Name: Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modeli ksenoprzeszczepu pobranych od pacjenta z czerniakiem. Technika ta umożliwia badanie biologii nowotworu i odpowiedzi na terapię w warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Zakładowi Zwierząt Instytutu Wistar, Ośrodku Mikroskopii, Ośrodku Histotechnologii i Centrum Zaopatrzenia Badawczego. Badanie to zostało częściowo sfinansowane z grantów U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Fundacji Badań Medycznych dr Miriam i Sheldona G. Adelson oraz Fundacji Badań nad Czerniakiem.

Następujące protokoły dla zwierząt są zgodne z wytycznymi komisji etyki humanitarnej Instytutu Wistar oraz wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Pobieranie tkanek nowotworowych czerniaka
<ol>
	<li>Pobrać tkankę nowotworową (określaną jako pasaż 0) od pacjentów z czerniakiem za pomocą jednej z następujących metod chirurgicznych lub biopsji.
	<ol>
		<li>W przypadku tkanki do wycinania chirurgicznego należy przechowywać co najmniej 1 g tkanki (przerzuty do sekcji i zmiany pierwotne) w transportowych pożywkach magazynujących (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamycyny) w temperaturze 4 °C lub na lodzie.</li>
		<li>W przypadku tkanek do biopsji chirurgicznej należy przechowywać mniej niż 1 g tkanki (często biopsje dziurkujące przerzutów podskórnych [s.c.] i przerzutów do węzłów chłonnych [LN]) w pożywce transportowej w temperaturze 4 °C lub na lodzie.</li>
		<li>W przypadku tkanki pobranej z biopsji gruboigłowej należy przepłukać cylinder (rdzeń) tkanki o wymiarach około 10 mm x 1 mm (często biopsje wątroby) do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml transportowej pożywki do przechowywania w temperaturze 4 °C lub na lodzie.</li>
		<li>W przypadku tkanek aspirowanych cienkoigłowo (FNA) bardzo małą ilość tkanki (o wielkości mniejszej niż 1 mm) pobraną bezpośrednio od pacjenta należy przechowywać w igle i strzykawce w temperaturze 4 °C lub na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostarczyć tkankę w transportowym podłożu magazynującym w temperaturze 4 °C lub na lodzie tego samego dnia lub z wysyłką w nocy po wycięciu chirurgicznym lub biopsji. Przetwarzaj tkankę w ciągu 1-2 godzin od porodu.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanki nowotworowej do implantacji myszy
<ol>
	<li>Wycięcie chirurgiczne lub biopsja chirurgiczna przetwarzanie tkanek
	<ol>
		<li>Przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i oddziel tkankę nowotworową od otaczającej normalnej tkanki tak bardzo, jak to możliwe.</li>
		<li>Usuń tkankę martwiczą (zwykle identyfikowaną jako blado-biaława tkanka znajdująca się centralnie w guzie) z pozostałego guza w jak największym stopniu.</li>
		<li>Użyj skalpela, aby podzielić początkowy fragment guza na mniej więcej równe części (~3 mm x 3 mm) w celu chirurgicznej implantacji myszy (ryc. 2).</li>
		<li>Opcjonalnie, jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanki nowotworowej, należy ją zamrozić w celu przeprowadzenia dalszych testów (sekwencjonowanie RNA [RNASeq], sekwencjonowanie całego eksomu [WES] itp.).</li>
		<li>Zrób zawiesinę guza, mieląc tkankę nowotworową za pomocą techniki krzyżowego ostrza z dwoma ostrzami skalpela. Zmiel kawałki guza tak drobno, jak to możliwe, aby utworzyć zawiesinę, która jest teraz gotowa do chirurgicznej implantacji myszy.</li>
		<li>Alternatywnie, jeśli tkanka nowotworowa jest zbyt twarda do mechanicznej dysocjacji, należy zastosować procedurę dysocjacji trawienia, aby utworzyć żelową zawiesinę i zawiesinę jednokomórkową do implantacji i / lub wstrzyknięcia.
		<ol>
			<li>Zmiel kawałki guza tak drobno, jak to możliwe, aby uzyskać zawiesinę.</li>
			<li>Umieścić zawiesinę w probówce o pojemności 50 ml z zimnym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS)-/- (bez Ca++ i Mg++); następnie odwirować i osadzać przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Zawiesić zawiesinę w 10 ml podgrzanej świeżej pożywki fermentacyjnej (200 U/ml kolagenazy IV + 5 mM CaCl2 + 50 U/ml DNazy w HBSS-/-) na 1 g tkanki nowotworowej.</li>
			<li>Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20 minut i energicznie mieszać co 5 minut za pomocą jednorazowej pipety.</li>
			<li>Przemyć do 50 ml HBSS-/-, a następnie odwirować przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Dodać 5 ml podgrzanego TEG (0,025% trypsyny + 40 μg/ml glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N',N'--tetraoctowego [EGTA] + 10 μg/ml alkoholu poliwinylowego [PVA]) na 1 g tkanki nowotworowej, delikatnie zawiesić/wstrząsnąć i umieścić probówkę w temperaturze 37 °C na 2 minuty bez mieszania.</li>
			<li>Dodać co najmniej 1 równą objętość zimnego podłoża barwiącego (1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] + 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego [HEPES] + 1x penicylina-streptomycyna w pożywce L15) w celu wygaszenia trypsyny i odwirować przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Ponownie zawiesić próbkę w 10 ml pożywki barwiącej na 1 g tkanki nowotworowej i przefiltrować ją przez sitko do komórek 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową do wstrzyknięcia myszy (ryc. 2).</li>
			<li>Gnojowica pozostała na wierzchu sitka komórkowego może być również zbierana w celu chirurgicznej implantacji myszy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanietkanek z biopsji lub
	<ol>
		<li>Wlać tkankę cylindra rdzeniowego do rurki do transportu tkanek na 5-centymetrową szalkę Petriego.</li>
		<li>Usuń nadmiar płynu, zeskrob tkankę do krawędzi szalki Petriego, drobno zmiel tkankę nowotworową, dodaj ~100–150 μl HBSS-/- na wierzch tkanki nowotworowej i szybko wciągnij HBSS/zawiesinę tkanki nowotworowej do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Podłączyć igłę 23 G do strzykawki o pojemności 1 ml, przepuścić HBSS/zawiesinę tkanki nowotworowej przez igłę do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Ponownie narysuj zawiesinę guza do strzykawki z igłą nadal założoną, aż będzie mogła płynnie przejść przez igłę.</li>
		<li>Na koniec wciągnąć zawiesinę guza z powrotem do strzykawki i odłączyć igłę 23 G.</li>
		<li>Przymocować igłę 27 G i pobrać równą objętość (~100–150 μl) sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz Tabela materiałów) do strzykawki.</li>
		<li>Powoli dodawać równą objętość sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml z zawiesiną guza/HBSS-/-, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków.</li>
		<li>Wciągnij po raz ostatni z powrotem do strzykawki, a tkanka guza z biopsji grubioigłowej jest teraz gotowa do wstrzyknięcia myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie tkanek FNA
	<ol>
		<li>Umieścić strzykawkę zawierającą próbki FNA (uwięzione w igle) na lodzie.</li>
		<li>Oddzielić igłę (zawierającą tkankę FNA) od strzykawki i usunąć tłok ze strzykawki, dodać ~150–200 μL HBSS-/- do górnej części strzykawki.</li>
		<li>Ponownie włożyć tłok do strzykawki i igły (zawierającej tkankę FNA) i wypchnąć HBSS-/- przez igłę do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml. Ten krok usuwa guz FNA z igły.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.3.3 z zawiesiną HBSS-/-/FNA dwukrotnie, używając tej samej strzykawki, aby zmaksymalizować pobieranie tkanki nowotworowej z igły.</li>
		<li>Dodaj równą objętość (~100–150 μl) sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej do probówki wirowej o pojemności 1,5 ml zawierającej zawiesinę HBSS/FNA.</li>
		<li>Odpowiednio wymieszać, powoli wciągając sztuczną matrycę zewnątrzkomórkową/zawiesinę HBSS-/-/FNA z powrotem do igły 23 G i powtarzając dwukrotnie.</li>
		<li>Pobrać całą sztuczną macierz zewnątrzkomórkową/objętość HBSS-/-/FNA z powrotem do strzykawki, zastąpić igłę 23 G igłą 27 G, a próbka FNA jest teraz gotowa do wstrzyknięcia myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Implantacja i iniekcja guza u myszy
<ol>
	<li>Implantacja chirurgicznego wycięcia lub biopsji chirurgicznej Tissue 
	UWAGA: Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylne przez autoklawowanie lub użycie wstępnie wysterylizowanych narzędzi jednorazowych.
	<ol>
		<li>Ogol włosy z dolnej części pleców 6-8 tygodniowych samców lub samic myszy NSG, pozostawiając obszar o wymiarach około 1,5 cm x 3 cm bez włosów. Znieczulenie myszy za pomocą izofluranu i potwierdź, delikatnie ściskając stopę w ramach testu reakcji. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
		<li>Umieść pojedyncze myszy na poduszce grzewczej w stożku nosowym aparatu do znieczulenia, wyszoruj ogolony obszar chlorheksydyną. Następnie zalać 70% etanolem i pozostawić do odparowania.</li>
		<li>Przygotuj kawałki lub podziel zawiesinę guza na szalce Petriego na pojedyncze kopce do implantacji chirurgicznej (tj. na trzy równe kopce, jeśli mają być wszczepione 3 myszy).</li>
		<li>Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie o długości około 5 mm na środku grzbietu myszy, weź jedną parę kleszczy i podnieś skórę po stronie nacięcia po przeciwnej stronie operatora.</li>
		<li>Weź nożyczki do drugiej ręki i oddziel skórę od warstwy mięśniowej, delikatnie przecinając błonę powięziową małymi nacięciami nożycowymi, tworząc w ten sposób "kieszeń" na tkankę nowotworową.</li>
		<li>Podnieś jeden fragment guza lub pojedynczy kopiec tkanki zawiesiny guza za pomocą ostrza skalpela i delikatnie umieść tkankę w utworzonej kieszeni.</li>
		<li>Podaj 100 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na wzgórek tkanki nowotworowej w kieszeni.</li>
		<li>Za pomocą dwóch par kleszczy pociągnij nacięcie na obu końcach, tak aby krawędzie rany zbliżyły się do siebie, i zamknij ranę, zakładając jeden lub dwa klipsy do rany.</li>
		<li>Wstrzyknąć podskórnie 1-5 mg/kg meloksykamu jako środek przeciwbólowy u myszy po operacji.</li>
		<li>Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją z powrotem w pierwotnej klatce, obserwuj mysz podczas budzenia. Nie wracaj do klatki, dopóki w pełni nie wyzdrowiejesz.</li>
		<li>Usuń klipsy do ran po około 7 dniach. Jeśli gojenie nie jest pełne po 7 dniach, pozostaw klips do rany na dodatkowy jeden lub dwa dni. 
		UWAGA: W przypadku użycia zawiesiny pojedynczej komórki z chirurgicznego wycięcia lub biopsji chirurgicznej, zmiesza się ona ze sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową (w stosunku 1:1) do wstrzyknięcia myszom.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie FNA lub tkanki biopsji grubioigłowej
	<ol>
		<li>Umieść mysz NSG na stojaku ze stalową siatką, chwyć ją mocno za ogon i delikatnie pociągnij mysz do tyłu. Mocno chwyci siatkę przednimi nogami. Alternatywnie, unieruchamiaj mysz w ręce niedominującej i pozwól, aby obszar boczny był widoczny</li>.
		<li>Zdezynfekować skórę boku wacikami nasączonymi alkoholem, powoli i równomiernie wstrzyknąć zawartość strzykawki pod skórę myszy.</li>
		<li>Wyciągnij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Monitoruj wzrost guza
<ol>
	<li>Monitoruj myszy raz w tygodniu, aby sprawdzić, czy nie ma wyczuwalnych guzów.</li>
	<li>Gdy guzy osiągną mierzalny rozmiar (około 50 mm3), użyj suwmiarki, aby zarejestrować wymiary guza. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć objętość guza: (szerokość x szerokość x długość) / 2.</li>
	<li>Zbierz guz, gdy objętość guza osiągnie około 1,5 cm3 (około 4-10 tygodni). Guz nazywa się teraz pasażem myszy 1 (MP1).</li>
</ol>
5. Pobieranie guza w celu bankowania tkanki, reimplantacji i eksperymentu/charakterystyki
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji w komorze CO2 , sprawdź parametry życiowe, aby potwierdzić śmierć, a następnie zanurz mysz w roztworze Virkon, aby sterylizować skórę przez 30 sekund w bio-szafce.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy chirurgicznych, aby podnieść skórę przylegającą do guza i wykonać poziome cięcie.</li>
	<li>Użyj techniki separacji, aby zmobilizować skórę po obu stronach guza i nad guzem, odsłaniając guz.</li>
	<li>Użyj nożyczek lub ostrza skalpela, aby oddzielić guz od powięzi.</li>
	<li>Wyciąć guz i przenieść guz na sterylną szalkę Petriego, pokroić guz na małe kawałki i usunąć tkankę martwiczą z guza.</li>
	<li>Bank tkanki nowotworowej do przyszłej implantacji.
	<ol>
		<li>Weź 2-3 małe kawałki guza mniejsze niż ~10 mm x 10 mm i zmiel je na kawałki mniejsze niż ~1 mm x 1 mm.</li>
		<li>Przenieś całą zmieloną tkankę do fiolki kriogenicznej o pojemności 2 ml, dodaj 1 ml pożywki do zamrażania (10% DMSO + 90% FBS).</li>
		<li>Dobrze wymieszaj i umieść fiolki kriogeniczne we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania komórek na bazie izopropanolu na suchym lodzie.</li>
		<li>Przechowywać pojemnik w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez noc, a następnie przenieść fiolki kriogeniczne do przechowywania ciekłego azotu (LN2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Błyskawiczne zamrażanie tkanek do dalszych testów (RNASeq, WES itp.).
	<ol>
		<li>Umieść kawałki tkanki nowotworowej (~3 mm x 3 mm) w fiolce kriogenicznej i natychmiast umieść fiolkę kriogeniczną w LN2. Przechowywać fiolki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Próby terapii PDX
UWAGA: Potrzeba dwóch faz ekspansji, aby wyhodować wystarczającą ilość tkanki nowotworowej, aby wygenerować niezbędną liczbę myszy z PDX do próby terapeutycznej.
<ol>
	<li>Pobrać kriowial zawierający zbankowaną tkankę PDX z LN2 i umieścić kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pożywka zamrażająca zawierająca tkankę nowotworową zacznie się topić.</li>
	<li>Opróżnij zawartość kriowialu do wstępnie ogrzanego HBSS-/- w probówce o pojemności 50 ml i umyj chusteczkę.</li>
	<li>Tkanka w granulkach przez odwirowanie przez 5 minut przy 1 200 obr./min.</li>
	<li>Usunąć HBSS-/- z próbki guza przez aspirację próżniową za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Wsuń tkankę PDX z probówki o pojemności 50 ml na szalkę Petriego o średnicy 5 cm lub 10 cm i umieść na mokrym lodzie.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z powyższym protokołem implantacji, aby wszczepić bankowaną tkankę z fiolki kriogenicznej 5 myszom NSG w pierwszej rundzie ekspansji guza PDX.</li>
	<li>Gdy guzy osiągną ~ 600–800 mm3, zbierz 1-2 guzy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki z powyższym protokołem przetwarzania tkanki nowotworowej: dysocjacja mechaniczna, procedura dysocjacji trawienia kolagenazy.</li>
	<li>Komórki osadkowe i ponownie zamieszać w 6 ml HBSS -/-/sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (stosunek 1: 1), wstrzyknąć podskórnie ~ 50 myszy NSG, ze 100 μl mieszaniny komórek na mysz w drugiej rundzie ekspansji guza PDX.</li>
	<li>Mierz wielkość guza za pomocą suwmiarki co dwa tygodnie.</li>
	<li>Poczekaj na wielkość guza ~100 mm3 w ciągu 3-5 tygodni, losowo podziel myszy na grupy i rozpocznij leczenie.</li>
	<li>Gdy wielkość guza osiągnie maksymalną objętość zatwierdzoną przez IACUC, należy przerwać leczenie.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z powyższym protokołem zbioru guzów, aby zebrać zamrożone kawałki guza, kawałki guza do bloków parafinowych.</li>
</ol>

<ol><li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Genomic+Characterization+of+462+Melanoma+Patient-Derived+Xenografts%2C+Tumor+Biopsies%2C+and+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li>
<li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li>
<li>Paraiso, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+phospho-ERK+activity+allows+melanoma+cells+to+escape+from+BRAF+inhibitor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+Of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy.</a> British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).</li>
<li>Long, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Outcomes+in+Patients+With+BRAF+V600-Mutant+Metastatic+Melanoma+Who+Received+Dabrafenib+Combined+With+Trametinib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Hausser, H. J., Brenner, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+instability+of+Saos-2+cells+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).</li>
<li>Fiebig, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+three+human+small+cell+lung+cancer+models+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Results+In+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of three human small cell lung cancer models in nude mice.</a> Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).</li>
<li>Izumchenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+effectively+capture+responses+to+oncology+therapy+in+a+heterogeneous+cohort+of+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors.</a> Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+and+clonal+evolution+in+melanoma+during+BRAF+inhibitor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy.</a> Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).</li>
<li>Monsma, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+patient+derived+xenografts+acquire+distinct+Vemurafenib+resistance+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms.</a> American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).</li>
<li>Das Thakur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+vemurafenib+resistance+in+melanoma+reveals+a+strategy+to+forestall+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance.</a> Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).</li>
<li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX-MI%3A+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>De La Rochere, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+for+the+Study+of+Immuno-Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology.</a> Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy tutaj generowanie modeli PDX czerniaka z tkanką pacjenta pochodzącą z guzów pierwotnych i przerzutowych, biopsji gruboigłowych i FNA. Po bezpośrednim wszczepieniu do myszy NSG guzy wykazują podobne właściwości morfologiczne, genomowe i biologiczne do tych obserwowanych u pacjenta. W przypadku, gdy tylko niewielka ilość tkanki jest dostępna dla badaczy, jak to często ma miejsce w przypadku FNA, technika PDX pozwala na ekspansję tkanki nowotworowej w celu scharakteryzowania DNA, RNA i białka, a także na próby te...

Modele przedkliniczne są kluczowe dla wszystkich aspektów translacyjnych badań nad rakiem, w tym charakterystyki choroby, odkrywania podatności na działanie unikalnych dla raka w porównaniu z normalnymi komórkami, oraz rozwoju skutecznych terapii, które wykorzystują te podatności w celu zwiększenia ogólnego przeżycia pacjentów. W dziedzinie czerniaka dziesiątki tysięcy modeli linii komórkowych zostały intensywnie wykorzystane do badań przesiewowych leków, z czego >4000 zostało dostarczonych przez samą naszą grupę (seria WMXXX). Te modele linii komórkowych pochodzą od pacjentów z czerniakiem z różnymi postaciami czerniaka skóry (tj. Rozprzestrzenianie się akralne, błony naczyniowej oka i powierzchowne) i różnymi genotypami (tj. Homolog onkogenu wirusa BRAFV600 i neuroblastoma RAS [mutacja NRASQ61R]), które obejmują spektrum chorób występujących w klinice1,2.
Jednoznacznie, najbardziej skuteczna, ukierunkowana strategia terapeutyczna w dziedzinie czerniaka wyłoniła się z 1) genomowej charakterystyki guzów pacjentów identyfikujących mutacje BRAF w ~50% czerniaków3 i z 2) badania przedklinicznego wykorzystującego modele linii komórkowych czerniaka4. Kombinacja inhibitorów BRAF/MEK została zatwierdzona przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w 2014 r. do leczenia pacjentów, u których czerniak zawiera aktywujące mutacje BRAFV600E/K i może pochwalić się wskaźnikiem odpowiedzi >75%5. Pomimo tej początkowej skuteczności, oporność szybko pojawia się w prawie każdym przypadku z powodu różnorodnych wewnętrznych i nabytych mechanizmów oporności oraz niejednorodności wewnątrznowotworowej. Niestety, modele linii komórkowych nie oddają reprezentatywnej heterogeniczności biologicznej, gdy są hodowane w dwuwymiarowej kulturze w plastikowych naczyniach, co maskuje ich klinicznie predykcyjny potencjał, gdy badacze próbują eksperymentalnie określić terapie, które mogą być skuteczne u pacjentów z określoną postacią lub genotypem czerniaka6. Zrozumienie, w jaki sposób najlepiej modelować heterogeniczność wewnątrznowotworową pacjenta, pozwoli badaczom na lepsze opracowanie metod terapeutycznych, które mogą zabijać subpopulacje oporne na terapię, które prowadzą do niepowodzenia obecnych standardowych terapii.
Najważniejsze dla ograniczonej wartości predykcyjnej modeli linii komórkowych jest to, jak są one początkowo ustalane. Nieodwracalne zmiany zachodzą w krajobrazie klonalnym guza, gdy jednokomórkowa zawiesina guza pacjenta jest hodowana na dwuwymiarowych, plastikowych naczyniach do hodowli tkankowych, w tym zmiany w potencjale proliferacyjnym i inwazyjnym, eliminacja określonych subpopulacji i zmiana informacji genetycznej7. Ksenoprzeszczepy na myszach z tych modeli linii komórkowych czerniaka stanowią najczęściej wykorzystywaną platformę in vivo do badań przedklinicznych; Jednak strategia ta cierpi również z powodu słabej rekapitulacji złożonej heterogeniczności guza obserwowanej klinicznie. Aby przezwyciężyć tę wadę, rośnie zainteresowanie włączeniem bardziej wyrafinowanych modeli przedklinicznych czerniaka, w tym modelu PDX. Modele PDX są wykorzystywane od >30 lat, a przełomowe badania na pacjentach z rakiem płuc wykazały zgodność między reakcją pacjentów na czynniki cytotoksyczne a odpowiedzią modelu PDX pochodzącego od tego samego pacjenta8. Ostatnio zaczęto wykorzystywać modele PDX jako narzędzie z wyboru do badań przedklinicznych zarówno w przemyśle, jak i w ośrodkach akademickich. Modele PDX, ze względu na ich lepszą rekapitulację heterogeniczności guza u ludzi, są bardziej istotne klinicznie do wykorzystania w wysiłkach optymalizacyjnych terapii niż ksenoprzeszczepy linii komórkowych9. W czerniaku istnieją ogromne przeszkody, które utrudniają leczenie zaawansowanej choroby10. Klinicznie istotne modele PDX zostały wykorzystane do modelowania oporności klinicznej i identyfikacji strategii terapeutycznych z klinicznie dostępnymi środkami w leczeniu nowotworów opornych na terapię11,12. Krótko mówiąc, przedstawiony tutaj protokół generowania modeli PDX wymaga podskórnej implantacji świeżej tkanki z pierwotnego lub przerzutowego czerniaka (pobranej przez biopsję lub operację) myszom z zerowym receptorem NOD / scid / IL2 (NSG). Różne grupy stosują różne warianty podejścia metodologicznego; Istnieje jednak podstawowy rdzeń13.

<table><tbody><tr><td>1 M Hepes</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Kat # H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>100x PenStrep&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 15140163</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS-/- (bez Ca++ lub Mg++)</td><td>MED</td><td>Cat # MT21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsyna&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # T4549-100ML</td><td>10 mL porcje przechowywane w &ndash; 20oC</td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorheksydyna</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td># 50-118-0313</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV (2,000 u / ml)</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>Kat #4189</td><td>uzupełnić w HBSS-/- z kolagenazy IV w proszku (Worthington #4189, u/mg wskazane na butelce i różni się w zależności od partii); zamrażać 1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Nr kat. # C6295-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Kat # D4527</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (bis(eter 2-aminoetylowy) glikolu etylenowego (N,N,N' Kwas N'-tetraoctowy)</td><td>Merck</td><td>Cat # 324626.25</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td><td>Cat # 16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td><td>Cat # 15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>Cat # BW17518Z</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td><td>Cat # 050031</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik L15 firmy Leibovitz&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 21083027</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354230</td><td>Sztuczna macierz zewnątrzkomórkowa</td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>HENRY SCHEIN ZDROWIE ZWIERZĄTRekwizycja # ::Henry Schein</td><td>Kot # 025115</td><td>1-5mg/kg, jako środek przeciwbólowy</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2-receptor zerowy (NSG) Myszy</td><td>Instytut Wistar,</td><td>hodowla</td>zwierząt w obiekcie <td></td></tr><tr><td>PVA (alkohol poliwinylowy)</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Kot # P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni (Mod.) 1X z L-Glutaminą</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# MT10041CM</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Feather Cat</td><td># 2976-22</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>GALLARD-SCHLESINGER IND</td><td>Cat # 222-01-06</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do ran</td><td>MikRon</td><td>Cat #427631</td><td></td></tr></tbody></table>

model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Coraz więcej dowodów sugeruje, że właściwości molekularne i biologiczne różnią się w komórkach czerniaka hodowanych w tradycyjnych dwuwymiarowych naczyniach do hodowli tkanek w porównaniu z in vivo u pacjentów ludzkich. Wynika to z wąskiego gardła selekcji klonalnych populacji komórek czerniaka, które mogą dynamicznie rosnąć in vitro przy braku warunków fizjologicznych. Co więcej, odpowiedzi na terapię w dwuwymiarowych kulturach tkankowych ogólnie nie odzwierciedlają wiernie odpowiedzi na leczenie u pacjentów z czerniakiem, przy czym większość badań klinicznych nie wykazała skuteczności kombinacji terapeutycznych, które okazały się skuteczne in vitro. Chociaż ksenografowanie komórek czerniaka myszom zapewnia fizjologiczny kontekst in vivo, którego nie ma w dwuwymiarowych testach hodowli tkankowych, komórki czerniaka użyte do wszczepienia zostały już poddane selekcji wąskiego gardła dla komórek, które mogły rosnąć w warunkach dwuwymiarowych, gdy linia komórkowa została ustanowiona. Nieodwracalne zmiany, które zachodzą w wyniku wąskiego gardła, obejmują zmiany we właściwościach wzrostu i inwazji, a także utratę określonych subpopulacji. Dlatego modele, które lepiej oddają stan człowieka in vivo, mogą lepiej przewidywać strategie terapeutyczne, które skutecznie zwiększają całkowite przeżycie pacjentów z czerniakiem z przerzutami. Technika ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) polega na bezpośrednim wszczepieniu komórek nowotworowych od pacjenta do biorcy myszy. W ten sposób komórki nowotworowe są konsekwentnie hodowane pod wpływem stresu fizjologicznego in vivo i nigdy nie przechodzą dwuwymiarowego wąskiego gardła, co zachowuje właściwości molekularne i biologiczne obecne, gdy guz znajdował się u ludzkiego pacjenta. Warto zauważyć, że modele PDX pochodzące z miejsc narządowych przerzutów (tj. mózgu) wykazują podobną zdolność przerzutową, podczas gdy modele PDX pochodzące od pacjentów wcześniej nieleczonych i pacjentów z nabytą opornością na terapię (tj. Terapia inhibitorami BRAF/MEK) wykazują podobną wrażliwość na terapię.

Tkanka nowotworowa do modeli PDX czerniaka może pochodzić z różnych źródeł i może być przetwarzana zgodnie z dynamiką wzrostu poszczególnych modeli oraz zamierzonym zastosowaniem tkanki PDX. Priorytetem podczas tworzenia modelu PDX jest pozyskanie wystarczającej ilości materiału do bankowania na przyszłe potrzeby oraz DNA do charakterystyki (Rycina 1).
Po zgromadzeniu wystarczającej ilości materiału, tkankę nowotworową można namnożyć jedną z trzech głównych metod,...

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

PDX zrewolucjonizował eksperymentalne badania przedkliniczne nad rakiem. Możemy teraz naśladować w laboratorium to, co dzieje się u pacjentów. A teraz możemy pracować nad tym, jak przezwyciężyć opór i jak, w dłuższej perspektywie, możemy zwiększyć przeżywalność pacjentów.Procedurę zademonstruje Min Xiao. Na początek przenieś wcześniej pobraną tkankę czerniaka na sterylną szalkę Petriego. Pracując z nożyczkami chirurgicznymi, ostrzem skalpela i kleszczami, najpierw usuń normalną tkankę z normalnej tkanki w jak największym stopniu.A następnie usunąć martwiczą tkankę zidentyfikowaną przez bladą białą tkankę znajdującą się centralnie w guzie. Następnie użyj skalpela, aby podzielić początkowy fragment guza na mniej więcej równe części w celu chirurgicznej implantacji myszy. Jeśli tkanka nowotworowa jest zbyt twarda do mechanicznej dysocjacji, użyj skalpela, aby zmielić kawałki guza tak drobno, jak to możliwe, aby utworzyć zawiesinę.Przenieś gnojowicę do 50-mililitrowej probówki z zimnym zrównoważonym roztworem soli Hanka bez jonów wapnia i magnezu. Wirować 220 razy g przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić gnojowicę w 10 mililitrach podgrzanego, świeżego podłoża trawiącego na jeden gram tkanki nowotworowej.Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut i energicznie mieszaj co pięć minut jednorazową pipetą. Przemyć gnojowicę za pomocą do 50 mililitrów HBSS, odwirować przy 220 razy g przez cztery minuty w czterech stopniach Celsjusza, a następnie usunąć supernatant. Dodaj pięć mililitrów wstępnie podgrzanego buforu TEG na jeden gram tkanki nowotworowej, wstrząśnij, aby delikatnie ponownie zawiesić i umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty, bez mieszania.Aby ugasić trypsynę, dodaj co najmniej jedną równą objętość zimnego podłoża barwiącego i odwiruj 220 razy g przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu dodać 10 mililitrów pożywki barwiącej na jeden gram tkanki nowotworowej i ponownie zawiesić osad, pipetując w górę iw dół. Przefiltruj go przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki do wstrzykiwania myszy.Aby wszczepić tkankę po chirurgicznym wycięciu lub biopsji chirurgicznej, najpierw zgol włosy z dolnej części pleców znieczulonych myszy NSG w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, pozostawiając około 1,5 centymetra do trzech centymetrów obszaru bez włosów. Przygotuj kawałki guza i podziel zawiesinę guza w Petriego na pojedyncze kopce do implantacji chirurgicznej. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie o długości około pięciu milimetrów na środku grzbietu myszy.Za pomocą jednej pary kleszczy ożyw skórę po stronie nacięcia naprzeciwko operatora. Z drugiej strony za pomocą nożyczek oddziel skórę od warstwy mięśniowej, delikatnie przecinając błonę powięziową małymi nacięciami nożycowymi, tworząc w ten sposób kieszeń na tkankę nowotworową. Użyj ostrza skalpela, aby podnieść jeden uchwyt guza, a także jeden pojedynczy kopiec tkanki zawiesiny guza i delikatnie umieść tkankę w utworzonej kieszeni.Następnie dodaj 100 mikrolitrów sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na wzgórek tkanki nowotworowej w kieszeni. Za pomocą dwóch par kleszczy pociągnij nacięcie na obu końcach, tak aby krawędzie rany zbliżyły się do siebie. Następnie przyłóż jeden lub dwa klipsy do rany, aby zamknąć ranę.Podskórnie wstrzyknąć od jednego do pięciu miligramów na kilogram środka przeciwbólowego. Gdy gojenie jest całkowite, po około siedmiu dniach, usuń klipsy na rany. Monitoruj myszy raz w tygodniu, aby sprawdzić, czy nie ma wyczuwalnych guzów.Gdy guzy osiągną pożądaną objętość, użyj kleszczy chirurgicznych, aby podnieść skórę przylegającą do guza uśpionej myszy i wykonaj poziome cięcie za pomocą zakrzywionych nożyczek. Użyj techniki separacji, aby zmobilizować skórę po obu stronach guza i nad guzem, odsłaniając guz. Użyj nożyczek i ostrza skalpela, aby oddzielić guz od powięzi.Wytnij guz i przenieś go na sterylną szalkę Petriego. Pokrój guz na małe kawałki i usuń tkankę martwiczą z guza. Aby zbankować tkankę nowotworową do przyszłej implantacji, weź dwa do trzech małych kawałków guza i zmiel je na kawałki mniejsze niż jeden na jeden milimetr.Przenieś całą zmieloną tkankę do dwumililitrowego kriogenicznego podłości. Dodaj jeden mililitr zamrażarki i dobrze wymieszaj. Umieścić fiolki we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania komórek na bazie izopropanolu na suchym lodzie, przechowywać pojemnik w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc, a następnie przenieść fiolki do przechowywania ciekłego azotu.Aby zatrzasnąć zamrożoną tkankę do dalszych testów, umieść fragmenty tkanki nowotworowej w fiolce kriogenicznej, natychmiast umieść kriogeniczną tkankę w ciekłym azocie i przechowuj fiolki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Gdy porównano trzy różne metody hodowli tkanki nowotworowej, najbardziej skuteczne okazało się jednokomórkowe zawieszenie komórek nowotworowych z zastosowaniem trawienia enzymatycznego. Oprócz tego, że pozwoliło to na szybszy wzrost guza, wystarczyło również, aby jeden początkowy guz został rozszerzony na 10 do 20 myszy, podczas gdy metoda guza i zawiesiny może być rozszerzona tylko na pięć do 10 myszy.Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z czerniakiem często odzwierciedlają wrażliwość pacjenta na lek podczas terapii. Ksenoprzeszczep pochodzący od pacjenta z czerniakiem, który początkowo zareagował na inhibitor BRAF, ale ostatecznie nastąpił nawrót, wykazywał również początkową wrażliwość na hamowanie białka BRAF oraz inhibitora kinazy MEK, ale guzy ostatecznie powróciły. Bardzo ważne jest, aby zachować ostrożność podczas przygotowywania tkanki PDX do bankowania, ponieważ zapewni to sukces w przyszłych ekspansjach PDX, próbach terapeutycznych, a także charakterystyce.W przypadku materiału PDX, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, sekwencjonowanie całego eksomu i charakterystyka proteomiczna to jedne z wielu metod wykorzystywanych przez nasze laboratorium do analizy oporności na terapię. Technika PDX pozwala naukowcom badać oporność na terapię przy użyciu komórek nowotworowych, które lepiej odwzorowują biologię guza u ludzkiego pacjenta w porównaniu z tradycyjnymi modelami raka hodowanymi na plastiku. Ta zaleta pozwala na uzyskanie bardziej predykcyjnych informacji.Badacze powinni zawsze zachować ostrożność i stosować środki ostrożności drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego podczas obchodzenia się z tkanką nowotworową pochodzącą od ludzkiego pacjenta.

a-melanoma-patient-derived-xenograft-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Ten film opisuje metodę przeszczepu komórek nowotworowych z modelu dawcy czerniaka do biorcy z obniżoną odpornością, zebry Casper. Pomaga uwidocznić wszczepienie i proliferację guza u ryb biorcy.

Test przeszczepu podskórnego: metoda przeszczepiania komórek czerniaka od dawcy do biorcy modelu danio pręgowanego

Przerzuty odgrywają ogromną rolę w zjadliwości raka, odpowiadając za około 90% zgonów.  Przedstawiamy protokół dla modelu czerniaka z przerzutami u myszy, który jest przydatny do określenia skuteczności środków terapeutycznych przeciwko temu zjawisku klinicznemu.

Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Ortotopowe modele myszy z przerzutowym czerniakiem błony naczyniowej oka ludzkiej wątroby zostały stworzone przy użyciu technik chirurgicznej implantacji ortotopowej z technikami wstrzykiwania kawałków guza pochodzących od pacjenta i igieł z hodowanymi ludzkimi liniami komórkowymi czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej.

Generowanie ortotopowej platformy ksenoprzeszczepu ludzkiego czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej wątroby u myszy z niedoborem odporności

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu malformacji żylnej. Model ten opiera się na podskórnym wstrzyknięciu komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta zawierających hiperaktywujące mutacje genu TIE2 i/lub PIK3CA. Zmiany ksenoprzeszczepowe ściśle odwzorowują cechy histopatologiczne tkanki pacjenta z VM.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Obecny protokół opisuje, jak przeszczepić ludzką skórę nieotyłym myszom z cukrzycą (NOD)-scid z receptorem łańcucha gamma interleukiny-2 (NSG). W raporcie zawarto szczegółowy opis przygotowania skóry ludzkiej do przeszczepu, przygotowania myszy do przeszczepu, przeszczepu skóry ludzkiej o podzielonej grubości oraz procedury rekonwalescencji po przeszczepie.

Model skóry ksenoprzeszczepu do manipulowania ludzkimi odpowiedziami immunologicznymi in vivo

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Poznaj metodę tworzenia modeli ksenoprzeszczepu pobranych od pacjenta z czerniakiem. Technika ta umożliwia badanie biologii nowotworu i odpowiedzi na terapię w warunkach laboratoryjnych.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Przeglądaj więcej filmów