Name: Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę modelowania raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do gruczołu sutkowego myszy. Technika umożliwia specyficzną manipulację zdarzeniami onkogennymi bez konieczności rozległego hodowli zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) grant R01 CA222560 oraz przez Nagrodę Departamentu Obrony za przełom W81XWH-18-1-0037.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) z Brigham and Women's Hospital.
1. Generowanie i utrzymywanie myszy z klapkami
<ol>
	<li>Uzyskaj istotny dla raka piersi warunkowy nokaut warunkowy (np. Trp53tm1Brn [określany jako Trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) lub warunkowe linie myszy knock-in (np. Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan) z repozytorium The Jackson Laboratory (JAX) lub NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Ponadto, aby ułatwić pogoń za MEC, które ulegają rekombinacji za pośrednictwem Cre, można również uzyskać warunkową linię Cre-reporter z JAX (np. Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [określane jako R26Y]).</li>
	<li>Rozmnażać myszy homozygotyczne Trp53 L/L z homozygotycznymi myszami reporterowymi R26Y lub z homozygotycznymi myszami przenoszącymi allele reporterowe R26Y i wszelkie dodatkowe floksowane allele warunkowego nokautu lub knock-in dla różnych modeli myszy, w celu uzyskania heterozygotycznego męskiego i żeńskiego potomstwa F1.</li>
	<li>Krzyżuj heterozygotyczne samce i samice myszy F1 w celu uzyskania samic myszy ze związkiem F2, które są homozygotyczne dla każdego allelu (jako myszy eksperymentalne), a także homozygotycznych samic tylko z R26Y (jako myszy kontrolne). Myszy z genotypem F2 w oparciu o startery PCR i warunki cykliczne wymienione poniżej, poprzez ustawienie dwóch standardowych reakcji PCR 20 μL (przy użyciu Taq 5X Master Mix) w dwóch różnych probówkach PCR, jednej ze starterami R26Y, a drugiej ze starterami Trp53L. Używaj dorosłych myszy (zwykle w wieku około 2-4 miesięcy) do wszystkich hodowli.
	<ol>
		<li>W przypadku R26Y należy przeprowadzić PCR w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, następnie w temperaturze 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę przez 35 cykli, a następnie w temperaturze 72 °C przez 3 minuty i utrzymywać w temperaturze 14 °C. Należy użyć starterów (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG, AAG, AGT, TTTG, TCC, TCA, ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG. 
		UWAGA: Pojedyncze prążki PCR o długości 250 pz wskazują na homozygotę R26Y, pojedyncze prążki PCR o długości 500 pz wskazują na typ dziki (WT), a dwa prążki PCR (R26Y: 250 pz, WT: 500 pz) wskazują na heterozygotę R26Y (<klasa silna = "xfig" >Figura 1A). 
		W przypadku Trp53L należy przeprowadzić PCR w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, następnie w temperaturze 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i w temperaturze 72 °C przez 1 minutę przez 35 cykli, a następnie w temperaturze 72 °C przez 3 minuty i utrzymywać w temperaturze 14 °C. Stosować startery (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) P53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC. 
		UWAGA: Pojedyncze prążko PCR 370 pz wskazuje na homozygotę Trp53L/L, pojedyncze prążko PCR 288 pz wskazuje na Trp53 +/+ WT, a dwa prążki PCR (WT: 288 pz, Trp53L: 370 pz) wskazują na heterozygotę Trp53 L/+ (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie na 1 dzień przed zabiegiem.</li>
	<li>Przygotować 0,1% błękitu bromofenolowego w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć Ad-Cre, który będzie używany do wstrzykiwania doprzewodowego w pożywce DMEM 0,01 M CaCl2 i błękitem bromofenolowym w stosunku 1:10 (tj. mieszanina do wstrzykiwań). 
	UWAGA: Zastosowany tutaj Ad-Cre został uzyskany z University of Iowa Viral Vector Core, z podstawowym mianem wirusa ~1010–1011 pfu/ml.</li>
	<li>Znieczulić samicę myszy (pokolenie F2 opisane w kroku 1.2, wiek od 3 do 4 tygodni do dorosłego osobnika) za pomocą komory izofluranowej i nałożyć maść do oczu. Podczas zabiegu należy znieczulać mysz w sposób ciągły, upewniając się, że wdycha 1%–2,5% izofluranu w tlenie. Sprawdzaj głębokość znieczulenia co najmniej co 15 minut, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. Uważnie monitoruj mysz pod kątem zmian w częstości oddechów, odpowiednio dostosowując poziom izofluranu, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Meloksykam należy wstrzyknąć podskórnie w postaci środka przeciwbólowego w dawce 5 mg/kg mc. przed zabiegiem chirurgicznym.</li>
	<li>Odsłoń miejsce operacji brodawki sutkowej, nakładając kilka kropli kremu do depilacji; usuń nadmiar kremu i luźne włosy za pomocą miękkich ręczników papierowych. 
	UWAGA: Wykonaj ten krok w obszarze oddzielonym od miejsca, w którym ma być wykonana operacja. Nie zaleca się golenia, aby uniknąć uszkodzenia brodawek sutkowych. Zachowaj ostrożność, aby usunąć chemiczny środek do depilacji w odpowiednim czasie. Pozostawienie środka na zbyt długo może spowodować oparzenie chemiczne skóry</li>
	<li>Najpierw zdezynfekuj miejsce operowane jodoforami, następnie 70% alkoholem, a na końcu nałóż jodofory peelingujące. Zrób to okrężnymi ruchami od środka obszaru roboczego w kierunku obrzeża za pomocą gąbki z gazy lub aplikatora z bawełnianą końcówką. Powtórz cykl 3x–4x.</li>
</ol>
3. Iniekcja wewnątrzprzewodowa
<ol>
	<li>Stosuj techniki aseptyczne podczas całego zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie na skórze na długości ~1 cm między dwoma czwartymi pachwinowymi MG (<silna klasa="xfig">Ryc. 2). Ostrożnie oddziel płat skóry (z MG) od otrzewnej ciemieniowej, aby uwidocznić drzewo przewodowe sutka.</li>
	<li>Ostrożnie przytrzymaj sutek kleszczami zegarmistrzowskimi i usuń zewnętrzną sutek bez przecinania pobliskiej skóry, używając nożyczek do mikropreparacji.</li>
	<li>Załaduj ~3–5 μl mieszaniny iniekcyjnej Ad-Cre do strzykawki Hamilton o pojemności 25 μl z przymocowaną metalową igłą piasty 33 G. Oszacować objętość mieszaniny do wstrzykiwań w strzykawce na podstawie niebieskiego barwnika zawartego w mieszaninie. 
	UWAGA: Mniejszą objętość (np. 3 μl) należy stosować podczas wstrzykiwania do MG u samic w wieku 3–4 tygodni i większą objętość (np. 10 μL) podczas wstrzykiwania do MG samic karmiących.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymaj krawędź płata skóry delikatną, zakrzywioną pęsetą i powoli wstrzyknij mieszaninę do wstrzykiwań Ad-Cre do brodawki, w międzyczasie monitorując rozprzestrzenianie się niebieskiego barwnika w drzewie przewodowym sutka. Utrzymuj szybkość wtrysku na jak najniższym poziomie, aby uniknąć uszkodzenia prześwitu kanałowego. 
	UWAGA: Wstrzyknięty płyn (jak ilustruje dołączony niebieski barwnik bromofenolowy) rozprzestrzeniający się po całym drzewie przewodowym bez wycieku do komory zrębu wskazuje na udane wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe.</li>
	<li>Delikatnie wyjąć igłę z brodawki, aby uniknąć wycieku wstrzykniętego płynu.</li>
	<li>Zbadać dystalną stronę (tj. z dala od brodawki sutkowej) MG lub okolice wstrzykiwanego sutka. Należy zauważyć, że pęczniejący niebieski barwnik (tj. barwnik dyfundujący do pobliskiego zrębu) wskazuje na wstrzyknięcie poduszeczki tłuszczowej sutka, a nie na udane wstrzyknięcie doprzewodowe.</li>
	<li>Zamknij rany chirurgiczne (od kroku 3.2) w skórze za pomocą klipsów do ran.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wyjmij mysz ze znieczulenia i umieść ją na poduszce grzewczej w czystej klatce w celu odzyskania sprawności.</li>
	<li>Meloksykam należy podać ponownie podskórnie w dawce 5 mg/kg mc., 24 godziny po zabiegu.</li>
	<li>Monitoruj ogólny stan zwierzęcia i szukaj oznak infekcji w miejscu nacięcia przez 5 dni.</li>
	<li>Klipsy na rany usuwa się ~7-10 dni po zabiegu.</li>
</ol>
5. Monitorowanie rozwoju guza sutka
<ol>
	<li>Monitoruj myszy, którym wstrzyknięto szczepienie dwa razy w tygodniu za pomocą badania palpacyjnego pod kątem jakichkolwiek oznak rozwoju guza sutka.</li>
	<li>Gdy guz jest wyczuwalny, codziennie monitoruj mysz i mierz rozmiar guza, aż osiągnie eksperymentalny punkt końcowy, określony na podstawie wielkości (np. osiągnięcie 10%-15% masy ciała myszy) lub stanu (np. owrzodzenie lub martwica) guza lub ogólnego stanu zdrowia myszy (np. śpiączka, konający).</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie metodę wtórną (np. zwichnięcie szyjki macicy).</li>
	<li>Wyizoluj tkanki guza sutka i przeanalizuj je za pomocą cytometrii przepływowej, immunofluorescencji lub profilowania ekspresji (np. przez sekwencjonowanie RNA [RNAseq] lub mikromacierz), jak opisano wcześniej12.</li>
	<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej przez bramkowanie dla komórek ujemnych pod względem linii (Lin-: ujemny dla markerów linii CD45 [marker leukocytów], CD31 [marker komórek śródbłonka] i TER119 [marker erytrocytów]) i przeanalizuj komórki w guzie na podstawie ich ekspresji YFP, CD24 i CD29.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sukces tego podejścia do indukowania guzów sutka z różnych subpopulacji MEC zależy nie tylko od wyboru odpowiednich promotorów specyficznych dla typu komórki (w celu stymulowania ekspresji Cre), ale także od samej procedury iniekcji doprzewodowej. Ideą tego podejścia jest to, że wstrzyknięte wirusy Ad-Cre są zatrzymywane w drzewie przewodowym, które jest ukrytą strukturą ze światłem, a zatem tylko MEC są narażone na wirusy i są zainfekowane przez Ad-Cre. Ze względu na ograniczoną przestrzeń światła w przewodach sutkowych...

Ogólnym celem tej metody jest opracowanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzyknięciu Ad-Cre do mysiego MG. Podejście genetyczne oparte na rekombinacji Cre/loxP jest szeroko stosowane do modelowania ludzkiego raka piersi u myszy. Pierwsza generacja mysich modeli raka piersi opartych na Cre/loxP jest generowana przy użyciu transgenicznych myszy z ekspresją Cre pod kontrolą promotorów specyficznych dla MEC (np. MMTV-Cre dla luminalnych MEC i części podstawowych MEC, Wap-Cre i Blg-Cre dla luminalnych progenitorów i pęcherzyków płucnych luminalnych MEC, K14-Cre dla podstawowych i części luminalnych MECs1,2,3,4,5)6,7,8,9. Jednakże, podczas gdy te transgeniczne linie Cre umożliwiają przestrzenną kontrolę ekspresji Cre (tj. w różnych podzbiorach MEC), nie pozwalają na czasową kontrolę ekspresji Cre i manipulacji genetycznej za pośrednictwem Cre / loxP. Druga generacja mysich modeli raka piersi opartych na Cre/loxP wykorzystuje indukowalne podejścia do aktywności/ekspresji Cre (np. zastosowanie fuzji receptora Cre-estrogen [CreER], która może indukować rekombinację Cre/loxP tylko po podaniu tamoksyfenu), w wyniku czego te narzędzia genetyczne umożliwiają zarówno przestrzenną, jak i czasową kontrolę aktywacji zdarzeń onkogennych w MEC (np. Modele oparte na K8-CreER- i K5-CreER)10,11,12. W obu generacjach mysich modeli raka piersi, jako promotory używane do napędzania ekspresji Cre lub CreER (np. Krt8, Krt5) mogą być również aktywne w komórkach nabłonkowych innych narządów (tj. są specyficzne dla typu komórki, ale nie są specyficzne dla narządu) lub mają nieszczelną ekspresję w typach komórek innych niż komórki nabłonkowe (np. MMTV, który ma nieszczelną aktywność w komórkach krwiotwórczych szpiku kostnego), Takie podejścia mogą prowadzić do rozwoju niechcianego raka (nowotworów) w innych narządach. Jeśli te nieoczekiwane nowotwory powodują śmiertelność u dotkniętych nimi myszy, pierwotny cel modelowania raka piersi u tych myszy może być zabroniony (np. zdarzenia onkogenne wywołane MMTV-Cre mogą prowadzić do nowotworów układu krwiotwórczego i wczesnej śmierci myszy z powodu nieszczelności promotora MMTV w komórkach krwiotwórczych)4.
Tutaj przedstawiamy podejście do modelowania raka piersi u myszy, które pozwala zarówno na manipulację zdarzeniami onkogennymi w sposób kontrolowany czasowo, zarówno dla typu komórki, jak i narządu. Podejście to opiera się na doprzewodowym wstrzyknięciu Ad-Cre do mysich MG (a zatem jest specyficzne dla narządu). Ekspresję Cre można kontrolować za pomocą różnych promotorów specyficznych dla subpopulacji MEC osadzonych w wektorze adenowirusowym (np. Krt8 dla luminalnych MEC, Krt5 dla podstawowych MEC, osiągając w ten sposób swoistość dla typu komórki). Indukcja raka w MG może być czasowo kontrolowana przez wstrzyknięcie Ad-Cre myszom w różnym wieku, począwszy od 3-4 tygodnia życia (okres dojrzewania) do stadium dorosłego.

<table><tbody><tr><td>Igła o rozmiarze 33</td> Hamilton <td></td><td>7803-05</td><td>Styl punktowy 3</td></tr><tr><td>7mm klips refleksyjny</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus, Ad-K5-Cre</td><td>University of Iowa Wektor wirusowy</td><td>Rdzeń Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus, Ad-K8-Cre</td><td>University of Iowa Wektor wirusowy</td><td>Core Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Fisher</td><td>HC800-1GAL</td><td>Przygotuj się do 70% użycia</td></tr><tr><td>biotynylowany CD31</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany CD45</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD Pharmingen</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>Balsam do depilacji</td><td>Nair</td><td></td><td>9 uncji</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>0,025 ml</td></tr><tr><td>Jodofory</td><td>Betadina</td><td></td><td>10% Powidon-jod</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2,5%</td></tr> <tr><td>Loxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>5 mg / ml</td></tr><tr><td>Smar Maść do oczu</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji</td><td>Pentair</td><td>9M</td><td>Kleszcze zegarmistrzowskie</td></tr><tr><td>Pęseta do mikropreparacji</td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją cre do mysiego gruczołu sutkowego

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Rak piersi jest chorobą niejednorodną, prawdopodobnie spowodowaną złożonymi interakcjami między różnymi komórkami pochodzenia i zdarzeniami onkogennymi. Modele mysie odgrywają zasadniczą rolę w uzyskiwaniu wglądu w te złożone procesy. Chociaż opracowano wiele modeli mysich w celu zbadania udziału różnych zdarzeń onkogennych i komórek pochodzenia w nowotworzeniu piersi, modele te często nie są specyficzne dla typu komórki lub narządu lub nie mogą indukować inicjacji nowotworzenia sutka w sposób kontrolowany czasowo. W tym miejscu opisujemy protokół generowania nowego typu mysich modeli raka piersi opartych na doprzewodowym wstrzyknięciu adenowirusa z ekspresją Cre (Ad-Cre) do mysich gruczołów sutkowych (MG). Ze względu na bezpośrednie wstrzyknięcie Ad-Cre do przewodów sutkowych, podejście to jest specyficzne dla MG, bez niepożądanej indukcji raka w innych narządach. Zabieg iniekcji doprzewodowej może być wykonywany u myszy na różnych etapach rozwoju MG (dzięki czemu pozwala na czasową kontrolę indukcji raka, począwszy od ~3-4 tygodnia życia). Swoistość typu komórki można osiągnąć poprzez zastosowanie różnych promotorów specyficznych dla typu komórki do stymulowania ekspresji Cre w wektorze adenowirusowym. Pokazujemy, że luminalne i podstawne komórki nabłonka sutka (MEC) mogą być ściśle ukierunkowane na manipulację genetyczną opartą na Cre / loxP poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie Ad-Cre pod kontrolą odpowiednio promotora keratyny 8 lub keratyny 5. Włączając warunkowy reporter Cre (np. Reporter Rosa26-YFP indukowany przez Cre / loxP), pokazujemy, że MEC ukierunkowane na Ad-Cre i pochodzące z nich komórki nowotworowe można śledzić, podążając za komórkami reporterowo-dodatnimi po wstrzyknięciu doprzewodowym.

Reprezentatywne wyniki genotypowania PCR dla alleli R26Y oraz Trp53L przedstawiono na Rysunku 1.
Choć w zasadzie wszystkie 10 gruczołów mlekowych (MG) może zostać poddanych procedurze wstrzyknięcia do przewodów, w praktyce do iniekcji zazwyczaj wybiera się dwa czwarte gruczoły pachwinowe ze względu na ich łatwiejszy dostęp i większe rozmiary (Rysunek...

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Protokół ten pomoże naukowcom w stworzeniu nowego typu modelu mysiego, który pozwoli podsumować rozwój ludzkiego raka piersi na podstawie różnych podzbiorów komórek nabłonka sutka. Technika ta pozwala naukowcom generować mysie modele raka piersi w tkance w fazie rozwoju w sposób specyficzny dla typu komórki i bez potrzeby ekstensywnej hodowli myszy. Aby rozpocząć tę procedurę, wygeneruj, utrzymuj i znieczulaj myszy z klapami zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Umieść mysz w obszarze oddzielonym od miejsca, w którym ma zostać wykonana operacja. Po potwierdzeniu znieczulenia poprzez wykonanie uszczypnięcia palca u nogi, należy wstrzyknąć Meloksykam jako środek przeciwbólowy podskórnie w dawce pięciu miligramów na kilogram, aby przygotować się do zabiegu chirurgicznego. Odsłoń miejsce operacji brodawki sutkowej, nakładając kilka kropli kremu do depilacji.Usuń nadmiar kremu i luźnych włosów za pomocą miękkich ręczników papierowych. Nie zaleca się golenia, aby uniknąć uszkodzenia sutków. Najpierw zdezynfekuj miejsce operowane jodoforami, następnie 70% alkoholem, a na koniec nałóż jodofory peelingujące.Zrób to okrężnymi ruchami od środka obszaru roboczego w kierunku obrzeża za pomocą

modeling-breast-cancer-via-an-intraductal-injection-cre-expressing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym artykule omawiamy, jak stworzyć model raka piersi u samic myszy poprzez wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka. Przykładowy protokół demonstruje iniekcję ortotopową.

Wstrzyknięcie ortotopowe do poduszeczki tłuszczowej sutka: ustalenie raka piersi u myszy

Ten film opisuje technikę iniekcji wewnątrzprzewodowych, w której dostarczamy mieszankę iniekcyjną do przewodów mysich gruczołów sutkowych.

Iniekcja doprzewodowa: dostarczanie mieszanki iniekcyjnej do przewodów gruczołu sutkowego myszy

Opisano protokół nieinwazyjnego wewnątrzprzewodowego dostarczania wodnych odczynników do gruczołu sutkowego myszy. Metoda wykorzystuje miejscowe wstrzyknięcie do sutków gruczołów sutkowych, celując konkretnie w przewody sutkowe. Technika ta można dostosować do różnych związków, w tym siRNA, chemioterapeutyków i małych cząsteczek.

Wstrzyknięcie doprzewodowe w celu miejscowego dostarczania leku do mysiego gruczołu sutkowego

Aktywacja utajonych mutacji z adenowirusem-Cre w systemie przewodowym sutka powoduje klinicznie istotny przerzutowy rak piersi. Włączenie promotora YFP umożliwia śledzenie dystalnych komórek nowotworowych z przerzutami. Model ten jest przydatny do badania utajonych przerzutów, odporności przeciwnowotworowej oraz do projektowania nowych immunoterapii w leczeniu raka piersi.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Opisano metodę doprzewodowego wstrzykiwania odczynników do roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do mysiego drzewa sutkowego do obrazowania in vivo i zapobiegania rakowi piersi. Wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej pozwala na celowanie w komórki nabłonka sutka przy minimalnym uszkodzeniu tkanek ubocznych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe i wizualizacja rentgenowska roztworu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce i leczeniu miejscowym raka piersi w modelach mysich

Opisano procedurę dostarczania chemicznego roztworu ablacyjnego do drzewa przewodowego sutka szczura w celu profilaktycznego leczenia raka piersi pod kontrolą obrazu. Komórki nabłonka sutka mogą być celowane przy minimalnym uszkodzeniu tkanek pobocznych poprzez kaniulację bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej i doprzewodową infuzję 70% roztworu ablacyjnego na bazie etanolu.

Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych

Obecny protokół opisuje doprzewodową iniekcję wektorów wirusowych przez smoczek w celu dostarczenia interesujących genów do komórek nabłonka sutka.

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Poznaj metodę modelowania raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do gruczołu sutkowego myszy. Technika umożliwia specyficzną manipulację zdarzeniami onkogennymi bez konieczności rozległego hodowli zwierząt.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Przeglądaj więcej filmów