Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Nasz protokół umożliwia pomiar wykrywania i dyskryminacji lotnych zapachów za pomocą panelu receptorów zapachowych. Metoda ta otwiera możliwość opracowania biosensorów opartych na receptorach zapachowych. Technika ta umożliwia monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego na cząsteczkach odorantu w fazie gazowej.

Wypełnia lukę między podejściem in vitro i in vivo. Metoda ta może być wykorzystana do zrozumienia kinetyki zdarzeń, które prowadzą do percepcji zapachu, w tym roli enzymów metabolicznych błony śluzowej. Na początek przygotuj M10 i M10 PSF zgodnie z rękopisem.

Komórki są hodowane w 10 mililitrach M10 PSF w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Obserwuj naczynie hodowlane pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Gdy osiągnie 100% konfluencji, podziel komórki na niższe stężenie, zasysając pożywkę i delikatnie myjąc komórki 10 mililitrami PBS.

Następnie odessać PBS i dodać trzy mililitry trypsyny-EDTA. Pozwól mu reagować przez około minutę, aż komórki oddzielą się od naczynia. Dodaj pięć mililitrów M10, aby dezaktywować trypsynę, i pipetuj w górę iw dół, aby odłączyć komórki przymocowane do naczynia.

Przenieś osiem mililitrów zawiesiny komórkowej z naczynia do 15-mililitrowej probówki i odwiruj probówkę w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach M10 PSF, pipetując w górę iw dół, aby rozbić dowolną masę komórkową. Unikaj tworzenia bąbelków w tubie.

Aby uzyskać 20% zbieżność komórek, dodaj dziewięć mililitrów M10 PSF do nowego naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 1000 milimetrów i przenieś jeden mililitr zawieszonego roztworu komórkowego. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. To danie, ustawione na 20% zbiegu, osiągnie 100% zbiegu w ciągu 48 godzin.

Umieść naczynie pod mikroskopem z kontrastem fazowym w celu obserwacji. Weź 1/10 szalki do hodowli 100% konfluencji komórek. Odessać pożywkę i delikatnie umyć komórki 10 mililitrami PBS.

Następnie potraktuj komórki trypsyną-EDTA i M10, odwiruj i ponownie potraktuj M10 PSF, jak poprzednio wykonano. Aby uzyskać jedną 96-dołkową płytkę, dodaj 500 mikrolitrów z pięciu mililitrów zawieszonych komórek do 5,5 mililitra świeżego M10 PSF. Wymieszaj komórki i M10 PSF bez generowania pęcherzyków powietrza.

Odpipetować 50 mikrolitrów rozcieńczonych zawieszonych komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Najpierw umieść 96-dołkową płytkę hodowaną przez noc pod mikroskopem z kontrastem fazowym, obserwuj zbieg komórek i upewnij się, że wynosi od 30% do 50%Przygotuj pierwszą mieszankę transfekcyjną w 1,5-mililitrowej probówce, która zawiera plazmidy wspólne dla całej płytki zgodnie z rękopisem.

Rho-pCi jest kontrolą ujemną z pustym wektorem, a Olfr1377 jest kontrolą pozytywną, o której wiadomo, że reaguje na badany acetofenon. Podzielić mieszaninę na dwie mieszaniny transfekcyjne zawierające jeden z plazmidów kontrolnych. Przygotować drugą mieszankę transfekcyjną zawierającą 500 mikrolitrów MEM i 20 mikrolitrów odczynnika lipofektaminy 2000.

Dodaj połowę drugiej mieszanki do każdego zbiornika i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj pięć mililitrów M10 na jedną płytkę 96-dołkową.

Dodaj 2,5 mililitra do każdego zbiornika i delikatnie wymieszaj. Zastąp M10 PSF w poprzednio platerowanej płytce 96-dołkowej 50 mikrolitrami końcowego podłoża transfekcyjnego. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie otwórz drzwiczki luminometru i włóż rurkę podłączoną do pompy próżniowej. Odkurz komorę luminometru przez noc. Po transfekcji obserwuj 96-dołkową płytkę pod mikroskopem kontrastu fazowego, aby zapewnić zbieżność komórek między 60% a 100%Przygotuj roztwór stymulacyjny zbilansowanego roztworu soli Hanka zawierający 10 milimoli HEPES i pięć milimoli D-glukozy.

Usunąć pożywkę transfekcyjną z płytki 96-dołkowej i umyć komórki, dodając 50 mikrolitrów świeżego roztworu stymulacyjnego do każdej studzienki. Aby rozcieńczyć roztwór odczynnika GloSensor cAMP, odpipetuj 2,75 mililitra roztworu stymulacyjnego do pięciomililitrowej probówki i dodaj 75 mikrolitrów roztworu odczynnika cAMP. Usuń roztwór stymulacyjny ze studzienek i dodaj 25 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu odczynnika cAMP do każdej studzienki.

Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej w ciemnym i bezwonnym środowisku przez dwie godziny. Najpierw rozcieńczyć acetofenon nawaniający do 1% w 10 mililitrach oleju mineralnego i zakryć rurkę. Przed końcem czasu inkubacji odczynnika cAMP dodaj 25 mikrolitrów roztworu nawaniacza do każdej studzienki na nowej 96-dołkowej płytce.

Następnie umieść tę płytkę nawaniającą w komorze luminometru na pięć minut, aby zrównoważyć komorę z lotnymi cząsteczkami nawaniania. Ustaw luminometr tak, aby rejestrował luminescencję z zerowym sekundowym opóźnieniem podczas 20 cykli 90-sekundowego pomiaru na płytce, z 0.7 sekundy przerwy między cyklami. Tuż przed odczytaniem tabliczki wyjmij płytkę nawaniającą z komory.

Do 96-dołkowej płytki zawierającej transfekowane komórki dodaj 25 mikrolitrów środka zapachowego w przestrzeni między studzienkami i szybko włóż płytkę z powrotem do komory. Rozpocznij pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut. Po pomiarze luminescencji usuń pozostały nawaniacz z wnętrza luminometru, odkurzając substancje zapachowe w komorze odczytu przez co najmniej dwie godziny.

Wymień na świeże powietrze, wysyłając sprężone powietrze przez pięć minut przed inkubacją następnego środka zapachowego, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego lotnymi zapachami. Aby rozpocząć analizę danych, wyeksportuj dane z oprogramowania luminometru. Uśrednij powtórzenia tego samego operatora operacyjnego dla każdego czasu nagrywania.

Aby obliczyć znormalizowaną odpowiedź OR na dowolną ostateczną kontrolę, podziel pustą wartość uśrednioną wektora na wartość uśrednioną OR przy każdym czasie nagrywania. Znormalizuj każdą odpowiedź OR na ich podstawową aktywność, dzieląc uśrednioną odpowiedź OR w zerowej sekundzie na każdą odpowiedź w czasie nagrywania. Aby uzyskać pojedynczą wartość odpowiedzi OR dla krzywej każdego OR, zsumuj wszystkie wartości luminescencji w każdym czasie nagrywania dla każdego OR w celu uzyskania obszaru pod krzywą.

W tym eksperymencie aktywację OR myszy w czasie rzeczywistym po bodźcu zapachowym oparów była monitorowana przez 20 cykli pomiarowych. Zastosowano kontrolę pustego wektora, aby upewnić się, że aktywność badanych ORs wywołana przez nawanianie jest specyficzna. Dane dla każdego dołka zostały najpierw znormalizowane do wartości uśrednionej dla kontroli pustego wektora dla każdego cyklu.

Następnie, aby porównać odpowiedzi różnych OR, dane znormalizowano do poziomów podstawowej aktywności OR w tym teście. Wartości pojedynczej aktywacji dla każdego OR obliczono, obliczając powierzchnię pod krzywą dla każdego OR poprzez zsumowanie wartości emisji ze wszystkich cykli pomiarowych. Dodatkowo, reakcje zależne od dawki mogą być mierzone za pomocą zwiększających się dawek substancji zapachowych.

Zarejestrowano odpowiedź Olfr1377 na stymulację acetofenonem w pięciu stężeniach. Tylko trzy wyższe stężenia były w stanie aktywować Olfr1377. Stymulacja czysto złożona wykazuje tendencję do zmniejszania odpowiedzi OR w czasie, prawdopodobnie z powodu toksyczności komórek.

Na tym etapie należy dodać rozcieńczony środek zapachowy między studzienką i być przygotowanym do szybkiego rozpoczęcia nagrywania płyty. Czas między dodaniem środka zapachowego a monitorowaniem powinien być zminimalizowany i stały między dwoma eksperymentami. Komórki w przedsionkach są materiałem niebezpiecznym biologicznie, dlatego należy pamiętać o wyrzuceniu komórek do odpowiednich aptek.