony, astrocyty, mikroglej i perycyty zostały zrekonstruowane przy użyciu tego procesu. Przedstawiono analizę 3D zrekonstruowanych morfologii przy użyciu niestandardowych narzędzi.
Oto izotropowy wolumin obrazu z zestawu danych skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów. Gęsta rekonstrukcja tych danych ujawnia aksony, proces astrocytowy i dendryty. Ta mikrofotografia przedstawia przykłady celów do oznaczania ilościowego, takich jak synapsy i granulki glikogenu astrocytowego.
Maska z tej mikrofotografii pokazuje rozkład granulek glikogenu wokół synaps. Pokazano tutaj graficzną ilustrację danych wejściowych i wyjściowych wizualizacji graficznej modelu absorpcji mleczanu pochodzącego z glikogenu lub GLAM'Tutaj użytkownik jest pokazany w zestawie słuchawkowym rzeczywistości wirtualnej lub V-R podczas pracy nad gęstą rekonstrukcją na podstawie zestawu danych skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów. Z podzbioru neurytów można zaobserwować wciągającą scenę V-R.
Zielony laser wskazuje na szczyt GLAM. ma podstawowe znaczenie, ponieważ określa prawidłowy rozmiar eksportowanych obiektów 3D i określa, że jego wymiary odzwierciedlają jego rzeczywisty rozmiar. Koncepcja obrazowania przekroju szeregowego, segmentacji obrazowania i konstrukcji 3D jest dość stara.
Odkrycie technicznego przyspieszenia prowadzi do postępów w kolektomii w przeglądzie podręczników anatomii. Chociaż metoda została opracowana do badań mózgu w mikroskopii elektronowej, można ją uogólnić na dowolną technikę mikroskopową generującą dane Co więcej, każdy rodzaj techniki obrazowania 3D może skorzystać z takich technik segmentacji i budowy obrazowania. W tym skany C-T i M-R-I.
Przegląd
To badanie przedstawia potok przeznaczony do segmentacji dużych zestawów danych mikroskopii elektronowej w celu rekonstrukcji morfologii całych komórek w 3D. Spersonalizowane oprogramowanie umożliwia analizę jakościową i ilościową poprzez wykorzystanie rzeczywistości wirtualnej do poprawy wizualizacji i rozwiązywania problemów z zasłanianiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikroskopia elektronowa
- Rekonstrukcja 3D
Tło
- Wykorzystano zautomatyzowane techniki mikroskopii elektronowej w ciągłych przekrojach.
- Potok ma na celu skrócenie czasu potrzebnego na generowanie biologicznych modeli 3D.
- Segmentacja jest krytyczna, ponieważ niedokładności mogą prowadzić do rozległych przeróbek.
- Wykorzystanie spersonalizowanego oprogramowania może zwiększyć możliwości analizy.
Cel badania
- Opracować uproszczony protokół rekonstrukcji gęstych objętości obrazów.
- Umożliwić jakościową i ilościową ocenę w 3D.
- Analizować 3D struktury różnych tkanek w celu wykrycia upośledzeń związanych z chorobą.
Stosowane metody
- Badanie wykorzystuje mikroskopię elektronową do tworzenia zestawów danych objętościowych.
- Metody koncentrują się na dokładnej segmentacji struktur komórkowych w dużych stosie obrazów przy użyciu różnych narzędzi oprogramowania.
- Etapy przetwarzania obrazu obejmują przygotowanie stosu obrazów, segmentację i eksportowanie obiektów do wizualizacji 3D.
- Krytyczne kroki obejmują zapewnienie dokładności rozmiaru vokseli, stosowanie filtrów i ręczne korektowanie segmentacji.
Główne wyniki
- Zautomatyzowany potok z powodzeniem rekonstruuje dokładne modele 3D z dużych zestawów danych.
- Metody segmentacji wykazały się wytrzymałością w obsłudze złożonych struktur.
- Weryfikacja wizualna jest niezbędna, aby zapewnić niezawodność zrekonstruowanych obiektów.
- Zastosowanie to ma potencjalne zastosowania w diagnozowaniu upośledzeń strukturalnych w różnych tkankach.
Wnioski
- To badanie dostarcza podstawowej metodologii dokładnej segmentacji dużych danych mikroskopii elektronowej.
- Opisany potok poprawia efektywność analizy złożonych struktur biologicznych, co może zwiększyć strategie diagnostyczne.
- Implikacje obejmują poszerzenie naszego rozumienia struktury tkanek w kontekście zdrowia i choroby.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of cellular ultrastructure enables mechanistic de-risking in target validation by resolving ambiguities in morphology-function relationships. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative structural readouts that inform hypothesis testing and pathway clarification. Integration of virtual reality analysis enhances reproducibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detailed visualization of glial and neuronal ultrastructure.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by clarifying complex morphologies that may be misinterpreted in 2D.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by identifying structural impairments indicative of disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating dense, accurate 3D models of tissue architecture.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative measurements derived from reconstructed structures.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by enabling reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through analysis of structural impairments in axons, dendrites, and astrocytic processes.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking 3D morphology to functional hypotheses like the glycogen-derived lactate absorption model (GLAM).
- Strategic Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling visualization of synaptic targets and glycogen granule distribution for biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through quantitative 3D structural analysis.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing ultrastructural patterns unresolved in 2D imaging.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative outputs such as synapse and glycogen granule quantification.
- Analytics: Highlights measurements and readouts that help teams compare conditions, including structural impairments typical of certain diseases.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment via visualization of disease-related structural changes in neural and glial cells.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across microscopy techniques including CT and MRI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in glial and neuronal morphology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 3D model generation from electron microscopy datasets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative 3D morphology analysis.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy, image segmentation, and 3D visualization software such as TrakEM2, Ilastik, and Blender.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include high-resolution EM imaging systems and computational resources for processing large image stacks.
- Cross-team standardization requirements for segmentation protocols and proofreading to ensure consistency across users and sites.
- Adaptation considerations across model systems, as the method can be generalized to any microscopy technique generating 3D data.
- Practical limitations include the tedious nature of segmentation and the need for accurate voxel size calibration to avoid measurement artifacts.
