31 lipca 2019
Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.
Biorąc pod uwagę pojawiającą się rolę mikrobiomu jelitowego w różnych chorobach człowieka, kilka modulatorów mikrobiomu jelitowego, takich jak probiotyki, prebiotyki, diety i leki, może pomóc w łagodzeniu dolegliwości zdrowotnych związanych z mikrobiomem jelitowym. Jednak nie ma szybkiego i niedrogiego systemu badań przesiewowych, który pozwoliłby przewidzieć skutki takich modulatorów mikrobiomu jelitowego, ale system ten jest wystarczająco prosty, aby przewidzieć, w jaki sposób poszczególne interwencje mogą wpłynąć na mikrobiom jelitowy, co ostatecznie może wpłynąć na zdrowie gospodarza. Protokół ten jest prosty, niedrogi i praktyczny dla laboratoriów badających modulatory mikrobiomu jelitowego i ich wpływ na mikrobiotę i zdrowie gospodarza.
Utrzymanie warunków aseptycznych i beztlenowych ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu. Również próbka kału powinna być użyta ponownie, natychmiast po pobraniu. W przeciwnym razie, jeśli eksperyment jest planowany później, próbka powinna być przechowywana w temperaturze minus 80 natychmiast po pobraniu, bez wystawiania na działanie temperatury otoczenia i powietrza.
Dokładność obsługi podczas przygotowywania podwielokrotności i pipetowania jest również ważna dla utrzymania dokładności i odtwarzalności. W ciągu dnia zajmie to mniej niż 12 godzin. Możemy zbudować kulturę z dnia na dzień, jeśli będą potrzebować próbek w ciągu 24 godzin.
Następnie następuje określenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i mikrobiomu. Proces ten zostanie zademonstrowany przez dwóch wspaniałych studentów, Shokouh Ahmadi i Rabinę Mainali z mojego laboratorium. Aby przygotować pożywkę fermentacyjną pod wyciągiem, w butelce z odczynnikiem na mieszaninie magnesów, wymieszaj roztwór A, roztwór B, śladowy roztwór mineralny, rozpuszczalny w wodzie roztwór witaminy, roztwór biotyny kwasu foliowego, roztwór ryboflawiny, roztwór heminy, mieszankę krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i rezazurynę.
Następnie dodaj do butelki ekstrakt drożdżowy, węglan sodu, chlorowodorek cysteiny jednowodny i tryptykę. Dodaj 296,1 mililitra wody destylowanej, dostosuj pH za pomocą jednego normalnego chlorowodorku lub wodorotlenku sodu, aby upewnić się, że wynosi około 7,0. Przenieś zlewkę do aseptycznego stanowiska pracy i użyj filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 mikrometra do przefiltrowania pożywki do sterylizacji.
Aby przygotować jeden litr beztlenowego roztworu rozcieńczającego, rozpuść pięć gramów chlorku sodu, dwa gramy glukozy i 0,3 grama monohydratu chlorowodorku cysteiny w zjonizowanej wodzie. W autoklawie butelkę z odczynnikiem z nakrętką o temperaturze 121,1 stopni Celsjusza przez 15 minut i przechowuj ją w komorze beztlenowej. Przed rozpoczęciem doświadczenia fermentacyjnego wszystkie materiały, roztwory i narzędzia potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu fermentacyjnego należy przechowywać w komorze beztlenowej przez co najmniej 48 godzin, aby zapewnić usunięcie wszelkich pozostałości tlenu.
Co najmniej 24 godziny przed eksperymentem fermentacyjnym odważyć 300 miligramów inuliny i przenieść ją do 50-mililitrowej probówki, którą następnie umieszcza się w komorze beztlenowej. Dodaj 26 mililitrów wysterylizowanej pożywki fermentacyjnej do probówki i wymieszaj. Pozwól na nawodnienie błonnika przez około 24 godziny.
W dniu eksperymentu fermentacyjnego przygotuj inokulum kałowe. Najpierw zważ pięć gramów świeżej próbki kału w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Dodaj roztwór rozcieńczenia beztlenowego do probówki, aby osiągnąć końcową objętość 50 mililitrów.
Wirować przez 15 minut lub do całkowitej homogenizacji. Utrzymuj zaszczepione probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w komorze beztlenowej i delikatnie odwracaj raz na godzinę, aby ponownie zawiesić włókna i inokulum. Po trzech, sześciu, dziewięciu lub 24 godzinach wyjmij odpowiednią ilość sfermentowanej pożywki i odwiruj próbki z prędkością 14 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Natychmiast zamrozić supernatant i osad w ciekłym azocie, a następnie po błyskawicznym zamrożeniu przechowywać supernatant do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i granulat do analizy mikrobiomu, w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Protokół ten służy do wykazania działania określonego prebiotyku. Kał zdrowych ludzi, po leczeniu inuliną, wykazywał stosunkowo stabilne pH przez dziewięć godzin, podczas gdy po 24 godzinach drastycznie spadł.
Inokulacja inuliną znacznie zwiększyła poziom krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i mleczanu w próbkach kału poddanych działaniu inuliny w porównaniu z nieleczonymi hodowlami mikrobioty kałowej. Analiza głównych współrzędnych wykazuje odmienny skład mikrobioty w porównaniu z ważonymi i nieważonymi miarami różnorodności beta UniFrac między próbkami traktowanymi inuliną i niepoddawanymi działaniu inuliny. Wskaźniki różnorodności alfa w porównaniu z różnorodnością filogenetyczną poprzez całe drzewo PD, bogactwo gatunków, operacyjne jednostki taksonomiczne, równomierność gatunków, a także względną liczebność głównych typów i rodzajów, wszystkie wykazują różne sygnatury mikrobioty jelitowej między próbkami traktowanymi inuliną i nieleczonymi.
Kladogram taksonomiczny, wyprowadzony z liniowej analizy wielkości efektu dyskryminacyjnego sekwencji 16S, przedstawia zróżnicowane taksony między różnymi grupami próbek. Postępuj zgodnie ze wszystkimi krokami. Najważniejsze jest zachowanie ścisłych warunków aseptycznych i beztlenowych.
Supernatant i z eksperymentu może być stosowany do leczenia zmian poziomu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w wyniku fermentacji na bazie włókien. Dodatkowo w granulce można wykorzystać do analizy zmian w składzie mikrobiomu jelitowego. Niektóre substancje chemiczne używane do produkcji pożywek hodowlanych są potencjalnie niebezpieczne.
Proszę o kartę charakterystyki i podejmij odpowiednie środki ostrożności.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejszy protokół opisuje system fermentacji okresowej in vitro ludzkiej mikrobioty jelitowej, wykorzystujący inulinę do oceny wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty jelitowej oraz jej aktywność metaboliczną.
Wysokoprzepustowe modele hodowli okresowych in vitro dla ludzkiej mikrobioty kałowej umożliwiają szybkie i skalowalne przesiewanie modulatorów mikrobiomu bez konieczności polegania na badaniach na zwierzętach lub ludziach. Podejście to wspiera wczesne ograniczanie ryzyka w przypadku kandydowanych interwencji, dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych na temat składu mikrobioty oraz produktów metabolicznych. Integracja takich modeli z procesami odkrywania przyspiesza ocenę prebiotyków, probiotyków i związków dietetycznych w ramach portfolio produktów dla zdrowia jelit.
Ten in vitro model hodowli okresowej znajduje zastosowanie na etapie przejściowym między wczesnym etapem odkrywania a identyfikacją związku wiodącego, dostarczając przydatnych danych przed rozpoczęciem przedklinicznych badań in vivo.