Name: Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj metodę fermentacji in vitro kału ludzkiego do oceny wpływu prebiotyków na mikrobiom jelitowy. Protokół umożliwia badanie składu mikrobioty i aktywności metabolicznej w warunkach beztlenowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Centrum Cukrzycy, Otyłości i Metabolizmu oraz Centrum Nauk Klinicznych i Translacyjnych, Wake Forest School of Medicine, funduszy Departamentu Obrony (numer grantu: W81XWH-18-1-0118), Kermit Glenn Phillips II Chair in Cardiovascular Medicine; National Institutes of Health ufundowało Claude D. Pepper Older Americans Center (ufundowane przez P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 oraz Centrum Nauk Klinicznych i Translacyjnych (Clinical Research Unit, finansowany przez UL1TR001420), również są wdzięczni. Dziękujemy również ochotnikom za dostarczenie próbek kału oraz pozostałym członkom naszego laboratorium za ich pomoc techniczną podczas tego eksperymentu.

UWAGA: Zapoznaj się z odpowiednimi Kartami Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej i postępuj zgodnie z instrukcjami i wytycznymi dotyczącymi odpowiedniego szkolenia na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Postępuj zgodnie ze wszystkimi krokami hodowli zgodnie ze standardowymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego i używaj szafki BSL-2 w warunkach aseptycznych. Ponadto próbki kału pochodzące z różnych modeli i osób pochodzenia ludzkiego mogą stwarzać potencjalne ryzyko rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez drobnoustroje. W przypadku wystąpienia jakichkolwiek obrażeń i infekcji należy natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną. Ponadto stosowanie próbek kału ludzkiego i zwierzęcego powinno być zatwierdzone przez instytucjonalne komisje etyczne i musi być zgodne z protokołami dotyczącymi wykorzystywania próbek i informacji o uczestnikach.
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki hodowlanej, przygotowanie dziewięciu rodzajów roztworów podstawowych
	<ol>
		<li>Roztwór A (1 000 ml): Rozpuścić 5,4 g chlorku sodu (NaCl), 2,7 g diwodorofosforanu potasu (KH2PO4), 0,16 g dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl2·2H2O), 0,12 g sześciowodnego chlorku magnezu (MgCl2·6H2O), 0,06 g czterowodnego chlorku manganu (MnCl2·4H2O), 0,06 g sześciowodnego chlorku kobaltu (CoCl2·6H2O) i 5,4 g siarczanu amonu (NH4)2SO4 w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość 1,000 ml.</li>
		<li>Roztwór B (1,000 ml): Rozpuść 2,7 g wodorofosforanu potasu (K2HPO4) w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość do 1000 ml.</li>
		<li>Śladowy roztwór mineralny (1 000 ml): Rozpuścić 500 mg disodowego dwuwodnego etylenodiaminy-tetraoctanu (Na2EDTA), 200 mg siedmiowodnego siarczanu żelazawego (FeSO4·7H2O), 10 mg siedmiowodnego siarczanu (ZnSO4·7H2O), 3 mg czterowodnego chlorku manganu(II) (MnCl2·4H2O), 30 mg kwasu fosforowego (H3P4 O), 20 mg CoCl2·6H2O, 1 mg dwuwodnego chlorku miedzi (CuCl2·2H2O), 2 mg sześciowodnego chlorku niklu(II) (NiCl2·6H2O) i 3 mg dwuwodnego molibdenianu sodu (Na2MoO4·2H2O) w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość 1 000 ml. 
		nuta: To rozwiązanie jest wrażliwe na światło, dlatego należy je przechowywać w ciemnych/czarnych lub aluminiowych tubach/butelkach.</li>
		<li>Rozpuszczalny w wodzie roztwór witaminowy (1,000 ml): Rozpuść 100 mg chlorowodorku tiaminy (Tiamina-HCl), 100 mg kwasu D-pantotenowego, 100 mg niacyny, 100 mg pirydoksyny, 5 mg kwasu P-aminobenzoesowego i 0,25 mg witaminy B12 w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość 1,000 ml.</li>
		<li>Folian: roztwór biotyny (1 000 ml): Rozpuść 10 mg kwasu foliowego, 2 mg D-biotyny i 100 mg wodorowęglanu amonu (NH4HCO3) w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość do 1 000 ml.</li>
		<li>Roztwór ryboflawiny (1 000 ml): Rozpuścić 10 mg ryboflawiny w 5 mM roztworze HEPES (1,19 g/l), aby uzyskać całkowitą objętość do 1,000 ml.</li>
		<li>Roztwór Hemina (10 ml): Rozpuścić 5 000 mg Hemina w 10 mM roztworze wodorotlenku sodu (NaOH) (0,4 g/l), aby uzyskać całkowitą objętość do 10 ml.</li>
		<li>Mieszanka krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (10 ml): Połącz 2,5 ml N-walerianianu, 2,5 ml izowalerianianu, 2,5 ml izomaślanu i 2,5 ml: DL-α-metylomaślan. 
		nuta: To rozwiązanie jest zalecane do stosowania w dygestorium, aby uniknąć zapachu i oparów.</li>
		<li>Rezazuryna (1 000 ml): Rozpuść 1 g rezazuryny w wodzie dejonizowanej i uzyskaj całkowitą objętość do 1 000 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka stosowana do fermentacji beztlenowej in vitro
	<ol>
		<li>Aby przygotować tę pożywkę, wymieszaj 330 ml roztworu A, 330 ml roztworu B, 10 ml śladowego roztworu mineralnego, 20 ml roztworu witamin rozpuszczalnych w wodzie, 5 ml roztworu kwasu foliowego: biotyna, 5 ml roztworu ryboflawiny; 2,5 ml roztworu Hemin, 0,4 ml mieszanki krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, 1 ml resazuryny, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 4 g węglanu sodu (Na2CO3 ), 0,5 g cysteiny HCl-H2O i 0,5 g tryptykazy oraz dodać 296,1 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Sprawdź pH i upewnij się, że wynosi około 7,0, jeśli nie, dostosuj pH za pomocą 1 N HCl lub 1 N NaOH. Sterylizuj przez próżniowe filtrowanie pożywki za pomocą filtra butelkowego pod aseptyczną stacją roboczą.</li>
		<li>Alternatywnie, wymieszać wszystkie składniki (z wyjątkiem roztworów witamin i heminy) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Jednocześnie przefiltruj i wysterylizuj roztwory witamin i hemin za pomocą filtrów membranowych 0,22 μm i dodaj je do autoklawowanych i schłodzonych mediów przed dozowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory beztlenowej i wymaganego materiału
<ol>
	<li>Wszystkie materiały, roztwory i narzędzia potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu fermentacyjnego należy przechowywać w komorze beztlenowej co najmniej 48 godzin przed rozpoczęciem doświadczenia, aby upewnić się, że wszelkie pozostałości tlenu związane z narzędziami i tlenem rozpuszczalnym w/roztworach zostały usunięte, a wszystkie materiały zaaklimatyzowały się do ustalonych warunków beztlenowych><.
	nuta: Materiały potrzebne w komorze beztlenowej (48 godzin przed rozpoczęciem doświadczenia): (i) pożywka fermentacyjna; (ii) roztwór beztlenowy (przygotowany zgodnie z sekcją 4.1), iii) wirownik, (iv) waga ważąca, (v) muślinowe ściereczki serowe, (vi) nożyczki, (vii) lejek, (viii) probówki 1,5, 2,0, 15, 50 ml, (ix) pipetory (2, 20, 200 i 1 000 μl) i kompatybilne końcówki do pipet, (x) pipety pistoletowe i pipety (5 i 10 ml), (xi) chusteczki papierowe, (xii) markery, (xiii) stojaki na probówki dla różnych probówek; (xiv) pojemnik na odpady, (xv) wskaźnik O2 i (xvi) butelka z rozpylaczem 70% etanolu (środek dezynfekujący).</li>
</ol>
3. Przygotowanie rurek i włókien
<ol>
	<li>Odważyć 300 mg inuliny i przenieść do probówki o pojemności 50 ml, a następnie aseptycznie dodać 26 ml pożywki fermentacyjnej już przygotowanej i przechowywanej w komorze beztlenowej. Przygotować jedną probówkę ślepą dla każdego rodzaju próbki kału i probówkę (probówki) doświadczalną (w zależności od liczby badanych związków) w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Pozostawić te probówki w komorze beztlenowej na około 24 godziny, aby umożliwić uwodnienie próbek przed rozpoczęciem eksperymentu fermentacji. Upewnij się, że temperatura probówki wynosi 37 °C w momencie zaszczepiania, dlatego umieść probówki w inkubatorze zamkniętym w komorze beztlenowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie inokulum
<ol>
	<li>Roztwór do rozcieńczania beztlenowego (co najmniej 48 godzin przed eksperymentem fermentacyjnym): Rozpuścić 5 g NaCl, 2 g glukozy i 0,3 g cysteiny-HCl w wodzie dejonizowanej i uzyskać całkowitą objętość do 1 000 ml. Autoklaw i przechowywać w komorze beztlenowej co najmniej 48 godzin przed użyciem.</li>
	<li>Przygotowanie inokulum kałowego (w dniu eksperymentu fermentacji): Zważyć 5 g świeżej próbki kału w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, dodać roztwór rozcieńczający beztlenowy do uzyskania końcowej objętości 50 ml (1:10 w/v) i wirować przez 15 minut lub do całkowitej homogenizacji. Przefiltrować homogenizowaną mieszaninę przez 4 warstwy sterylnej gazy (autoklawowanej) i natychmiast użyć do zaszczepienia w probówkach zawierających pożywkę. 
	nuta: Próbki kału od grupy badanych można połączyć, jeśli celem eksperymentalnym jest porównanie wpływu danego związku/składnika na ogólną zdrową i chorą mikrobiotę kałową w ogóle.</li>
</ol>
5. Fermentacja i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Przygotować probówki zgodnie z sekcją 4.2 i zaszczepić probówki ślepe/kontrolne i eksperymentalne 4 ml rozcieńczonego i przefiltrowanego inokulum kałowego. Inkubować zaszczepione probówki w temperaturze 37 °C w komorze beztlenowej. Potrząsaj probówkami raz na godzinę, delikatnie odwracając, aby ponownie zawiesić włókna i inokulum.</li>
	<li>Próbki pobierać tak często, jak to konieczne, na przykład co godzinę do 0, 3, 6, 9 i 24 godzin podczas fermentacji, pobierając podwielokrotną próbkę o objętości 2 ml do probówki o pojemności 2 ml z odpowiednich probówek fermentacyjnych.</li>
	<li>Zmierzyć pH podwielokrotności za pomocą laboratoryjnego pH-metru (poprzez bezpośrednie wprowadzenie elektrody pH do próbki); odwirować pozostałą próbkę przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Natychmiast zamrozić supernatant i osad w ciekłym azocie, a po szybkim zamrożeniu przechowywać supernatant do analizy SCFA i osad do analizy mikrobiomu w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) i kwantyfikacja mleczanów
UWAGA: SCFA i mleczan w supernatancie hodowli mikrobiomu mogą być mierzone dokładnie według metod opisanych gdzie indziej13,14,15,16.
<ol>
	<li>Pokrótce rozmrozić zamrożone supernatanty otrzymane w sekcji 5 z próbek kontrolnych i poddanych działaniu substancji na lodzie i przeprowadzić wszystkie dalsze etapy przetwarzania na lodzie. Przefiltrować supernatant przez filtr membranowy 0,45 μm i użyć próbek bezkomórkowych do pomiaru stężeń SCFA i mleczanu za pomocą systemu HPLC z detektorem DAD przy 210 nm, wyposażonym w kolumnę HPX-87H. Na każdą próbkę należy wprowadzić objętość 10 μl, a następnieH2SO4 (0,005 N) wymyć kolumnę przy natężeniu przepływu 0,6 ml/min w temperaturze 35 °C.</li>
</ol>
7. Analiza mikrobiomu kałowego
UWAGA: Przeprowadź analizę mikrobiomu zgodnie z metodami i procedurami opisanymi w innym miejscu7,13,14,17.
<ol>
	<li>Krótko mówiąc, wyekstrahuj genomowe DNA z około 200 mg granulek gnojowicy kałowej za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA kałowego13.</li>
	<li>Amplifikuj hiperzmienny region bakteryjnego genu 16S rRNA za pomocą starterów z kodami kreskowymi zgodnie z metodą opisaną w innym miejscu13, używając sekwencji starterów zgodnie z opisem w protokole Earth Microbiome Project18.</li>
	<li>Oczyść powstałe amplikony za pomocą magnetycznych kulek oczyszczających i oznacz ilościowo za pomocą Picogreen lub równoważnej metody. Zbierz oczyszczone produkty PCR w równym stężeniu molowym i sekwencjonuj na sekwenserze 13.</li>
	<li>Przetwarzaj wynikowe sekwencje w celu demultipleksowania, filtrowania jakości i grupowania, przypisywania taksonomicznego i rozrzedzania oraz analiz dalszych za pomocą oprogramowania Quantitative Insights in Microbial Ecology (QIIME) zgodnie z metodami opisanymi przez Caporaso et al.19.</li>
</ol>

<ol><li>Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome+in+health+and+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome in health and in disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).</li>
<li>Xu, Z., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+effects+on+human+gut+microbiome+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Dietary effects on human gut microbiome diversity.</a> British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).</li>
<li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+and+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimers+Disease%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota and Alzheimer’s disease.</a> Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+gut+microbiota+on+human+health%3A+an+integrative+view%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Cell%22%5BJournal%5D)">The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view.</a> The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).</li>
<li>Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+mediated+modulation+of+gut+flora+might+be+biotherapeutical+approach+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics+%3A+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes.</a> Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).</li>
<li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+Polysaccharides+in+the+Amelioration+of+Gut+Microbiome+Dysbiosis+and+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+and+Control+Theries%3A+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases.</a> Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).</li>
<li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-Linked+Gut+Microbiome+Dysbiosis+Associated+with+Derangements+in+Gut+Permeability+and+Intestinal+Cellular+Homeostasis+Independent+of+Diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet.</a> Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).</li>
<li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+diet+and+the+gut+microbiome+on+epigenetic+modulation+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases.</a> Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112(2015).</li>
<li>O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+tryptophan+metabolism+and+the+brain-gut-microbiome+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis.</a> Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).</li>
<li>Sharon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+metabolites+from+the+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Specialized metabolites from the microbiome in health and disease.</a> Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).</li>
<li>Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+digestion+and+fermentation+characteristics+of+temulose+molasses%2C+a+coproduct+of+fiberboard+production%2C+and+select+temulose+fractions+using+canine+fecal+inoculum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum.</a> Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).</li>
<li>Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetable+fiber+fermentation+by+human+fecal+bacteria%3A+cell+wall+polysaccharide+disappearance+and+short-chain+fatty+acid+production+during+in+vitro+fermentation+and+water-holding+capacity+of+unfermented+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues.</a> Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).</li>
<li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short-chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).</li>
<li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+microbiome+signatures+and+short-chain+fatty+acids+in+mouse%2C+rat%2C+non-human+primate+and+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2897(2018).</li>
<li>Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-induced+decreases+in+the+levels+of+microbial-derived+short-chain+fatty+acids+promote+gastrointestinal+colonization+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans.</a> bioRxiv. , 428474(2018).</li>
<li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prebiotics+from+acorn+and+sago+prevent+high-fat+diet-induced+insulin+resistance+via+microbiome-gut-brain+axis+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutritional+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).</li>
<li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Microbiome+Composition+in+Non-human+Primates+Consuming+a+Western+or+Mediterranean+Diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 28(2018).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Garcia-Villalba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+method+for+gas+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Seperation+Science%22%5BJournal%5D)">Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples.</a> Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).</li>
<li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+vs+Fresh+Fecal+Microbiota+Transplantation+and+Clinical+Resolution+of+Diarrhea+in+Patients+With+Recurrent+Clostridium+difficile+Infection%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).</li>
<li>Chen, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fermentation+of+xylooligosaccharides+produced+from+Miscanthus%C3%97+giganteus+by+human+fecal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).</li>
<li>Cook, S., Sellin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+chain+fatty+acids+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alimentary+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Short chain fatty acids in health and disease.</a> Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).</li>
<li>Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbes+and+health%3A+a+focus+on+the+mechanisms+linking+microbes%2C+obesity%2C+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders.</a> Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-mediated+nourishment+of+gut+microbiota+protects+against+diet-induced+obesity+by+restoring+IL-22-mediated+colonic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health.</a> Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).</li>
<li>Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut%E2%80%93brain+axis+in+2016%3A+Brain%E2%80%93gut%E2%80%93microbiota+axis%E2%80%94mood%2C+metabolism+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj model fermentacji gnojowicy kałowej in vitro jest prostym modelem jednowsadowym służącym do przybliżonego określenia wpływu różnych substratów i szczepów drobnoustrojów (np. prebiotyków i probiotyków) na skład ludzkiej mikrobioty kałowej, a także na jej aktywność metaboliczną pod względem pH kału i poziomów SCFA. Przedstawione w niniejszym dokumencie wyniki pokazują, że inokulacja inuliną obniża pH kału i znacznie zwiększa poziom SCFA i mleczanu w próbkach kału poddanych inulinie w porównaniu z nielec...

Mikrobiota człowieka to złożona społeczność składająca się z bakterii, archeonów, wirusów i mikrobów eukariotycznych1, które zamieszkują ludzkie ciało wewnętrznie i zewnętrznie. Najnowsze dowody wykazały fundamentalną rolę mikrobioty jelitowej i mikrobiomu jelitowego (całego zbioru drobnoustrojów i ich genów znajdujących się w przewodzie pokarmowym człowieka) w różnych chorobach człowieka, w tym otyłości, cukrzycy, chorobach układu krążenia i nowotworach1,2,3. Dodatkowo mikroorganizmy żyjące w naszych jelitach wytwarzają szerokie spektrum metabolitów, które znacząco wpływają na nasze zdrowie, a także mogą przyczyniać się do patofizjologii wielu chorób, a także różnych funkcji metabolicznych4,5. Nieprawidłowe zmiany (perturbacje) w składzie i funkcji tej populacji drobnoustrojów jelitowych są ogólnie określane jako "dysbioza jelitowa". Dysbioza jest zwykle związana z niezdrowym stanem gospodarza, a zatem można ją odróżnić od normalnej (homeostatycznej) społeczności drobnoustrojów związanej ze zdrowym stanem kontrolnym gospodarza. Specyficzne wzorce dysbiozy mikrobiomu jelitowego są często spotykane w różnych chorobach1,2,3,6,7.
Fermentacja niestrawionego pokarmu, szczególnie fermentujących węglowodanów/włókien, przez mikrobiotę jelitową nie tylko dostarcza energii, ale także wytwarza rozbieżne metabolity, w tym krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA), mleczan, mrówczan, dwutlenek węgla, metan, wodór i etanol6. Ponadto mikrobiota jelitowa wytwarza również szereg innych substancji bioaktywnych, takich jak kwas foliowy, biotyna, N-tlenek trimetyloaminy, serotonina, tryptofan, kwas gamma-aminomasłowy, dopamina, noradrenalina, acetylocholina, histamina, kwas dezoksycholowy i siarczan 4-etylofenylu. Dzieje się tak przede wszystkim poprzez wykorzystanie wewnętrznych przepływów metabolicznych w niszy mikroorganizmów gospodarza, które przyczyniają się do kilku procesów zachodzących w organizmie, funkcji metabolicznych i zmian epigenetycznych1,8,9,10. Jednak wpływ różnych interwencji na takie produkty mikrobiologiczne pozostaje nieznany lub niejasny ze względu na brak łatwych, skutecznych i powtarzalnych protokołów. Skład mikrobioty jelitowej człowieka jest niezwykle złożonym i zróżnicowanym ekosystemem, w związku z czym wiele pytań dotyczących jego roli w zdrowiu człowieka i patologii chorób wciąż pozostaje bez odpowiedzi. Wpływ wielu powszechnych modulatorów mikrobiomu jelitowego (np. probiotyków, prebiotyków, antybiotyków, przeszczepów kału i infekcji) na skład i funkcje metaboliczne mikrobioty jelitowej pozostaje w dużej mierze nieuchwytny. Ponadto zbadanie i walidacja tych skutków in vivo jest trudna, zwłaszcza że większość składników odżywczych i metabolitów wytwarzanych przez mikrobiotę jelitową jest wchłaniana lub usuwana jednocześnie i szybko w jelitach; w związku z tym pomiar produkcji, ilości i przetwarzania tych metabolitów (np. SCFA) in vivo nadal pozostaje praktycznym wyzwaniem. Rzeczywiście, modele fizjologiczne, takie jak zwierzęta i ludzie, mają kluczowe znaczenie dla określenia roli mikrobiomu jelitowego i jego modulacji dla zdrowia gospodarza, ale mogą one nie być odpowiednie do badań przesiewowych na dużą skalę różnych typów modulatorów mikrobiomu ze względu na ograniczenia etyczne, pieniężne lub czasowe. W tym celu modele in vitro lub ex vivo, takie jak hodowla mikrobioty jelitowej in vitro, a następnie interwencja z różnymi modulatorami mikrobioty, mogą zapewnić możliwość zaoszczędzenia czasu i pieniędzy, a tym samym mogą umożliwić wstępne lub zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe różnych składników (takich jak probiotyki, prebiotyki i inne związki interwencyjne) w celu zbadania/przewidzenia ich wpływu na różnorodność mikrobioty kałowej. skład i profile metaboliczne. Badania wykorzystujące takie systemy mikrobiomu jelitowego in vitro i ex vivo mogą ułatwić dalsze zrozumienie interakcji gospodarz-mikrobiom, które przyczyniają się do zdrowia i choroby gospodarza, a także mogą prowadzić do znalezienia nowych terapii ukierunkowanych na mikrobiom w celu poprawy zdrowia gospodarza oraz zapobiegania i leczenia różnych chorób1.
Chociaż systemy hodowli mikrobioty jelitowej in vitro nie są w stanie odtworzyć rzeczywistych warunków jelitowych, kilka laboratoriów podjęło próbę opracowania takich modeli, z których niektóre okazały się do pewnego stopnia wykonalne i zostały z powodzeniem wykorzystane do różnych celów. Jednym z najnowszych modeli jelitowych jest symulator ekosystemu mikroorganizmów jelitowych człowieka, który naśladuje cały ludzki przewód pokarmowy, w tym żołądek, jelito cienkie i różne obszary okrężnicy. Jednak tak skomplikowane technicznie modele mogą nie być dostępne dla innych ośrodków badawczych na całym świecie. W związku z tym nadal istnieje pilna potrzeba opracowania nowych alternatywnych modeli, które są stosunkowo proste, przystępne cenowo i praktyczne dla laboratoriów badających modulatory mikrobiomu i ich wpływ na mikrobiotę jelitową i zdrowie gospodarza. W związku z tym zastosowanie systemu hodowli mikrobioty kałowej in vitro (lub ex vivo) byłoby przydatne do badania efektów takich interwencji11,12. W szczególności można badać wpływ różnych prebiotyków na zdolność fermentacji mikrobioty pod względem okresowych zmian w różnorodności i składzie mikrobioty jelitowej, pH kału oraz poziomów metabolitów drobnoustrojów, w tym SCFA i mleczanu13. W niniejszym artykule, wykorzystując inulinę (jeden z najszerzej badanych składników prebiotycznych) jako przykład modulatora mikrobiomu, opisano krok po kroku protokół tego prostego systemu hodowli wsadowej mikrobioty ex vivo, aby zademonstrować jego zastosowanie do oszacowania zmian w mikrobiocie kałowej i metabolitach drobnoustrojów po interwencji z modulatorami mikrobiomu.

<table><tbody><tr><td>Wodorowęglan amonu (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>217255</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu (NH4)2SO4 </td><td>TGI</td><td>C2388</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2&bull; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>sześciowodny chlorek kobaltu (CoCl2&bull; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat chlorku miedzi (CuCl2&bull; 2H2O)</td><td>Acros organics</td><td>2063450000</td><td>Toksyczny, drażniący</td></tr><tr><td>Cysteina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C121800</td><td></td></tr><tr><td>D-biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-pantotenowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16609</td><td></td></tr><tr><td>Disodium Ethylenodiaminetetraoctan Dihydrat (Na2EDTA)</td><td>Biorad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>DL-&alfa;-metylomaślan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W271918</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelazawy siedmiowodny (FeSO4&bull; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>kwas foliowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62937</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14777</td><td></td></tr><tr><td>Izomaślan</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04038</td><td></td></tr><tr><td>Izowalerianian</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18642</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2&bull; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat chlorku manganu (MnCl2&bull; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>Niacyna (kwas nikotynowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek niklu(Ii) (NiCl2&bull; 6H2O)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14366</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>N-walerianian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240370</td><td></td></tr><tr><td>Kwas P-aminobenzoesowy</td><td>MP Chiny</td><td>102569</td><td>Toksyczny, drażniący</td></tr><tr><td>kwas fosforowy (H3PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5811</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan potasu (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12041</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>Ryboflawina</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11764</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1613757</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher BioOdczynniki</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat molibdenianu sodu (Na2MoO4&bull; 2H2O)</td><td>Acros organics</td><td>206375000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tiaminy (Tiamina-HCl)</td><td>Acros organics</td><td>148991000</td><td></td></tr><tr><td>Tryptikaza</td><td>BD Biosciences</td><td>211921</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny (ZnSO4&bull; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mikro; m filtr</td><td></td><td></td><td></td>membranowy</tr><tr><td>Magnetyczne kulki oczyszczające AMPure</td><td>Agencourt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora beztlenowa z inkubatorem</td><td>System beztlenowy Forma, Thermo Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheesecut</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer Illumina MiSeq</td><td>zestaw odczynników Miseq v3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PowerFecal kit</td><td>Qiagen</td> Oprogramowanie <td></td> Qiagen <td></td></tr><tr><td>Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)</td> Fluorymetr Qubit-3 InVitrogen Vortex Thermoscientific Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Rosnąca rola mikrobiomu jelitowego w wielu chorobach człowieka wymaga przełomu nowych narzędzi, technik i technologii. Takie ulepszenia są potrzebne, aby rozszyfrować wykorzystanie modulatorów mikrobiomu w celu uzyskania korzyści dla zdrowia ludzkiego. Jednak badania przesiewowe na dużą skalę i optymalizacja modulatorów w celu walidacji modulacji mikrobiomu i przewidywania związanych z nią korzyści zdrowotnych mogą być praktycznie trudne ze względu na zapotrzebowanie na dużą liczbę zwierząt i/lub ludzi. W tym celu modele in vitro lub ex vivo mogą ułatwić wstępne badania przesiewowe modulatorów mikrobiomu. W tym celu zoptymalizowano i zademonstrowano system hodowli mikrobioty kałowej ex vivo, który można wykorzystać do badania wpływu różnych interwencji modulatorów mikrobiomu jelitowego, w tym probiotyków, prebiotyków i innych składników żywności, oprócz nutraceutyków i leków, na różnorodność i skład ludzkiej mikrobioty jelitowej. Inulina, jeden z najszerzej przebadanych związków prebiotycznych i modulatorów mikrobiomu, jest tutaj wykorzystywana jako przykład w celu zbadania jej wpływu na skład zdrowej mikrobioty kałowej i jej aktywność metaboliczną, taką jak pH kału i poziom kwasów organicznych w kale, w tym mleczanu i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) w kale. Protokół może być przydatny w badaniach mających na celu oszacowanie wpływu różnych interwencji modulatorów na profile mikrobioty kałowej oraz przewidywanie ich wpływu na zdrowie.

Protokół służy do wykazania wpływu konkretnego prebiotyku (tj. inuliny) na skład mikrobioty i aktywność metaboliczną w postaci zmian pH kału oraz stężenia mleczanu i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) w kału zdrowych ochotników w różnych punktach czasowych po zastosowaniu inuliny. pH kału, poziomy mleczanu i SCFA w kale (Rycina 1) oraz skład mikrobioty (Rycina 2 i Rycina 3) są mierzone w 0...

Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Biorąc pod uwagę pojawiającą się rolę mikrobiomu jelitowego w różnych chorobach człowieka, kilka modulatorów mikrobiomu jelitowego, takich jak probiotyki, prebiotyki, diety i leki, może pomóc w łagodzeniu dolegliwości zdrowotnych związanych z mikrobiomem jelitowym. Jednak nie ma szybkiego i niedrogiego systemu badań przesiewowych, który pozwoliłby przewidzieć skutki takich modulatorów mikrobiomu jelitowego, ale system ten jest wystarczająco prosty, aby przewidzieć, w jaki sposób poszczególne interwencje mogą wpłynąć na mikrobiom jelitowy, co ostatecznie może wpłynąć na zdrowie gospodarza. Protokół ten jest prosty, niedrogi i praktyczny dla laboratoriów badających modulatory mikrobiomu jelitowego i ich wpływ na mikrobiotę i zdrowie gospodarza.Utrzymanie warunków aseptycznych i beztlenowych ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu. Również próbka kału powinna być użyta ponownie, natychmiast po pobraniu. W przeciwnym razie, jeśli eksperyment jest planowany później, próbka powinna być przechowywana w temperaturze minus 80 natychmiast po pobraniu, bez wystawiania na działanie temperatury otoczenia i powietrza.Dokładność obsługi podczas przygotowywania podwielokrotności i pipetowania jest również ważna dla utrzymania dokładności i odtwarzalności. W ciągu dnia zajmie to mniej niż 12 godzin. Możemy zbudować kulturę z dnia na dzień, jeśli będą potrzebować próbek w ciągu 24 godzin.Następnie następuje określenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i mikrobiomu. Proces ten zostanie zademonstrowany przez dwóch wspaniałych studentów, Shokouh Ahmadi i Rabinę Mainali z mojego laboratorium. Aby przygotować pożywkę fermentacyjną pod wyciągiem, w butelce z odczynnikiem na mieszaninie magnesów, wymieszaj roztwór A, roztwór B, śladowy roztwór mineralny, rozpuszczalny w wodzie roztwór witaminy, roztwór biotyny kwasu foliowego, roztwór ryboflawiny, roztwór heminy, mieszankę krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i rezazurynę.Następnie dodaj do butelki ekstrakt drożdżowy, węglan sodu, chlorowodorek cysteiny jednowodny i tryptykę. Dodaj 296,1 mililitra wody destylowanej, dostosuj pH za pomocą jednego normalnego chlorowodorku lub wodorotlenku sodu, aby upewnić się, że wynosi około 7,0. Przenieś zlewkę do aseptycznego stanowiska pracy i użyj filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 mikrometra do przefiltrowania pożywki do sterylizacji.Aby przygotować jeden litr beztlenowego roztworu rozcieńczającego, rozpuść pięć gramów chlorku sodu, dwa gramy glukozy i 0,3 grama monohydratu chlorowodorku cysteiny w zjonizowanej wodzie. W autoklawie butelkę z odczynnikiem z nakrętką o temperaturze 121,1 stopni Celsjusza przez 15 minut i przechowuj ją w komorze beztlenowej. Przed rozpoczęciem doświadczenia fermentacyjnego wszystkie materiały, roztwory i narzędzia potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu fermentacyjnego należy przechowywać w komorze beztlenowej przez co najmniej 48 godzin, aby zapewnić usunięcie wszelkich pozostałości tlenu.Co najmniej 24 godziny przed eksperymentem fermentacyjnym odważyć 300 miligramów inuliny i przenieść ją do 50-mililitrowej probówki, którą następnie umieszcza się w komorze beztlenowej. Dodaj 26 mililitrów wysterylizowanej pożywki fermentacyjnej do probówki i wymieszaj. Pozwól na nawodnienie błonnika przez około 24 godziny.W dniu eksperymentu fermentacyjnego przygotuj inokulum kałowe. Najpierw zważ pięć gramów świeżej próbki kału w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Dodaj roztwór rozcieńczenia beztlenowego do probówki, aby osiągnąć końcową objętość 50 mililitrów.Wirować przez 15 minut lub do całkowitej homogenizacji. Utrzymuj zaszczepione probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w komorze beztlenowej i delikatnie odwracaj raz na godzinę, aby ponownie zawiesić włókna i inokulum. Po trzech, sześciu, dziewięciu lub 24 godzinach wyjmij odpowiednią ilość sfermentowanej pożywki i odwiruj próbki z prędkością 14 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Natychmiast zamrozić supernatant i osad w ciekłym azocie, a następnie po błyskawicznym zamrożeniu przechowywać supernatant do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i granulat do analizy mikrobiomu, w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Protokół ten służy do wykazania działania określonego prebiotyku. Kał zdrowych ludzi, po leczeniu inuliną, wykazywał stosunkowo stabilne pH przez dziewięć godzin, podczas gdy po 24 godzinach drastycznie spadł.Inokulacja inuliną znacznie zwiększyła poziom krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i mleczanu w próbkach kału poddanych działaniu inuliny w porównaniu z nieleczonymi hodowlami mikrobioty kałowej. Analiza głównych współrzędnych wykazuje odmienny skład mikrobioty w porównaniu z ważonymi i nieważonymi miarami różnorodności beta UniFrac między próbkami traktowanymi inuliną i niepoddawanymi działaniu inuliny. Wskaźniki różnorodności alfa w porównaniu z różnorodnością filogenetyczną poprzez całe drzewo PD, bogactwo gatunków, operacyjne jednostki taksonomiczne, równomierność gatunków, a także względną liczebność głównych typów i rodzajów, wszystkie wykazują różne sygnatury mikrobioty jelitowej między próbkami traktowanymi inuliną i nieleczonymi.Kladogram taksonomiczny, wyprowadzony z liniowej analizy wielkości efektu dyskryminacyjnego sekwencji 16S, przedstawia zróżnicowane taksony między różnymi grupami próbek. Postępuj zgodnie ze wszystkimi krokami. Najważniejsze jest zachowanie ścisłych warunków aseptycznych i beztlenowych.Supernatant i z eksperymentu może być stosowany do leczenia zmian poziomu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w wyniku fermentacji na bazie włókien. Dodatkowo w granulce można wykorzystać do analizy zmian w składzie mikrobiomu jelitowego. Niektóre substancje chemiczne używane do produkcji pożywek hodowlanych są potencjalnie niebezpieczne.Proszę o kartę charakterystyki i podejmij odpowiednie środki ostrożności.

an-vitro-batch-culture-model-to-estimate-effects-interventional

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Ahmadi, S. i in. Model hodowli partii in vitro do szacowania efektów reżimów interwencyjnych na ludzką mikrobiotę kałową. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę modelowania fermentacji mikroorganizmów jelitowych poprzez inkubację próbek kału z fermentowalnym błonnikiem w warunkach beztlenowych w celu badania produkcji metabolitów przez mikrobiotę jelitową.

In vitro Model hodowli partiowej naśladujący fermentację kolonową przez ludzką mikrobiotę jelita

Źródło: Calatayud Arroyo, M., i inni. Ocena opłacalności syntetycznego konsorcjum bakteryjnego na interfejsie in vitro jelito-mikroorganizm. J. Vis. Exp. (2018).Ten film prezentuje model in vitro żywioł–mikrob do badania żywotności bakterii. Współhodowla komórek Caco-2 i HT29-MTX jest inkubowana z bakteriami wstępnie poddanymi zabiegom w symulowanych warunkach trawiennych. Integralność bariery nabłonkowej ocenia się za pomocą oporu elektrycznego nabłonka, a frakcje z ośrodka, rozpuszczonego...

Model jelit in vitro do oceny zrastów i internalizacji bakteryjnej

W tym filmie opisujemy metodologię tworzenia systemu hodowli narządów jelitowych ex vivo w celu zbadania interakcji między fragmentami tkanki jelitowej myszy a specyficznymi bakteriami jelitowymi. Urządzenie składa się z dwóch par portów wejścia-wyjścia, z których pierwszy łączy światło tkanki jelitowej i dostarcza do niej specyficzną zawiesinę bakteryjną, a drugi w sposób ciągły dostarcza pożywkę do studzienek urządzenia w celu utrzymania żywotności tkanek ex vivo.

System hodowli narządów jelitowych ex vivo do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Opisany tutaj jest protokół do badania interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową za pomocą systemów fermentacji in vitro.

Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Poznaj metodę fermentacji in vitro kału ludzkiego do oceny wpływu prebiotyków na mikrobiom jelitowy. Protokół umożliwia badanie składu mikrobioty i aktywności metabolicznej w warunkach beztlenowych.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

Przeglądaj więcej filmów