Name: Radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych Kluczowe cechy in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj radioterapię kultur organotypowych gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych. Ta metoda pozwala ocenić interakcje komórkowe oraz szybko przesiewać związki terapeutyczne przywracające uszkodzenia tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez pilotażowe fundusze dostarczone przez University of Arizona Office of Research and Discovery oraz National Institutes of Health (R01 DE023534) dla Kirsten Limesand. Grant szkoleniowy w dziedzinie biologii nowotworów w T32CA009213 roku zapewnił wsparcie stypendialne dla Wen Yu Wonga. Autorzy pragną podziękować M. Rice'owi za jego cenny wkład techniczny.

1. Przygotowanie wibratomu
<ol>
	<li>Spryskaj odłączane elementy wibratomu, w tym tackę buforową, nasadkę ostrza, formę blokową agarozy i folię laboratoryjną 70% etanolem, a następnie sterylizuj UV przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Umieść i zabezpiecz dodatkowy arkusz folii laboratoryjnej nad tacą buforową, aby zapobiec wpadaniu lodu.</li>
	<li>Napełnij komorę lodową kruszonym lodem, usuń folię laboratoryjną z tacki buforowej i napełnij tackę buforową 100 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS) uzupełnionego 1% penicyliną-streptomycyną-ampicyliną (PSA).</li>
	<li>Umieść żyletkę ze stali nierdzewnej w uchwycie ostrza. Użyj śrubokręta, aby dokręcić/poluzować i zmienić kąt ostrza.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki tkanki w bloku agarozowym i cięcie za pomocą wibratomu
<ol>
	<li>Autoklaw wszystkie niezbędne narzędzia do preparowania i cięcia, w tym kleszcze, nożyczki i pędzle.</li>
	<li>Przygotuj 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w sterylnym 1x PBS i kuchence mikrofalowej, aż agaroza rozpuści się w roztworze. Upewnij się, że roztwór nie wykipia i od czasu do czasu obracaj butelkę, aby wymieszać. 
	UWAGA: Zapobiegaj krzepnięciu niskotopliwej agarozy, przechowując ją w ciepłej łaźni wodnej. Niskotopliwa agaroza staje się płynna w temperaturze 37 °C i twardnieje w temperaturze 25 °C. Jednakże łaźnia wodna powinna mieć temperaturę poniżej 40 °C, aby agaroza mogła otoczyć tkankę w temperaturze fizjologicznej.</li>
	<li>Wyizoluj gruczoły ślinowe i umieść wypreparowaną tkankę w 2 ml lodowatego 1x PBS uzupełnionego 1% PSA w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 30 mm.</li>
	<li>Za pomocą autoklawowanych kleszczy usuń gruczoły ślinowe z 1x PBS + 1% roztworu PSA i umieść na dnie formy do zatapiania. Napełnij formę płynem 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby przykryć tkankę.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy dopasuj tkankę do środka bloku i ustaw gruczoł ślinowy w odpowiedniej płaszczyźnie. Najlepsze przekroje poprzeczne dla gruczołów podżuchwowych i ślinianek przyusznych znajdują się w płaszczyźnie pionowej.</li>
	<li>Umieść blok agarozy na lodzie na 10 minut, aby stwardniał.</li>
	<li>Ostrożnie przesuń żyletkę wokół zewnętrznej krawędzi agarozy, aby się poluzowała i pozwól, aby blok wysunął się na folię laboratoryjną sterylizowaną promieniami UV z kroku 1.1.</li>
	<li>Użyj żyletki, aby wyciąć pudełko z agarozą zawierające gruczoł ślinowy. Upewnij się, że płaszczyzna przekroju jest prosta i równoległa do przeciwnej strony bloku (powierzchni, która zostanie przyklejona). Ponieważ agaroza nie nacieka tkanki, nie należy odcinać zbyt dużej ilości agarozy wokół tkanki, aby tkanka była dobrze podparta.</li>
	<li>Użyj kleju superglue, aby przymocować blok do powierzchni cięcia.</li>
	<li>Przekrój o grubości 50 μm lub 90 μm za pomocą wibratomu z prędkością 0,075 mm/s i częstotliwością 100 Hz. 
	UWAGA: Ustawienie wibratomu na najwyższą częstotliwość i najniższą prędkość ostrza zapewnia najbardziej optymalne plastry.</li>
	<li>Zbierz skrawki w 24-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym ~ 1 ml lodowatego PBS na studzienkę za pomocą autoklawowanego pędzla z naturalnego włosia, umieszczając pędzel w 70% etanolu między kolekcjami plastrów, aby zachować sterylność.</li>
</ol>
3. Sekcje hodowlane
<ol>
	<li>Autoklaw z mikroszpatułką i kleszczami.</li>
	<li>Przygotuj podstawowe pożywki do hodowli wibratomu z płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub bez: pożywki DMEM/F12 uzupełnione 1% PSA, 5 μg/ml transferyny, 1,1 μM hydrokortyzonu, 0,1 μM kwasu retinowego, 5 μg/ml insuliny, 80 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 5 mM L-glutaminy, 50 μg/ml siarczanu gentamycyny i mieszaniny pierwiastków śladowych 10 μL/mL. Dodaj odpowiednią ilość FBS, aby uzyskać roztwory 0%, 2,5%, 5,0% lub 10%.</li>
	<li>Przed sekcją dodać 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki i umieścić wkładkę membranową o średnicy 12 mm i wielkości porów 0,4 μm w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Pożywka powinna dotrzeć do dna membrany, aby utworzyć granicę faz ciecz-powietrze dla hodowli.</li>
	<li>Delikatnie ułożyć skrawki śliny na wkładce membranowej za pomocą mikroszpatułki i hodowli w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 i 95% atmosferze powietrza.
	<ol>
		<li>Dodawać około 300 μl pożywki do hodowli pierwotnej do studzienki i kilka kropli do wkładek membranowych (około 40 μl) co drugi dzień lub w razie potrzeby. Prawidłowa hodowla wykazała, że komórki są w stanie przetrwać i być utrzymywane do 30 dni ex vivo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Napromienianie odcinków gruczołów ślinowych
<ol>
	<li>Traktować sekcje pojedynczą dawką promieniowania (5 Gy) za pomocą promiennika kobaltu-60 (lub równoważnego).
	<ol>
		<li>Transportuj sekcje do naświetlacza za pomocą zakrytego styropianowego pojemnika, aby uniknąć wahań temperatury. Ponadto podczas transportu z powrotem do inkubatora laboratoryjnego należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że pożywka nie rozpryskuje się na pokrywie hodowli i nie spowoduje zanieczyszczenia.</li>
		<li>Umieść 24-dołkową płytkę zawierającą skrawki gruczołów ślinowych w odległości 80 cm od źródła promieniowania, w środku pola promieniowania o wymiarach 32" x 32". Obliczenia dawki promieniowania i odpowiadający im czas w promienniku będą się różnić w zależności od instrumentu i rozpadu kobaltu-60.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuować monitorowanie i hodowlę tych sekcji zgodnie z opisem w punkcie 3.</li>
</ol>
5. Barwienie żywotności
<ol>
	<li>Odessać stare podłoża i umyć plastry dwukrotnie sterylnym, wstępnie podgrzanym 1x PBS.</li>
	<li>Skrawki bejcowania barwnikiem błękitu trypanowego.
	<ol>
		<li>Użyj mikroszpatułki, aby przesunąć plasterek z kultury na szklane szkiełko.</li>
		<li>Do plastra wibratomu dodać 0,4% roztwór błękitu trypanowego o objętości wystarczającej do pokrycia tkanki (10–20 μl).</li>
		<li>Inkubuj plastry w temperaturze pokojowej (RT) w błękitu trypanowym przez 1-2 minuty, aby barwnik wniknął w tkankę. Komórki niezdolne do życia zostaną zabarwione na niebiesko, a komórki żywotne będą niewybarwione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybarwić skrawki kalceiną, barwnikiem AM z żywych komórek.
	<ol>
		<li>Dodać wystarczającą objętość plamy, aby pokryć sekcję w jednym dołku płytki 24-dołkowej (200–300 μl).</li>
		<li>Inkubuj plastry w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić penetrację barwnika.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij sekcję ze studni i umieść na szklanym szkiełku. Zamontuj plasterki za pomocą 1 kropli nośnika montażowego.</li>
		<li>Wycinki obrazu pod mikroskopem fluorescencyjnym przy długościach fal wzbudzenia/emisji 488 nm i 515 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Sekcje wibratomu barwiące przeciwciała
UWAGA: Poniżej znajduje się ogólny protokół barwienia przeciwciał specyficzny dla Ki-67; jednak ten protokół może być stosowany z dowolnym przeciwciałem. Wszystkie prania odbywają się w temperaturze RT, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>W wielodołkowym naczyniu do hodowli tkankowych odessać pożywkę i przemyć co najmniej 2x sterylnym 1x PBS.</li>
	<li>Utrwalić skrawki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać 4% PFA i przemyć 3x PBT [1x PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% Triton X-100]. 
	UWAGA: Sekcje można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C i barwić w późniejszym czasie. Maksymalny testowany czas przechowywania w tym manuskrypcie wynosił 3 tygodnie. Dłuższy czas przechowywania będzie musiał zostać zoptymalizowany przez indywidualnego użytkownika, jeśli jest to pożądane.</li>
	<li>Przepuszczalność skrawków przy użyciu 0,3% Triton X-100 w 1x PBS przez 30 min. 
	UWAGA: Ten krok można zmodyfikować i zoptymalizować pod kątem specyficznego barwienia przeciwciał i przepuszczalności.</li>
	<li>Odpipetować roztwór przepuszczalny.</li>
	<li>Pierz plastry 3x przez 5 minut z 1x PBS, 1% BSA i 0,1% Triton X-100 (PBT).</li>
	<li>Zablokuj plastry środkiem blokującym z 1% normalną surowicą kozią na 1 godzinę.</li>
	<li>Plastry myć 3x przez 5 min z PBT.</li>
	<li>Plastry inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z 500 μl króliczego przeciwciała monoklonalnego anty-Ki67 rozcieńczonego w 1% BSA w 1x PBS. 
	UWAGA: W przypadku barwienia falloidyną pomiń krok 6.9 i postępuj zgodnie z protokołem dla konkretnej użytej falloidyny. W przypadku barwienia przeciwbarwiącego DNA przejdź do kroku 6.15.</li>
	<li>Aspiracyjne królicze przeciwciało monoklonalne anty-Ki67.</li>
	<li>Umyj plastry 6x przez 5 minut w 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować plastry w 500 μl fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego zgodnego z przeciwciałem anty-Ki67 rozcieńczonym w 1% BSA w 1x PBS w temperaturze RT przez 1,5 godziny pod przykryciem od światła. 
	UWAGA: W oparciu o zastosowane przeciwciało drugorzędowe, czas inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym może być dodatkowo zoptymalizowany przez indywidualnego użytkownika. Ponadto przeciwciało drugorzędowe jest wrażliwe na światło. Wszystkie kolejne prania należy wykonywać w ciemności.</li>
	<li>Aspirować przeciwciało wtórne.</li>
	<li>Myj plastry przez 3x przez 5 min z 1x PBS.</li>
	<li>Plastry myć przez 5 minut w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Plastry można wybarwić przeciwstawnie za pomocą DAPI (1 μg/ml) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Plastry myć (raz) przez 5 minut w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Zamontuj plastry za pomocą jednej kropli (~40 μL) podłoża montażowego. Aby uniknąć nadmiaru pęcherzyków powietrza, powoli umieść szkiełko nakrywkowe na nośniku montażowym na szkiełku, zaczynając od kąta 45°.
	<ol>
		<li>Aby zapobiec zgnieceniu grubych odcinków szkiełkiem nakrywkowym, zamontuj każdy plasterek za pomocą przekładki. Przekładkę można utworzyć, umieszczając obręcz smaru próżniowego w kwadracie wokół odcinka tkanki.</li>
		<li>Podczas układania szkiełka nakrywkowego krawędzie szkiełka nakrywkowego można uszczelnić smarem próżniowym. Dociśnij kciukiem krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby mocno przykleić je do szkiełka. Alternatywnie, uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Obrazowanie sekcji wibratomu
<ol>
	<li>Wyobraź sobie poplamione szkiełka w ciągu 5 dni od barwienia.</li>
	<li>Uzyskać przekroje optyczne barwionych wycinków wibratomu za pomocą mikroskopu konfokalnego. Za pomocą mikroskopu konfokalnego można uzyskać stos osi Z w określonym rozmiarze kroku lub wykonać indywidualne zdjęcia w zależności od eksperymentalnego projektu użytkownika. Obrazy można oglądać na dowolnym ekranie komputera po pobraniu konfokalnym. 
	UWAGA: Ze względu na grubość warstw wibratomu zaleca się użycie mikroskopu konfokalnego lub lunety z funkcją z-stack do wizualizacji szczegółów w próbkach. Do zdjęć wykorzystanych w tym rękopisie użyto obiektywu olejnego o powiększeniu 63x; Może to być jednak dostosowywane i dalej modyfikowane przez indywidualnego użytkownika i konkretny zastosowany zakres. Zastosowano zalecaną rozdzielczość pikseli dla każdego obiektywu i współczynnika powiększenia przy przyjętym próbkowaniu Nyquista na poziomie 2,5 piksela w X i Y dla najmniejszej struktury rozdzielalnej optycznie. Jednak niektórzy komentatorzy sugerują 2,3 piksela, podczas gdy inni sugerują 2,8 piksela. Więcej informacji na temat wykonywania tych obliczeń można znaleźć w Podręczniku Biologicznej Mikroskopii Konfokalnej22.</li>
</ol>

<ol><li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+and+dental+management+related+to+radiation+therapy+for+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Canadian+Dental+Association%22%5BJournal%5D)">Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer.</a> Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).</li>
<li>Nguyen, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+of+life+following+chemoradiation+and+postoperative+radiation+for+locally+advanced+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer.</a> Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).</li>
<li>Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malnutrition+and+cachexia+in+patients+with+head+and+neck+cancer+treated+with+%28chemo%29radiotherapy.+Reports+of+Practical+Oncology+and+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Greatpoland+Cancer+Center+in+Poznan%CC%81+and+Polish+Society+of+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy.</a> Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).</li>
<li>Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+salivary+glands+to+radiation%3A+from+animal+models+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies.</a> Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).</li>
<li>Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+and+Physics%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li>
<li>Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+salivary+gland+acinar+cells+spontaneously+form+three-dimensional+structures+and+change+the+protein+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+growth+factors+promotes+salisphere+formation+from+irradiated+parotid+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands.</a> PLoS ONE. 13 (3), e0193942(2018).</li>
<li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170(2003).</li>
<li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK%2C+ERK%2C+PI3K%2FAkt%2C+and+NF-%CE%BAB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li>
<li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+expression+and+NF-%CE%BAB+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+salivary+gland+dysfunction+results+from+p53-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biololgy%2C+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).</li>
<li>Mitchell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF1+activates+cell+cycle+arrest+following+irradiation+by+reducing+binding%5BTitle%5D)+AND+%22of+DeltaNp63+to+the+p21+promoter.+Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding.</a> of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).</li>
<li>Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Salivary+Gland+Function+after+Stem+Cell+Transplantation+in+Irradiated+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands.</a> PLoS ONE. 3 (4), (2008).</li>
<li>Warner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+form+and+function+in+organotypic+slices+of+the+adult+mouse+parotid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture+of+human+salivary+glands%3A+the+slice+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model.</a> Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).</li>
<li>Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+analysis+of+hepatic+porcine+and+murine+brain+tissue+slices+obtained+with+a+vibratome%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ+-+The+Journal+of+Life+and+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome.</a> PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+and+Physics%22%5BJournal%5D)">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li>
<li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417(2010).</li>
<li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347(2018).</li>
<li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li>
<li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li>
<li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li>
<li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonula+occludens-1%2C+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Jounral+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li>
<li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition%2C+Disorganized+Cell+Junctions%2C+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniach gruczołów ślinowych wykorzystano szereg modeli hodowlanych, w tym unieśmiertelnione kultury 2D, pierwotne kultury 2D, kultury salisfery 3D i hodowle narządów 3D z eksplantatów embrionalnych, aby ustalić pytania dotyczące podstawowej biologii i fizjologii. Te modele hodowlane dostarczyły wnikliwych informacji na temat różnorodnych pytań badawczych i nadal będą ważnymi narzędziami w badaniach śliny. Ograniczenia tych modeli hodowli obejmują modulację aktywności p53 podczas unieśmiertelnienia, przejściową żywotn...

Prawidłowe funkcjonowanie gruczołów ślinowych jest niezbędne dla zdrowia jamy ustnej i ulega zmianie po leczeniu raka głowy i szyi za pomocą radioterapii1. W 2017 roku w Stanach Zjednoczonych zgłoszono prawie 50 000 nowych przypadków raka głowy i szyi2. Ze względu na uszkadzające tkanki i często nieodwracalne skutki radioterapii dla otaczających normalnych tkanek, takich jak gruczoły ślinowe, pacjenci często odczuwają poważne skutki uboczne i obniżoną jakość życia2,3,4. Częste powikłania spowodowane uszkodzeniem popromiennym objawiają się takimi objawami, jak kserostomia (subiektywne odczucie suchości w ustach), próchnica, upośledzona zdolność żucia i połykania, zaburzenia mowy i upośledzone mikrobiomy jamy ustnej2,3,4. Objawy te łącznie mogą prowadzić do niedożywienia i upośledzenia przeżywalności u osób dotkniętych chorobą5. Chociaż dysfunkcja gruczołów ślinowych w tej populacji została dobrze udokumentowana, mechanizmy leżące u podstaw uszkodzenia komórek groniastych zostały zakwestionowane, a integracja między różnymi modelami zwierzęcymi jest niewielka6,7.
Obecne metody badania funkcji gruczołów ślinowych i uszkodzeń wywołanych promieniowaniem obejmują wykorzystanie modeli in vivo, unieśmiertelnionych linii komórkowych, dwuwymiarowych (2-D) pierwotnych hodowli komórkowych i trójwymiarowych (3-D) hodowli salisphere8,9,10,11,12. Tradycyjnie, modele hodowli komórkowych z unieśmiertelnionych linii komórkowych i kultur 2D obejmują jednowarstwowe komórki hodowane na płaskich powierzchniach i są cenne dla szybkich, łatwych i opłacalnych eksperymentów. Jednak warunki sztucznej hodowli komórkowej mogą zmieniać stan różnicowania i reakcje fizjologiczne komórek wystawionych na różne warunki, a wyniki często nie przekładają się na modele całego organizmu14,15. Ponadto unieśmiertelnione hodowle komórkowe wymagają modulacji aktywności p53, która ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi gruczołów ślinowych na uszkodzenie DNA16,17.
3-D kultury salisphere są wzbogacone o komórki macierzyste i progenitorowe we wczesnych punktach czasowych hodowli i były przydatne do zrozumienia radiowrażliwości tego podzbioru komórek gruczołów ślinowych9,18. Krytycznym ograniczeniem wszystkich tych modeli hodowlanych jest to, że są one nieskuteczne w wizualizacji trójwymiarowej struktury gruczołu ślinowego, w tym macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i interakcji komórka-komórka na różnych warstwach, które są kluczowe w modulowaniu wydzielania śliny15. Potrzeba metody, która obejmuje zachowanie tkanki jako całości, ale może być również manipulowana w warunkach laboratoryjnych w celu zbadania efektów leczenia, jest niezbędna do dalszego odkrywania mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji gruczołów ślinowych wywołanej promieniowaniem.
Sekcja i hodowla żywych tkanek została wcześniej udokumentowana19,20 i jest często używane do badania interakcji mózg-tkanka21. W poprzednich badaniach tkankę ślinianki ślinianki przyusznej (PAR) myszy wycięto na około 50 μm i hodowano przez okres do 48 godzin, a następnie przeprowadzono analizę żywotności, śmierci komórki i funkcji19. Su i wsp. (2016) rozszerzył tę metodologię, hodując ludzkie gruczoły podżuchwowe (SMG) podzielone na 35 μm lub 50 μm przez 14 dni20. Proponowana metoda stanowi postęp w tym sensie, że obejmuje zarówno ślinianki przyuszne, jak i podżuchwowe podzielone na 50 μm i 90 μm oraz ocenę kultur przez 30 dni. Zdolność do cięcia tkanek o różnych grubościach jest ważna w ocenie interakcji komórka-komórka i komórka-ECM, które są istotne dla procesów komórkowych, w tym polaryzacji wierzchołkowo-podstawno-bocznej i unerwienia do wydzielania. Ponadto wycinki gruczołów ślinowych zostały napromieniowane podczas hodowli, aby określić wykonalność tego modelu hodowli do badania uszkodzeń gruczołów ślinowych wywołanych promieniowaniem.
Celem tego protokołu organotypowej hodowli gruczołów ślinowych jest ocena maksymalnego czasu żywotności hodowli i scharakteryzowanie zmian komórkowych po radioterapii ex vivo. Aby określić maksymalny czas, w którym odcinki są zdolne do życia po sekcji, przeprowadzono barwienie błękitem trypanowym, barwienie żywych komórek i barwienie immunohistochemiczne pod kątem śmierci komórki. Mikroskopia konfokalna i barwienie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do oceny określonych populacji komórek, struktur morfologicznych i poziomów proliferacji. Hodowle wycinków tkanek zostały również wystawione na działanie promieniowania jonizującego w celu określenia wpływu promieniowania na różne markery w tym modelu 3D. Indukcję śmierci komórki, rozerwanie cytoszkieletu, utratę markerów różnicowania i proliferację kompensacyjną w napromieniowanych hodowlach ex vivo porównano z wcześniejszymi badaniami modeli in vivo. Metodologia ta zapewnia środki do badania roli interakcji komórka-komórka po uszkodzeniu popromiennym i zapewnia model eksperymentalny do skutecznej oceny skuteczności interwencji terapeutycznych (manipulacji genami lub środków farmakologicznych), które mogą być mniej odpowiednie dla modeli in vivo.

<table><tbody><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td>Vibratome do cięcia</td></tr><tr><td>Dwukrawędziowe żyletki ze stali nierdzewnej</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Niskotopliwy</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Amfoterycyna B</td><td>Lonza</td><td>17-745H</td><td></td></tr><tr><td>PSA 24-dołkowa płytka</td><td>CellTreat</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Loctite UltraGel Control Superglue</td><td>Loctite</td><td>N/A</td><td>Zakupiony w sklepie z narzędziami</td></tr><tr><td>Naturalny czerwony sobolowy okrągły pędzel</td><td>Princeton Art & Brush Co</td><td>7400R-2</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1676045</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8158-100mg</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatmine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pierwiastki śladowe MP</td><td>Biomedicals</td><td>ICN1676549</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 Media</td><td>Corning</td><td>150-90-CV</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórek milikomórkowych Millipore</td><td>Sigma</td><td>PICM01250</td><td>12 mm, wielkość porów 0,4 μm dla płytki 24-dołkowej</td></tr><tr><td>0,4% Zestaw</td> do obrazowania komórek Trypan Blue <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD (488/570)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R37601</td><td>Używany tylko składnik barwnika LIVE</td></tr> Technologia <tr><td>sygnalizacji komórkowej</td><td>przeciwciała anty-Ki-67</td><td>9129S Technologia sygnalizacji</td><td></td></tr><tr><td>komórkowej</td><td>przeciwciał anty-E-kadheryny</td><td>3195S</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciała anty-rozszczepionego kaspazy-3</td><td></td><td>9661L</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SMA</td><td>Przeciwciało anty-SMA Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-amylazy</td><td>Przeciwciało anty-CD31 Sigma-Aldrich</td><td>A8273</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TUBB3</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5568S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Alexa Fluor 594 Zestaw do etykietowania</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A20185</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd Prills</td><td>Fisher Scientific</td><td>5027632</td><td></td></tr><tr><td>Nowa Anglia Środek blokujący jądrowy</td><td>Perkin Elmer</td><td>2346249</td><td>Nie jest już sprzedawany</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083S</td> Prolong Gold Antiblade Nośniki <td></td></tr><tr><td>montażowe</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Leica SPSII Spectral Confocal</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A Do</td><td>obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami Leica</td><td>DMIL Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do teleterapii Cobalt-60</td><td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Amac Box, wyczyść</td><td>Sklep kontenerowy</td><td>60140</td><td>Forma blokowa agarozy</td></tr></tbody></table>

radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych kluczowe cechy in vivo

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Ślinotok i kserostomia powodują przewlekłe powikłania doustne, które obniżają jakość życia u pacjentów z rakiem głowy i szyi, którzy są leczeni radioterapią. Eksperymentalne podejścia do zrozumienia mechanizmów dysfunkcji i odbudowy gruczołów ślinowych koncentrowały się na modelach in vivo, które są utrudnione ze względu na niezdolność do systematycznego badania przesiewowego kandydatów terapeutycznych i skuteczność zdolności transfekcji do manipulowania określonymi genami. Celem tego protokołu organotypowej hodowli gruczołów ślinowych jest ocena maksymalnego czasu żywotności hodowli i scharakteryzowanie zmian komórkowych po radioterapii ex vivo. Wykorzystaliśmy barwienie immunofluorescencyjne i mikroskopię konfokalną, aby określić, kiedy określone populacje komórek i markery są obecne w 30-dniowym okresie hodowli. Ponadto markery komórkowe zgłoszone wcześniej w modelach promieniowania in vivo są oceniane w kulturach, które są napromieniane ex vivo. Idąc dalej, metoda ta jest atrakcyjną platformą do szybkiej oceny ex vivo odpowiedzi mysich i ludzkich tkanek gruczołów ślinowych na środki terapeutyczne poprawiające funkcję śliny.

Podstawowe hodowle 2-D hoduje się w pożywkach uzupełnionych płodową surowicą bydlęcą (FBS), natomiast podstawowe hodowle 3-D salisfer typowo hoduje się w warunkach bezsurowiczych10,11. Ponadto w dwóch poprzednich badaniach wykorzystujących hodowle z wibrotomu z gruczołów ślinowych, skrawki hodowano w pożywkach uzupełnionych o 0% lub 10% FBS19,20. Skrawki podżuchwowe myszy ...

Wykorzystanie trójwymiarowych kultur organotypowych do wizualizacji morfologii i funkcjonalnych markerów gruczołów ślinowych może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia tkanek po promieniowaniu. Opisano tutaj protokół cięcia, hodowli, napromieniania, barwienia i obrazowania skrawków gruczołów ślinowych o grubości 50–90 μm przed i po ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

Radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych Kluczowe cechy in vivo

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Protokół ten umożliwia ocenę interakcji między komórkami między różnymi typami komórek w tkance oraz manipulacje molekularne i farmakologiczne ex vivo, które byłyby mniej wykonalne in vivo. Główną zaletą tej techniki jest wydłużony okres czasu, w którym te skrawki tkanek mogą być utrzymywane w hodowli, co pozwala na ich ocenę w późniejszych punktach czasowych. Technika ta pozwoli na szybsze badania przesiewowe związków terapeutycznych w celu skorygowania uszkodzenia gruczołów ślinowych i prawdopodobnie zmniejszy liczbę myszy wykorzystywanych w tych badaniach.Planujemy wykorzystać tę technikę, aby zrozumieć odpowiedź gruczołów ślinowych na radioterapię w pośrednich punktach czasowych oraz włączać i wyłączać geny w określonych odstępach czasu. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest sekcja tkanek i zapobieganie utracie skrawków tkanek podczas etapów hodowli i barwienia. Przed rozpoczęciem zabiegu należy zdezynfekować odłączane elementy wibratomu 70% etanolem, a następnie sterylizować UV przez co najmniej 30 minut.Zabezpiecz dodatkowy arkusz folii laboratoryjnej na tacy buforowej, aby zapobiec wpadaniu lodu, i napełnij komorę lodową pokruszonym lodem. Usuń folię laboratoryjną z ta

radiation-treatment-organotypic-cultures-from-submandibular-parotid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano zoptymalizowany protokół izolacji komórek macierzystych z gruczołu ślinowego myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne oraz umożliwia izolację salisfer zawierających komórki o charakterystyce komórek macierzystych.

Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Opisano technikę genetycznego manipulowania komórkami nabłonkowymi w całych embrionalnych gruczołach podżuchwowych myszy (SMG) hodowanych ex vivo za pomocą transferu genów wirusowych. Metoda ta wykorzystuje wrodzoną zdolność nabłonka SMG i mezenchymy do spontanicznej rekombinacji po oddzieleniu i zakażeniu zaczątków nabłonka wektorami adenowirusowymi.

Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Niedoczynność gruczołów ślinowych, główny niekorzystny efekt radioterapii głowy i szyi obniża jakość życia pacjenta. Wykazanie skuteczności nowych terapii na modelach zwierzęcych jest warunkiem wstępnym przed przejściem klinicznym. Protokół ten opisuje podawanie wsteczne i miejscowe napromienianie gruczołów podżuchwowych szczura.

Zaporodowe wkraplanie gruczołu podżuchwowego i miejscowe frakcjonowane napromienianie w szczurzym modelu niedoczynności śliny

Opisujemy protokół chirurgicznego odsłaniania i stabilizacji mysiego podżuchwowego gruczołu ślinowego do obrazowania przyżyciowego za pomocą pionowej mikroskopii przyżyciowej. Protokół ten można łatwo dostosować do innych gruczołów zewnątrzwydzielniczych okolicy głowy i szyi myszy i innych małych gryzoni.

Przygotowanie mysiego śliniaka podżuchwowego do pionowej mikroskopii przyżyciowej

Miejscowe dostarczanie leków do gruczołów podżuchwowych jest interesujące dla zrozumienia biologii gruczołów ślinowych i dla rozwoju nowych terapii. Przedstawiamy zaktualizowany i szczegółowy protokół iniekcji retrodukcyjnej, zaprojektowany w celu poprawy dokładności podawania i odtwarzalności eksperymentalnej. Przedstawione w niniejszym artykule zastosowanie polega na dostarczaniu nanocząstek polimerowych.

Wsteczne wstrzyknięcie nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego

Przedstawiamy szczegółowe podejście do pobierania śliny, w tym mysią tracheostomię i izolację trzech głównych gruczołów ślinowych.

Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Opisano protokół kaniulacji ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewód Whartona. W tym eksperymencie roztwór błękitu trypanowego został użyty jako barwnik, aby zademonstrować, w jaki sposób technika ta skutecznie dostarcza infuzje do docelowej ślinianki oraz aby wykazać niezawodność tego nowego podejścia jako potencjalnej klinicznej terapii lekowej lub komórkowej w regeneracji ślinianek.

Kaniulacja ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewódna Whartonowski

Poznaj radioterapię kultur organotypowych gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych. Ta metoda pozwala ocenić interakcje komórkowe oraz szybko przesiewać związki terapeutyczne przywracające uszkodzenia tkanek.

Radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych Kluczowe cechy in vivo

Przeglądaj więcej filmów