Name: Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę monitorowania aktywacji receptorów zapachowych w fazie gazowej w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie kinetyki percepcji zapachów oraz rozwój biosensorów opartych na receptorach zapachowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z NIH (DC014423 i DC016224) oraz Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych Obrony RealNose Project. YF pozostał na Uniwersytecie Duke'a dzięki wsparciu finansowemu z JSPS Program for Advancing Strategic International Networks to Accelerate the Circulation of Talented Researchers (R2801). Dziękujemy Sahar Kaleem za redakcję rękopisu.

1. Hodowla komórek Hana3A
<ol>
	<li>Przygotować M10 (minimalna niezbędna pożywka (MEM) plus 10 % v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i M10PSF (M10 plus 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B).</li>
	<li>Hodować komórki w 10 ml M10PSF w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2 %).</li>
	<li>Dziel komórki co 2 dni w stosunku 20%: gdy zaobserwuje się 100% zbieżność komórek (około 1,1 x 107 komórek) pod mikroskopem z kontrastem fazowym, zaaspiruj pożywkę i delikatnie umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 3 ml 0,05% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 0,48 mM). Pozostaw na około 1 minutę, aż komórki oddzielą się od płytki.</li>
	<li>Dodać 5 ml M10, aby dezaktywować trypsynę i ostatecznie odłączyć komórki nadal przyczepione do płytki, pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Przenieść objętość (8 ml) do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml M10PSF, pipetując w górę i w dół, aby rozbić dowolną masę komórkową. Unikaj tworzenia bąbelków w tubie.</li>
	<li>Przenieść 1 ml roztworu zawieszonych komórek do nowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i dodać 9 ml świeżego M10PSF. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do transfekcji
<ol>
	<li>Oceń konfluencję lub liczbę komórek, obserwując je pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Na jedną płytkę potrzebna jest co najmniej 10% konfluencja (około 1,1 x 106 komórek).</li>
	<li>Odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki 10 ml PBS. Odessać PBS i dodać 3 ml EDTA. Pozostaw na około 1 minutę w temperaturze pokojowej, aż komórki oddzielą się od płytki.</li>
	<li>Dodać 5 ml M10, aby dezaktywować trypsynę i ostatecznie odłączyć komórki nadal przyczepione do płytki, pipetując w górę iw dół. Przenieść objętość (8 ml) do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml M10PSF, pipetując w górę iw dół, aby rozbić dowolną masę komórkową. Unikaj tworzenia bąbelków w tubie.</li>
	<li>W zależności od liczby płytek do transfekcji, należy przenieść odpowiednią ilość komórek do zbiornika o odpowiedniej objętości M10PSF. Jedną 96-dołkową płytkę należy posiać 1/10 1/10 100% zlewającej się płytki o średnicy 100 mm (około 1,1 x 106 komórek) rozcieńczonej w M10PSF, aby osiągnąć całkowitą objętość 6 ml. Na jedną 96-dołkową płytkę, zaczynając od 100% zbieżności 100 mm, dodaj 500 μl z 5 ml zawieszonych komórek do 5,5 ml świeżego M10PSF. Wymieszaj ogniwa i M10PSF bez generowania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl zawieszonych komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .</li>
</ol>
3. Transfekcja plazmidu
<ol>
	<li>Obserwuj 96-dołkową płytkę pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić zbieżność komórek między 30% a 50%.</li>
	<li>Przygotować pierwszą mieszankę transfekcyjną, która zawiera plazmidy wspólne dla całej płytki (RTP1S, OR i białko Glosensor, patrz tabela materiałów) zgodnie z objętościami w tabeli 1. Zwróć uwagę, że ilość OR oznaczonych Rho powinna być podzielona przez liczbę OR, jeśli kilka ORs. 
	nuta: Zdecydowanie zalecamy dodanie do planu eksperymentu kontroli ujemnej z pustym wektorem (tutaj Rho-pCI) i dowolnej kontroli pozytywnej (LUB znanej z reakcji na badany zapach).</li>
	<li>Przygotować drugą mieszaninę do transfekcji zawierającą 500 μl MEM i 20 μl odczynnika Lipofectamine 2000 (ważne dla jednej płytki 96-dołkowej, patrz tabela materiałów). Dodaj drugą mieszankę do pierwszej i delikatnie mieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 5 ml M10 i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Zastąp M10PSF w poprzednio platerowanej płytce 96-dołkowej 50 μl końcowego podłoża do transfekcji. Inkubować w inkubatorze nastawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 i odkurzać komorę luminometru przez noc, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 6.</li>
</ol>
4. Inkubacja substratu
<ol>
	<li>Obserwuj 96-dołkową płytkę pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić zbieżność komórek między 60% a 100%. Przygotować roztwór stymulacyjny Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka (HBSS) zawierający 10 mM kwasu hydroksyetylopiperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 5 mM D-glukozy.</li>
	<li>Rozcieńczyć 75 μl roztworu odczynnika cAMP (patrz tabela materiałów) do 2,75 ml roztworu stymulującego. Usunąć pożywkę transfekcyjną z płytki 96-dołkowej i umyć komórki, dodając 50 μl świeżego roztworu stymulacyjnego do każdego dołka.</li>
	<li>Usunąć roztwór stymulujący i dodać 25 μl roztworu odczynnika cAMP przygotowanego w kroku 4.2 do każdego dołka. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej w ciemnym i wolnym od zapachów środowisku (na przykład w czystej, pustej szufladzie z dala od chemikaliów lub źródeł nawania) przez 2 godziny.</li>
</ol>
5. Stymulacja odorantem
<ol>
	<li>Najpierw zrównoważ komorę luminometru lotnymi cząsteczkami zapachu. Rozcieńczyć środek zapachowy do pożądanego stężenia w 10 ml oleju mineralnego (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 2A). Przed końcem czasu inkubacji odczynnika cAMP dodać 25 μl roztworu nawaniacza do nowej 96-dołkowej płytki (nie tej, na której znajdują się komórki). Inkubuj tę płytkę nawaniającą w temperaturze pokojowej w komorze luminometru przez 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) (tutaj nie jest wymagany zapis luminometru).</li>
	<li>Ustaw luminometr tak, aby rejestrował luminescencję z 0 s opóźnienia podczas 20 cykli pomiaru płytki przez 90 s z 0,7 s przerwy między cyklami.</li>
	<li>Tuż przed odczytaniem tabliczki wyjmij płytkę nawaniającą z komory. Dodaj 25 μl środka zapachowego między studzienki 96-dołkowej płytki zawierającej komórki (nie dodawaj środka nawaniającego do studzienek zawierających komórki) i szybko rozpocznij pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
6. Usuwanie resztek substancji zapachowej wewnątrz luminometru
<ol>
	<li>Otwórz drzwiczki luminometru. Włóż rurkę podłączoną do pompy próżniowej.</li>
	<li>Odkurzanie substancji zapachowych w komorze odczytu w dużym stopniu (co najmniej 2 godziny, najlepiej przez noc) między dwoma nawaniaczami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego lotnych zapachów z jednego eksperymentu do drugiego. Wymień na świeże powietrze, wysyłając sprężone powietrze przez 5 minut przed inkubacją następnego środka zapachowego.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksportuj dane z oprogramowania luminometru.</li>
	<li>Uśrednij powtórzenia tego samego operatora operacyjnego dla każdego czasu nagrywania. Oblicz znormalizowaną odpowiedź OR na dowolną ewentualną kontrolę (np. Pusty wektor, <silna klasa="xfig">Rysunek 3A i sekcja wyników reprezentatywnych), dzieląc uśrednioną wartość kontrolną na wartość uśrednioną OR przy każdym czasie rejestracji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B i sekcja wyników reprezentatywnych).</li>
	<li>Znormalizuj odpowiedź każdego OR na ich podstawową aktywność, dzieląc uśrednioną odpowiedź OR po 0 s na każdą odpowiedź w czasie rejestracji (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C i sekcja reprezentatywnych wyników).</li>
	<li>Oblicz pole pod krzywą każdego OR, aby uzyskać pojedynczą wartość odpowiedzi OR. Aby to zrobić, zsumuj wszystkie wartości luminescencji każdego czasu nagrywania dla każdego OR.</li>
</ol>

W dniu 27 października 2016 r. Y.F., H. K. i H.M. dokonali zgłoszenia patentowego dotyczącego tej pracy.

Percepcja zapachu jest zasadniczo zależna od aktywacji OR. W związku z tym zrozumienie ich funkcjonalności jest konieczne, aby złamać złożone mechanizmy, których mózg używa do postrzegania swojego niestabilnego środowiska chemicznego. Zrozumienie tego procesu było jednak utrudnione ze względu na trudności w ustaleniu solidnej metody badania przesiewowego repertuaru sali operacyjnej pod kątem funkcjonalności pod kątem obecności substancji zapachowych in vitro. Powierzchnia komórki i heterologiczna ekspresja OR zo...

Zmysł węchu pozwala zwierzętom lądowym na interakcję z ich zmiennym środowiskiem chemicznym w celu kierowania zachowaniami i emocjami. Zasadniczo proces wykrywania zapachu rozpoczyna się od pierwszej interakcji cząsteczek odorantu z układem węchowym, na poziomie receptorów zapachowych (OR)1. U ssaków OR są indywidualnie wyrażane w węchowych neuronach czuciowych (OSN) zlokalizowanych w nabłonku węchowym2. Należą one do rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), a dokładniej do podrodziny rodopsynopodobnej (zwanej również klasą A). OR łączą się ze stymulującym białkiem GG olf, którego aktywacja prowadzi do produkcji cAMP, a następnie do otwarcia cyklicznych kanałów bramkowanych nukleotydami i wytworzenia potencjałów czynnościowych. Przyjmuje się, że percepcja zapachu opiera się na określonym wzorcu aktywowanych ORs3,4, a zatem rozpoznawanie zapachu odbywa się zgodnie ze schematem kodowania kombinatorycznego, w którym jeden OR może być aktywowany przez zestaw substancji zapachowych, a jeden środek zapachowy może aktywować kombinację OR. Poprzez takie kodowanie kombinatoryczne postuluje się, że organizmy mogą wykrywać i rozróżniać niezliczone cząsteczki lotnych zapachów. Jednym z kluczy do zrozumienia, w jaki sposób odbierane są zapachy, jest zrozumienie, w jaki sposób i które sale operacyjne są aktywowane przez dany zapach.
W próbie wyjaśnienia interakcji między odorantem a OR, testy funkcjonalne in vitro odegrały istotną rolę. Identyfikacja agonistycznych ligandów zapachowych dla sierocych OR (de-sierotyzacja) była bardzo aktywną dziedziną przez ostatnie dwadzieścia lat, dzięki zastosowaniu różnych testów funkcjonalnych in vitro, ex vivo i in vivo5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Systemy testów in vitro najlepiej nadają się do szczegółowej charakterystyki funkcjonalnej OR, w tym do identyfikacji domen funkcjonalnych i krytycznych reszt OR, a także do potencjalnych zastosowań inżynieryjnych. Jednak dalszy rozwój cennych systemów in vitro dla OR był wyzwaniem, częściowo ze względu na trudności z hodowlą OSN i funkcjonalną ekspresją OR w komórkach heterologicznych. Pierwszym wyzwaniem było opracowanie protokołów, które pozwoliłyby na ekspresję funkcjonalnych OR na powierzchni komórki w mapowaniu interakcji odorant-OR. Wiele niezależnych grup stosowało różne podejścia5,6,7,8,9,10,11,12,14,18,19,20. Jedno z najwcześniejszych osiągnięć zostało dokonane przez Krautwurst i wsp., którzy oznaczyli N-koniec OR skróconą sekwencją rodopsyny (Rho-tag) i zaobserwowali poprawę ekspresji powierzchniowej w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK)13. Wariacje wprowadzone do znacznika dołączonego do sekwencji OR to nadal badana ścieżka w celu ulepszenia wyrażenia i funkcjonalności OR19,21. Następnie Saito i wsp. zidentyfikowali białko transportujące receptor 1 (RTP1) i RTP2, które ułatwiają transport OR. 22 Krótsza wersja RTP1, zwana RTP1S, również okazała się jeszcze bardziej skuteczna niż oryginalna białko23. Opracowanie linii komórkowej (Hana3A), która stabilnie eksprymuje Golf, REEP1, RTP1 i RTP2 24, w połączeniu z zastosowaniem cyklicznych reporterów monofosforanu adenozyny (cAMP), umożliwiło identyfikację interakcji odorant-OR. Mechanizm, za pomocą którego rodzina białek RTP promuje ekspresję OR na powierzchni komórki, pozostaje do ustalenia.
Jednym z zastrzeżeń tych uznanych metod jest to, że polegają one na stymulacji odorantów w fazie ciekłej, co oznacza, że substancje zapachowe są wstępnie rozpuszczone w pożywce stymulującej i stymulują komórki poprzez wymianę pożywki. Jest to bardzo odmienne od warunków fizjologicznych, w których cząsteczki zapachu docierają do nabłonka węchowego w fazie gazowej i aktywują OR poprzez rozpuszczenie w błonie śluzowej nosa. Aby bardziej zbliżyć się do fizjologicznie istotnej ekspozycji na bodziec, Sanz i in.20 zaproponowali test oparty na stymulacji parą poprzez zastosowanie kropli roztworu odorantu, która miała zostać zawieszona pod wewnętrzną powierzchnią folii z tworzywa sztucznego umieszczonej na górze studzienek komórkowych. Rejestrowali reakcje wapnia, monitorując intensywność fluorescencji. Metoda ta była pierwszą, w której zastosowano stymulację nawaniacza w fazie powietrznej, ale nie pozwalała na duże badanie przesiewowe aktywacji OR.
Tutaj opracowaliśmy nową metodę, która umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji OR in vitro poprzez stymulację odorantu fazy gazowej za pomocą testu Glosensor (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ten test był wcześniej używany w kontekście stymulacji płynnymi nazapachami18,19,25,26,27,28,29,30,31. Komora monitorująca luminometru jest najpierw równoważona z odparowanym naodorantem przed odczytem tabliczki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Cząsteczki odorantu są następnie solwatowane w buforze, kąpiąc komórki Hana3A wyrażające interesujący nas OR, RTP1S i białka Glosensor (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B). Jeśli substancja zapachowa jest agonistą OR, sala operacyjna przełączy się na aktywowaną konformację i zwiąże Golf, aktywując cyklazę adenylową (AC), co ostatecznie spowoduje wzrost poziomu cAMP. Ten rosnący cAMP zwiąże się i aktywuje białko Glosensor, aby wytworzyć luminescencję katalizującą lucyferynę. Ta luminescencja jest następnie rejestrowana przez luminometr i umożliwia monitorowanie aktywacji sali operacyjnej. Metoda ta cieszy się dużym zainteresowaniem w kontekście desierotyzacji sali operacyjnej, ponieważ zbliża systemy in vitro do naturalnej percepcji zapachów.

<table><tbody><tr><td>0,05 % trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0,05% Trypsyna - EDTA (1x), czerwień fenolowa - przechowywać w temperaturze 4&deg; </td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych C 100 mm&nbsp;</td><td>Naczynie do</td> hodowli komórkowych BD Falcon <td>353003</td><td>100 mm x 20 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td>Probówki stożkowe 17 mm x 120 mm</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3843</td><td>96 dołk, z pokrywką LE biała z przezroczystym dnem Polistyren pokryty poli-D-lizyną</td></tr><tr><td>Amfoterycyna</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Amfoterycyna B 250 &mikro; g/ml - przechowywać w temperaturze 4 & st.; </td></tr><tr><td>Wirówka</td> C <td>Jouan</td><td>C312</td><td>Wirówka z wahliwym wirnikiem kubełkowym do 15 ml</td></tr><tr><td>Klasa II Typ A / B3 dymu</td><td>NUAIRE</td><td>NU-407-500</td><td>dymu do hodowli komórek</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Płodowa surowica bydlęca - przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>GloSensor cAMP Odczynnik</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td>GloSensor cAMP Odczynnik luminescencyjny białkowy substrat - przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Inkubator 37 &deg; C; 5 % CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-604</td><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Odczynnik Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcji 1 mg/ml - przechowywać w temperaturze 4 & st.; </td></tr><tr><td>C Luminometr POLARstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>wycofany z produkcji</td><td>96-dołkowy czytnik płytek luminescencyjnych</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Rozpuszczalnik do nawaniaczy - przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Corning cellgro</td><td>10-010-CV</td><td>Minimum Essential Medium Orzeł z Earle' s sole & L-glutamina - przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny stabilizowany 10 000 j. penicyliny i 10 mg streptomycyny - przechowywać w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>pGlosensor</td><td>Promega</td><td>E2301</td><td>pGloSensor-22F plazmid białka luminescencyjnego cAMP - przechowywać w temperaturze 4 stopni; </td></tr><tr><td>C Mikroskop kontrastu fazowego</td><td>Leica</td><td>090-131.001</td><td>mikroskop kontrastowy fazowy z obiektywami x4, x10, x20</td></tr><tr><td>RTP1S</td><td>H. Matsunami</td><td></td> <td>lab-100 ng / &micro; Plazmid L - przechowywać w temperaturze 4 & deg; Z</td></tr></tbody></table>

monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Percepcja węchowa zaczyna się od interakcji substancji zapachowych z receptorami zapachowymi (OR) wyrażonymi przez węchowe neurony czuciowe (OSN). Rozpoznawanie zapachu odbywa się zgodnie ze schematem kodowania kombinatorycznego, w którym jeden OR może być aktywowany przez zestaw substancji zapachowych, a jeden środek zapachowy może aktywować kombinację OR. Dzięki takiemu kodowaniu kombinatorycznemu organizmy mogą wykrywać i rozróżniać niezliczone cząsteczki lotnego zapachu. W ten sposób zapach w danym stężeniu można opisać za pomocą wzorca aktywacji OR, który jest specyficzny dla każdego zapachu. W tym sensie złamanie mechanizmów, których mózg używa do postrzegania zapachu, wymaga zrozumienia interakcji odorant-OR. Właśnie dlatego społeczność węchowa jest zaangażowana w "de-sieroceństwo" tych receptorów. Konwencjonalne systemy in vitro stosowane do identyfikacji interakcji nawaniacz-OR wykorzystywały inkubację pożywki komórkowej z nawaniaczem, co różni się od naturalnego wykrywania zapachów poprzez rozpuszczanie par w błonie śluzowej nosa przed interakcją z OR. W tym miejscu opisujemy nową metodę, która pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji sali operacyjnej za pomocą środków nawaniających w fazie gazowej. Nasza metoda polega na pomiarze uwalniania cAMP przez luminescencję za pomocą testu Glosensor. Wypełnia on obecne luki między podejściami in vivo i in vitro oraz stanowi podstawę dla biomimetycznego czujnika substancji lotnych.

Przeprowadzono screening odpowiedzi trzech mysich receptorów węchowych (OR), Olfr746, Olfr124 i Olfr1093, wykorzystując stymulację oparami cynamaldehydu (Rysunek 3). Jednocześnie zastosowano kontrolę z pustym wektorem (Rho-pCI), aby upewnić się, że aktywności indukowane odorantem w testowanych receptorach OR były specyficzne (Rysunek 3A). Aktywację receptorów OR w czasie rzeczywistym po stymulacji oparami odoranta monitorowano przez 20 cykli pom...

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Nasz protokół umożliwia pomiar wykrywania i dyskryminacji lotnych zapachów za pomocą panelu receptorów zapachowych. Metoda ta otwiera możliwość opracowania biosensorów opartych na receptorach zapachowych. Technika ta umożliwia monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego na cząsteczkach odorantu w fazie gazowej.Wypełnia lukę między podejściem in vitro i in vivo. Metoda ta może być wykorzystana do zrozumienia kinetyki zdarzeń, które prowadzą do percepcji zapachu, w tym roli enzymów metabolicznych błony śluzowej. Na początek przygotuj M10 i M10 PSF zgodnie z rękopisem.Komórki są hodowane w 10 mililitrach M10 PSF w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Obserwuj naczynie hodowlane pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Gdy osiągnie 100% konfluencji, podziel komórki na niższe stężenie, zasysając pożywkę i delikatnie myjąc komórki 10 mililitrami PBS.Następnie odessać PBS i dodać trzy mililitry trypsyny-EDTA. Pozwól mu reagować przez około minutę, aż komórki oddzielą się od naczynia. Dodaj pięć mililitrów M10, aby dezaktywować trypsynę, i pipetuj w górę iw dół, aby odłączyć komórki przymocowane do naczynia.Przenieś osiem mililitrów zawiesiny

real-time-vitro-monitoring-odorant-receptor-activation-an-odorant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Niniejszy artykuł przedstawia protokoły obrazowania wrodzonych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencji flawoprotein w celu mapowania aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opolpacha u myszy.

Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Ten film demonstruje protokół pomiaru aktywacji receptora zapachowego w transfekowanych komórkach za pomocą cyklicznego biosensora adenozynomonofosforanu (cAMP) i detekcji luminescencji. Metoda ta jest stosowana do badania interakcji receptor-ligand i szlaków sygnałowych w neuronach węchowych.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego za pomocą cyklicznego testu monofosforanu adenozyny w czasie rzeczywistym

Źródło: de March, C. A. et. al., Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora odorantu przez nawaniacz w fazie gazowej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia metodę monitorowania aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym w rekombinowanych komórkach ssaków za pomocą pomiaru luminescencji. Wiązanie odorantu wyzwala aktywację białka G i produkcję cAMP, aktywując białka glosensor, które emitują luminescencję po związaniu substratu, zapewniając ilościową miarę...

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji receptorów zapachowych w komórkach rekombinowanych

Pionowy olfaktometr labiryntu w kształcie litery T jest opisany do badania reakcji behawioralnej stawonogów. Olfaktometr pozwala eksperymentatorowi zmierzyć wybory dokonywane przez osoby badane pod wpływem dwóch potencjalnych pól zapachowych. Za pomocą tego urządzenia można zmierzyć zarówno przyciąganie, jak i odpychanie od substancji zapachowych.

Pionowy test wyboru labiryntu w kształcie litery T dla reakcji stawonogów na substancje zapachowe

Wzorce aktywacji receptorów węchowych kodują tożsamość zapachu, ale brak opublikowanych danych identyfikujących ligandy zapachowe dla receptorów węchowych ssaków utrudnia opracowanie kompleksowego modelu kodowania zapachu. Protokół ten opisuje metodę ułatwiającą wysokoprzepustową identyfikację ligandów receptorów węchowych i ilościowe określenie aktywacji receptora.

Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Scharakteryzowanie funkcji receptorów zapachowych jest nieodzowną częścią procesu desierotyzacji. Opisujemy metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Poznaj metodę monitorowania aktywacji receptorów zapachowych w fazie gazowej w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie kinetyki percepcji zapachów oraz rozwój biosensorów opartych na receptorach zapachowych.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Przeglądaj więcej filmów