Name: Pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Poznaj protokół pobierania tkanek nietoperzy do analiz genomowych i transkryptomicznych. Metoda obejmuje humanitarne łapanie, sekcję narządów oraz hodowlę pierwotnych fibroblastów z błony skrzydłowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo i Fanny Fernández Melo za umożliwienie pobierania tkanek w Peru. W Kolumbii dziękujemy Colciencias i Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexandrowi von Humboldtowi, a także Alexandrze Buitrago, Mailyn González, Andrésowi Juliánowi Lozano Florezowi, Darwinowi M. Moralesowi Martinezowi, Anie Marii Ospinie, Adrianowi Pinzonowi, Paoli Pulido-Santacruz i Danny'emu Rojasowi za umożliwienie logistyki, podróży, fotografowania i filmowania. Dziękujemy również wszystkim członkom Grupo Jaragua i Yolandzie León za umożliwienie pobrania tkanek w Republice Dominikany, a także Bernalowi Rodriguezowi Hernandezowi, Bernalowi Mataricie i wszystkim w Biologicznej Stacji Badawczej La Selva w Kostaryce za umożliwienie pobrania próbek, a także Kasi Sawickiej za pomoc w procedurach i odczynnikach przed podróżą. Dziękujemy Elli Lattenkamp i Lutzowi Wiegrebe za dostęp i pobranie próbek stempli skrzydeł nietoperzy Phyllostomus discolor w celu wytworzenia hodowli komórkowych. Nietoperze Phyllostomus discolor pochodzą z kolonii lęgowej na Wydziale Biologii II Uniwersytetu Ludwika i Maksymiliana w Monachium. Zezwolenie na hodowlę i hodowlę nietoperzy zostało wydane przez powiatowy urząd weterynaryjny w Monachium. LMD, SJR, KTJD i LRY były finansowane przez NSF-DEB 1442142. LMD został sfinansowany przez NSF-DEB 1838273. LRY został sfinansowany przez NSF-PRFB 1812035. SCV i PD zostały sfinansowane ze środków Max Planck Research Group Award oraz grantu badawczego Human Frontiers Science Program (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP i KTJD były finansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC Starting grant 310482 [EVOGENO]) przyznany SJR, ECT było finansowane z grantu Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC-2012-StG311000).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół omówiony w tym manuskrypcie opisuje najlepsze praktyki pobierania próbek dla różnych wysokoprzepustowych analiz molekularnych nietoperzy. Wszystkie udane badania -omiczne wymagają wysokiej jakości tkanki, ale pobieranie próbek tkanek nietoperzy, jak również innych organizmów niemodelowych, często odbywa się w warunkach polowych, których nie można ustawić na tym samym poziomie, co w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Pobieranie próbek często odbywa się w odległych lokalizacjach, przy minimalnych zasobach, ...

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorf Safelock</td><td>Fischer Scientific</td><td>10509691</td><td>sterylne probówki 1,5 ml używane podczas protokołu hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,002</td><td>15 ml sterylne probówki używane podczas protokołu hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>2 ml kriofiolki kriogeniczne</td><td>Thomas Scientific</td><td>1154P75</td><td>do tkanek do przechowywania w ciekłym azocie</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 3 mm</td><td>Medline</td><td>Stempel do</td><td>biopsji skrzydła MIL3332 do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Greiner</td><td>83,392</td><td>Naczynie hodowlane</td></tr><tr><td>Allprotect Odczynnik tkankowy</td><td>Qiagen</td><td>76405</td><td>do próbek kału; roztwór stabilizujący tkanki</td></tr><tr><td>Szkiełka do zliczania komórek do licznika komórek TC10/TC20, dwukomorowe</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>Komory do zliczania komórek za pomocą automatycznego licznika komórek TC20 firmy Bio-Rad</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7909</td><td>Do dysocjacji komórek pierwotnych</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td>Zapobiega krystalizacji wody podczas zamrażania komórek.</td></tr><tr><td>DMEM&ndash; Pożywka hodowlana Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr>PBS <td>Invitrogen</td><td>firmy</td><td>Dulbecco,</td> 14190169 <td>Zbilansowany roztwór soli stosowany do mycia komórek</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td>Surowica-suplement do hodowli in vitro komórek eukariotycznych</td></tr><tr><td>Sól siarczanu gentamycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264-250MG</td><td>Antybiotyk do pożywek</td></tr><tr><td>hodowlanych Nalgene Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0050</td><td>Pojemnik do zamrażania, który zapewnia 1 &stopni; Szybkość chłodzenia C/min</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>Sigma</td><td>P7793</td><td>Rurki do owijania itp. do uszczelniania</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (długopis-paciorkowiec), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140130</td><td>Antybiotyk do pożywek</td></tr><tr><td>hodowlanych Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10x, pH 7,4</td><td>Bufor soli Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>stosowany do płukania i przechowywania tkanki kostnej; rozcieńczyć do 10x za pomocą</td></tr><tr><td>RNAlater</td> <td>z wodą dejonizowanąThermo Fisher</td><td>AM7021</td><td>Roztwór stabilizujący</td></tr><tr><td>RNA Ode środka</td><td>Genetech</td><td>83931-250mL</td><td>rozkłada enzymy, które prowadzą do degradacji RNA</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>7631-86-9</td><td>środek osuszający</td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td>Barwienie komórek używany do oceny żywotności komórek</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>Do dysocjacji komórek podczas rozszczepiania</td></tr></tbody></table>

pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Wraz z rozwojem technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, ustandaryzowane metody pozyskiwania i konserwacji tkanek wysokiej jakości pozwalają na rozszerzenie tych metod na organizmy niemodelowe. Opracowano szereg protokołów optymalizujących pobieranie tkanek od nietoperzy dla szeregu podejść do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Przedstawiono tutaj protokoły chwytania nietoperzy, pożądane dane demograficzne, które należy zebrać dla każdego nietoperza, oraz zoptymalizowane metody minimalizacji stresu u nietoperza podczas pobierania tkanek. W szczególności przedstawiono metody pobierania i obróbki tkanek w celu uzyskania (i) DNA do analiz genomowych o dużej masie cząsteczkowej, (ii) RNA do transkryptomów specyficznych dla tkanek oraz (iii) białek do analiz na poziomie proteomicznym. Na koniec przedstawiono również metodę unikania śmiertelnego pobierania próbek poprzez tworzenie żywotnych pierwotnych kultur komórkowych z klipsów skrzydłowych. Główną motywacją tych metod jest maksymalizacja ilości potencjalnych danych molekularnych i morfologicznych dla każdego nietoperza oraz zaproponowanie optymalnych sposobów zachowania tkanek, aby zachowały swoją wartość w miarę rozwoju nowych metod w przyszłości. Standaryzacja ta stała się szczególnie ważna, ponieważ pojawiły się inicjatywy mające na celu sekwencjonowanie chromosomów, wolne od błędów genomy gatunków na całym świecie, w których wiele grup naukowych przewodzi sekwencjonowaniu różnych grup taksonomicznych. Przedstawione w niniejszym dokumencie protokoły definiują idealne metody pobierania i konserwacji tkanek dla Bat1K, konsorcjum, które sekwencjonuje genomy każdego gatunku nietoperzy.

DNA 
Do standardowych analiz niskocząsteczkowych (LMW) wyekstrahowano DNA z trzech gatunków nietoperzy neotropikalnych. Próbki tkanek pobrano w terenie z Dominikany i Kostaryki, zgodnie z protokołami opisanymi w niniejszej pracy. Po sekcji małe fragmenty ( <0,5 cm w najcieńszym przekroju) tkanek mieszanych (mózgu, wątroby i jelit) umieszczono w roztworze stabilizującym RNA, zamrożono szokowo, a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C. Ekstrakcje przeprowadzono zg...

To jest protokół optymalnego przygotowania tkanek do analiz genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych nietoperzy złapanych na wolności. Obejmuje protokoły chwytania i preparacji nietoperzy, konserwacji tkanek i hodowli komórek tkanek nietoperzy.

Pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

W tym filmie przedstawiamy szczegółowy przewodnik po humanitarnym odłowie nietoperzy, mający na celu zminimalizowanie wpływu na populacje oraz maksymalizację wartości naukowej. Zalety naszego podejścia polegają na maksymalizacji ilości potencjalnych danych molekularnych i morfologicznych dla każdego osobnika, konserwacji tkanek w celu zachowania ich przyszłej wartości oraz ograniczeniu pobierania osobników z natury. Protokoły sekcji są trudne do zaprezentowania w formie słownej.Wiele z zaprezentowanych tutaj technik przygotowania tkanek najlepiej przekazać poprzez wizualizację sposobu identyfikacji poszczególnych organów, a następnie ich prawidłowej dyssekcji i przechowywania. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek dyssekcji należy przygotować wszystkie probówki, aby uniknąć opóźnień. W przypadku RNA należy odstawić odpowiednią liczbę probówek dla każdego preparatu.Każdą probówkę należy opisać, podając rodzaj pobieranej tkanki oraz standardowe informacje identyfikacyjne próbki. Napełnić fiolki w 50% roztworem stabilizującym RNA i schłodzić do 4 °C. Należy uważać, aby nie napełniać fiolek całkowicie roztworem stabilizującym RNA, ponieważ probówka może eksplodować podczas umieszczania jej

tissue-collection-of-bats-for-omics-analyses-and-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.

Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków.  W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Opisujemy prostą i szybką eksperymentalną procedurę generowania pierwotnych fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Procedura nie wymaga specjalnego szkolenia zwierząt i może być stosowana do generowania kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni.

Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Ten protokół wprowadza standardową procedurę laboratoryjną do testowania diagnostycznego antygenów wirusa lyssa u nietoperzy na Tajwanie.

Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Poznaj protokół pobierania tkanek nietoperzy do analiz genomowych i transkryptomicznych. Metoda obejmuje humanitarne łapanie, sekcję narządów oraz hodowlę pierwotnych fibroblastów z błony skrzydłowej.

Pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej

Przeglądaj więcej filmów