Name: Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Naucz się ekstrakcji metabolitów wodnych z komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas. Ta metoda jest prosta i niezawodna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom Regionalnego Centrum Promocji Przemysłu Shonai za ich pomoc. Praca ta była częściowo wspierana przez fundusze badawcze z prefektury Yamagata i miasta Tsuruoka, przez Fundusz Badawczo-Rozwojowy Narodowego Centrum Raka [numer grantu 28-A-9] oraz przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI [numer grantu 17K07189] dla HM.

1. Hodowla komórkowa w dniu 1
UWAGA: Każda próbka do ekstrakcji metabolitów powinna być przygotowana z pojedynczego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm, które jest umiarkowanie, ale nie w pełni zlewające się (zawiera około 2-5 milionów komórek). Oblicz liczbę naczyń potrzebnych do testu i odpowiednio je przygotuj.
<ol>
	<li>Hodowla komórek HCC827 i PC-9 w 5% CO2 w temperaturze 37 °C w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Umyj komórki na każdym naczyniu za pomocą 2 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) bez wapnia i magnezu. Delikatnie kołysz każdym naczyniem tak, aby roztwór PBS całkowicie pokrył powierzchnię naczynia.</li>
	<li>Odessać bufor do płukania z naczyń hodowlanych.</li>
	<li>Podgrzać 0,25% roztwór trypsyny-EDTA do temperatury 37 °C i dodać 2 ml roztworu trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Delikatnie kołysz każdym naczyniem tak, aby trypsyna całkowicie pokryła powierzchnię naczynia.</li>
	<li>Inkubować szalki hodowlane w temperaturze 37 °C przez około 5 minut.</li>
	<li>Dodaj 4 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej na danie. Zawiesić komórki w pożywce, delikatnie pipetując kilka razy.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę każdej komórki do oddzielnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić każdą komórkę w 2 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Określ całkowitą liczbę i procentową żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
	<ol>
		<li>Wymieszać 10 μl zawiesiny komórkowej i 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego.</li>
		<li>Załadować 10 μl próbki do komory zliczania komórek, prześlizgnąć się przez działanie kapilarne.</li>
		<li>Włóż suwak studzienki do automatycznego licznika komórek. Przepuszczane światło zapala się automatycznie, a przyrząd automatycznie ustawia ostrość na komórce.</li>
		<li>Naciśnij przycisk przechwytywania, aby przechwycić obraz i wyświetlić wyniki.</li>
		<li>W razie potrzeby dodaj kolejną pożywkę wzrostową, aby uzyskać pożądane stężenie komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewaj około 1–2,5 miliona komórek na 100 mm naczynie do hodowli komórek. 
	UWAGA: Stężenia metabolitów określone za pomocą analizy CE-MS zostaną znormalizowane na podstawie liczby żywotnych komórek. Do celów liczenia komórek konieczne jest przygotowanie co najmniej jednego dodatkowego naczynia do hodowli nasion dla każdej grupy.</li>
	<li>Inkubować szalki hodowlane w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Rozcieńczyć handlowy roztwór wzorca wewnętrznego, w tym sulfon L-metioniny i kwas d-kamforo-10-sulfonowy, 1000-krotnie w wodzie ultraczystej. 
	UWAGA: W przypadku mniej niż 80 próbek wystarczy zmieszać 50 μl roztworu wzorca wewnętrznego 1 i 45 ml wody ultraczystej w kolbie miarowej o pojemności 50 ml, a następnie doprowadzić roztwór do 50 ml wodą ultraczystą.</li>
	<li>Przygotować 0,05 g/ml roztworu mannitolu w ultraczystej wodzie jako bufor do płukania. 
	UWAGA: W przypadku mniej niż 30 próbek wystarczy rozpuścić 25 g mannitolu w 500 ml ultraczystej wody. Potrzeba około 15 ml buforu do płukania na 100 mm naczynie hodowlane, dlatego należy przygotować wystarczającą objętość buforu do płukania w zależności od liczby próbek.</li>
</ol>
3. Filtry odśrodkowe do mycia wstępnego
<ol>
	<li>Odpipetować 250 μl ultraczystej wody do miseczki filtracyjnej każdej odśrodkowej jednostki filtrującej (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Wymagane są dwie jednostki filtrujące na próbkę.</li>
	<li>Zespoły filtracyjne szczelnie zamknąć i odwirować w temperaturze 9 100 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Sprawdź objętość każdego filtratu — jeśli podczas pierwszego krótkiego wirowania nagromadziła się znaczna ilość filtratu, jednostka filtrująca może być uszkodzona. W takim przypadku wyrzuć jednostkę filtrującą i zamiast niej użyj nowej jednostki filtrującej.</li>
	<li>Szczelnie zamknąć pokrywy jednostek filtrujących i ponownie odwirować w temperaturze 9 100 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Upewnij się, że w żadnym z kubków filtrujących nie pozostała woda ultraczysta; usuń przefiltrowaną wodę ultraczystą z każdej probówki za pomocą pipety i wyrzuć. 
	UWAGA: Nie próbuj usuwać resztek wody z kubka filtra za pomocą pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie filtra.</li>
	<li>Włóż kubki filtra do probówek zbiorczych. 
	UWAGA: Filtry odśrodkowe należy zużyć w ciągu godziny, ponieważ filtry mogą ulec uszkodzeniu po wysuszeniu.</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa w dniu 2
<ol>
	<li>Wyjmij z inkubatora szalki hodowlane o średnicy 100 mm. 
	UWAGA: Zalecany czas trwania hodowli komórkowej to 18 godzin.</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej płytki hodowlanej o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Do każdej potrawy dodać 10 ml pożywki do hodowli komórkowych, która zawiera odpowiednie stężenia związków lub leków, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórkowej. 
	UWAGA: W celach demonstracyjnych dodaliśmy w tym eksperymencie 10 μl 250 mM diamidu rozpuszczonego w PBS (końcowe stężenie 250 μM).</li>
	<li>Inkubować szalki hodowlane w temperaturze 37 °C przez 30 minut w obecności diamidu lub PBS jako kontroli.</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej płytki hodowlanej o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Umyj komórki, delikatnie dodając 2 ml 5% roztworu mannitolu do krawędzi każdego naczynia, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek, a następnie lekko przechyl naczynie. 
	UWAGA: PBS lub roztwór soli zakłóca analizę metabolomiczną opartą na CE-MS i niekorzystnie wpływa na wyniki pomiarów, dlatego nie powinien być stosowany jako bufor do płukania.</li>
	<li>Odessać bufor do płukania z każdej płytki hodowlanej, a następnie ponownie umyć komórki, delikatnie dodając 10 ml buforu do płukania na naczynie i lekko przechylając naczynie.</li>
	<li>Całkowicie zassać bufor do płukania od krawędzi każdej płytki hodowlanej. 
	UWAGA: Zassać jak najwięcej buforu do płukania, zwracając uwagę, aby nie zasysać komórek. Pozostałości mannitolu mogą zakłócać analizę CE-MS; Aspiracja komórek zmniejszy liczbę komórek, a tym samym stanie się źródłem błędów w normalizacji danych.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja metabolitów z hodowanych komórek
<ol>
	<li>Dodaj 800 μl 99,7% metanolu na szalkę hodowlaną. Delikatnie kołysz każdą miskę kulturową w przód iw tył, aby pokryć całą jej powierzchnię. Pozostaw naczynia w temperaturze pokojowej na 30 sekund.</li>
	<li>Powoli dodawać 550 μl rozcieńczonego roztworu wzorca wewnętrznego na każde naczynie, zanurzając końcówkę pipety w metanolu i delikatnie pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.</li>
	<li>Delikatnie kołysz każdą miskę kulturową w przód iw tył, aby pokryć całą jej powierzchnię.</li>
	<li>Pozostaw naczynia w temperaturze pokojowej na 30 sekund.</li>
</ol>
6. Ultrafiltracja ekstraktów komórkowych
<ol>
	<li>Przenieść wyekstrahowany roztwór z każdej płytki hodowlanej do oddzielnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki w temperaturze 2 300 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść 350 μl każdego supernatantu do dwóch filtrów odśrodkowych na próbkę. 
	UWAGA: Z każdej szalki hodowlanej przenosi się łącznie 700 μl wyekstrahowanego roztworu do dwóch probówek filtracyjnych (350 μl/probówkę).</li>
	<li>Odwirować probówki filtracyjne o stężeniu 9 100 × g w temperaturze 4 °C przez około 2 godziny, aż w kubkach filtracyjnych nie pozostanie żadna ciecz.</li>
	<li>Wyjmij kubki filtrujące i szczelnie zamknij pokrywki probówek zbiorczych.</li>
</ol>
7. Parowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotuj parownik odśrodkowy — zazwyczaj składa się on z parownika, wymrażarki i pompy próżniowej.</li>
	<li>Umieść probówki zbiorcze w parowniku odśrodkowym. 
	UWAGA: Pozostaw pokrywki tubek otwarte.</li>
	<li>Odparować wyekstrahowane roztwory próbek w warunkach próżni w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Typowe konfiguracje liczby obrotów i ciśnienia to odpowiednio 1 500 obr./min i 1 000 Pa, a całkowite odparowanie próbek zajmuje zwykle około 3 godzin.</li>
	<li>Upewnij się, że w żadnej z probówek zbiorczych nie pozostał żaden płyn i szczelnie zamknij pokrywki probówek.</li>
	<li>Probówki należy przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze (-80 °C) do czasu analizy metabolomicznej.</li>
</ol>
8. Analiza metabolomiczna CE-MS
<ol>
	<li>Zawiesić filtrat w 50 μl ultraczystej wody bezpośrednio przed analizą CE-MS.</li>
	<li>Wykonaj analizę CE-MS metodami opisanymi wcześniej12,13 przy użyciu systemu elektroforezy kapilarnej i systemu spektrometru mas czasu przelotu wyposażonego w pompę izokratyczną, adapter CE-MS i opryskiwacz CE-ESI-MS. 
	UWAGA: Oba systemy mogą być sterowane za pomocą oprogramowania dostawców systemów i są połączone kapilarą ze stopionej krzemionki (średnica wewnętrzna 50 μm × długość całkowita 80 cm).
	<ol>
		<li>Ustawić przyrządy i fiolki z próbkami, przygotować kapilarnę z kasetą kapilarną, uzupełnić płyny osłonowe i odpowiednie do elektroforezy w zależności od trybu analizy anionów lub kationów, a następnie zastosować napięcia. 
		UWAGA: Oprzyrządowanie i warunki analityczne są szczegółowo opisane w innym miejscu12,13.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie i przygotuj listę roboczą zawierającą metody pozyskiwania danych oraz przykładowe informacje.</li>
		<li>Rozpocznij uruchomienie testowe i sprawdź dane, takie jak intensywność sygnału i kształt piku wzorców wewnętrznych oraz rozdzielczość szczytowa innych związków wzorcowych.</li>
		<li>W razie potrzeby należy dostosować warunki analityczne.</li>
		<li>Roztwory próbek wstrzykiwać pod ciśnieniem 50 mbar przez 3 s i napięciem 30 kV. 
		UWAGA: CE-MS przeprowadzono w trybie jonów dodatnich lub ujemnych. Ustaw spektrometr tak, aby skanował zakres mas m/z 50–1000. Napięcie kapilarne ustalono na 4 kV; natężenie przepływu azotu gazowego (temperatura grzałki 300°C). Dla trybu dodatniego napięcie fragmentora, skimmera i OCT RFV ustawiono odpowiednio na 75, 50 i 125 V. W trybie jonów ujemnych napięcie fragmentora, skimmera i OCT RFV ustawiono odpowiednio na 100, 50 i 200 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane dotyczące widma.
	<ol>
		<li>Wyodrębnij piki z danych widma mas za pomocą oprogramowania do automatycznej integracji w celu uzyskania informacji o pikach, w tym m/z, powierzchni piku i czasu migracji (MT). 
		UWAGA: Metoda jest szczegółowo opisana w innym miejscu14.</li>
		<li>Wykluczyć piki sygnału odpowiadające izotopomerom, jonom adduktorowym i innym jonom potomnym znanych metabolitów.</li>
		<li>Opisz pozostałe piki informacjami z bazy danych metabolitów HMT zgodnie z wartościami m/z i MTs.</li>
		<li>Znormalizuj obszary oznaczonych pików do wewnętrznych poziomów wzorca i liczby komórek w próbce.</li>
		<li>Ocenić stężenie każdego metabolitu w hodowanych komórkach (pmol/106 komórek) przy użyciu krzywych wzorcowych przygotowanych dla każdego metabolitu.</li>
		<li>Ilościowo określone stężenia metabolitów można wykorzystać do późniejszych analiz statystycznych i interpretacji biologicznych14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism%3A+key+players+in+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming.</a> Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Fukuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+for+cancer+diagnosis+with+positron-labeled+fluorinated+glucose+analogs%3A+%5B18F%5D-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose%3A+a+new+tracer+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Meddicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection.</a> European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).</li>
<li>Miles, K. A., Williams, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+revisited%3A+imaging+tumour+blood+flow+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Imaging%22%5BJournal%5D)">Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism.</a> Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+the+metabolic+switch+in+cancers+by+oncogenes+and+tumor+suppressor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes.</a> Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+regulates+global+metabolic+pathways+in+EGFR-mutated+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+the+Phosphatidylinositol+3-Kinase+%28PI3K%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+%28mTOR%29+Axis+Is+Responsible+for+Aerobic+Glycolysis+mediated+by+Glucose+Transporter+in+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29-mutated+Lung+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Determinants+of+Sensitivity+to+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathway+Inhibitor+in+Small-Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma.</a> Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Characterization+of+Antifolate+Responsiveness+and+Non-responsiveness+in+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1129(2018).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
<li>Patra, K. C., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pentose+phosphate+pathway+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pentose phosphate pathway and cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy szeroko dostępną metodologię przygotowania metabolitów z hodowanych komórek nowotworowych do analizy metabolomicznej opartej na CE-MS. Jednym z najbardziej krytycznych punktów w tym protokole jest właściwe przygotowanie komórek rakowych, ponieważ zmierzone stężenia metabolitów są znormalizowane do liczby żywotnych komórek. W celu dokładnego oszacowania liczby komórek konieczne jest przygotowanie co najmniej jednej dodatkowej płytki hodowlanej na grupę doświadczalną w celu policzenia liczby żywotnych komórek równolegle z ekstrakcją metabolitów do analizy metabolomicznej. Ponadto w każdej szalce należy umieścić taką samą liczbę komórek w przypadku powtórzeń i w szalce w celu zliczenia; W przyszłości będzie to wspomagane przez szybki i wolny od stresorów (np. bez trypsyny) protokół liczenia komórek, który pozwala na użycie tego samego naczynia zarówno do liczenia żywych komórek, jak i ekstrakcji metabolitów. Podczas mycia należy zachować ostrożność, aby komórki nie odrywały się od powierzchni naczyń. Surowe testy cytotoksyczności i inne eksperymenty, które zmniejszają adhezję komórek, mogą być nieodpowiednie dla tego protokołu ekstrakcji ze względu na potencjalną utratę komórek podczas procedury mycia.
Ważne jest, aby używać 5% roztworu mannitolu jako buforu płuczącego do ekstrakcji metabolitów z hodowanych komórek do analizy metabolomicznej opartej na CE-MS, ponieważ na bazie soli, takie jak PBS, zakłócają analizę metabolomiczną i niekorzystnie wpływają na pomiar.
Dwie lub trzy szalki można połączyć jako pojedynczą próbkę poprzez indywidualne ekstrahowanie metabolitów z każdej płytki, a następnie łączenie próbek; Jednak łączenie wielu szalek często zwiększa pozostałości mannitolu w wyekstrahowanym roztworze metabolitu. Może to również zakłócać analizę metabolomiczną przeprowadzaną przez CE-MS. Dlatego zaleca się, aby nie używać wielu naczyń lub studzienek jako jednej próbki.
Ta metoda analizy metabolomicznej z wykorzystaniem CE-MS została opracowana do kompleksowego pomiaru naładowanych cząsteczek o masie cząsteczkowej od 50 do 1000 Da; W związku z tym protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem ekstrakcji wodnych związków o niskiej masie cząsteczkowej. Dlatego protokół ten nie nadaje się do ekstrakcji metabolitów hydrofobowych, takich jak lipidy lub makrocząsteczki, takie jak białka i kwasy nukleinowe. Ponieważ istnieje rosnące zapotrzebowanie na kompleksowe analizy lipidowe lub lipidomikę próbek hodowanych komórek, konieczne jest opracowanie łatwego i skutecznego protokołu jednoczesnej ekstrakcji metabolitów zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych.
Pierwszy etap ekstrakcji metabolitów – aspiracja pożywki i mycie komórek mannitolem – powinien być przeprowadzony tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować zmiany w profilu metabolicznym komórek. Zakłada się, że traktowanie komórek metanolem po umyciu mannitolem denaturuje białka, a tym samym zapobiega katalizowaniu dalszych reakcji metabolicznych przez enzymy. Jednak nawet po traktowaniu metanolem mogą zachodzić nieenzymatyczne reakcje chemiczne, takie jak reakcje redoks, niektóre procesy dekarboksylacji i wiązania tiolowe. W związku z tym wszelkie stężenia metabolitów biorących udział w tych reakcjach, mierzone za pomocą niniejszego protokołu, powinny być interpretowane z ostrożnością. W przeciwieństwie do genomu lub transkryptomu, metabolom składa się z cząsteczek o szerokiej gamie właściwości chemicznych; W związku z tym żaden pojedynczy protokół nie jest w stanie wyekstrahować wszystkich metabolitów bez żadnych strat lub zakłóceń. W celu uzyskania dokładniejszych pomiarów takich wysoce reaktywnych metabolitów należy zapoznać się z protokołem specjalnie zaprojektowanym do ekstrakcji niektórych grup metabolitów, który wymaga frakcjonowania i derywatyzacji. Przedstawiony tutaj protokół opisuje jednak prostą i szybką ekstrakcję wodnych metabolitów z próbek hodowanych komórek do analizy metabolomicznej za pomocą CE-MS. W tym artykule nie mogliśmy szczegółowo opisać, jak skonfigurować CE-MS, ponieważ przedmiot niniejszego manuskryptu jest inny, jednak opisanie szczegółowych kroków do konfiguracji CE-MS może wymagać osobnego dedykowanego artykułu.

Otto Warburg zaobserwował, że komórki nowotworowe nabywają niezwykłą zdolność do pobierania glukozy i fermentowania jej w celu wytworzenia mleczanu w obecności odpowiedniej ilości tlenu - zjawisko określane jako efekt Warburga lub glikoliza tlenowa1,2. Spekuluje się, że wady oddychania mitochondrialnego są podstawową podstawą glikolizy tlenowej w komórkach nowotworowych3. Rzeczywiście, efekt Warburga jest podstawą obrazowania guza za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej fluorodeoksyglukozy (FDG) (PET), która jest szeroko stosowana w praktyce klinicznej4,5. Wysoki wskaźnik glikolizy tlenowej jest uważany za kluczową cechę raka i został ostatnio przyjęty jako jedna z dobrze znanych "cech charakterystycznych raka", jak opisali D. Hanahan i B. Weinberg6. Mutacje somatyczne w onkogenach i genach supresorowych nowotworów - takich jak HRAS / KRAS / NRAS, EGFR, BRAF, MYC, TP53, dehydrogenaza izocytrynianowa (IDH) i hydrataza fumaranu (FH) - zostały powiązane ze specyficznymi zmianami metabolicznymi w komórkach rakowych, uważanymi za wynik efektu Warburga7.
Analiza metabolomiczna jest obiecującym podejściem nie tylko do zrozumienia regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych, ale także do identyfikacji biomarkerów raka we wczesnym stadium i przewidywania odpowiedzi na chemioterapię. Po leczeniu wrażliwych lub opornych komórek nowotworowych związkami przeciwnowotworowymi, śledzenie ich odpowiedzi metabolicznych ułatwia identyfikację biomarkerów metabolicznych w celu przewidywania skuteczności określonych terapii przeciwnowotworowych u pacjentów z rakiem8,9,10,11. W tym artykule jako modele do analizy metabolomicznej wykorzystano linie komórek nowotworowych pochodzące z gruczolakoraka płuc z mutacją EGFR leczonego diamidem, który powoduje stres oksydacyjny. Zaletą tej metody analitycznej wykorzystującej elektroforezę kapilarną ze spektrometrią mas (CE-MS) jest kompleksowy pomiar naładowanych metabolitów o zakresie mas m/z 50-100012,13. Celem tego artykułu jest dostarczenie nowicjuszom szczegółowego, krokowego protokołu wizualnego przygotowania wodnych metabolitów z hodowanych komórek nowotworowych i późniejszej analizy metabolomicznej, w szczególności za pomocą CE-MS.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do automatycznej integracji</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>wersja B.02.00</td></tr><tr><td>System CE</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 7100 CE system</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw adapterów CE/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Zestaw opryskiwacza</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A Szkiełko</td><td></td></tr><tr><td>komory zliczania komórek</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Szkiełka komory zliczania komórek Countess</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy, 5 kDa</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa sterylna probówka polipropylenowa, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa sterylna probówka polipropylenowa, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3301-1001</td><td>do analizy kationów</td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3302-1021</td><td>do analizy anionów</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra, 1000 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S Końcówka</td><td></td></tr><tr><td>filtra, 20 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S Końcówka</td><td></td></tr><tr><td>filtra, 200 &mu; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara z topionej krzemionki</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu; m i.d. & czasy; Długość całkowita: 80 cm</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzny roztwór wzorcowy</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>Pompa izokratyczna</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 1100 Series Pompa</td><td></td>izokratyczna</tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 l, mikroprobówka klasy LC/MS</td></tr><tr><td>, 1,5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie operacyjne</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation</td><td>G2201AA wersja B.03.01 dla CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne naczynie do hodowli tkankowych, 100 mm</td> Spektrometr masowy <td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Time-of-flight</td><td>Agilent Technologie</td><td>Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski roztwór, 0,4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Merck</td><td>Milli-Q woda</td><td>18,2 M&Omega; &#183; cm czysta woda</td></tr><tr><td>Kolba miarowa, 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Analiza metabolomiczna to obiecujące podejście omiczne, które nie tylko pozwala zrozumieć specyficzną regulację metaboliczną w komórkach nowotworowych w porównaniu do normalnych komórek, ale także zidentyfikować biomarkery do wczesnego stadium wykrywania raka i przewidywania odpowiedzi na chemioterapię u pacjentów z rakiem. Przygotowanie jednolitych próbek do analizy metabolomicznej jest krytyczną kwestią, która pozostaje do rozwiązania. W tym miejscu przedstawiamy łatwy i niezawodny protokół ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej przy użyciu elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas (CE-MS). Metabolity wodne z hodowanych komórek są analizowane przez hodowlę i mycie komórek, traktowanie komórek metanolem, ekstrakcję metabolitów oraz usuwanie białek i makrocząsteczek za pomocą kolumn wirowych do analizy CE-MS. Reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu linii komórkowych raka płuc traktowanych diamidem, odczynnikiem utleniającym, ilustrują wyraźnie obserwowane przesunięcie metaboliczne komórek pod wpływem stresu oksydacyjnego. Artykuł ten byłby szczególnie cenny dla studentów i badaczy zajmujących się badaniami metabolomicznymi, którzy są nowicjuszami w zbieraniu metabolitów z linii komórkowych do analizy za pomocą CE-MS.

Ponieważ stężenia metabolitów w komórkach nowotworowych (pmol/106 komórek) są normalizowane do liczby żywych komórek, warunki eksperymentalne powinny zostać dobrane z najwyższą starannością, aby zminimalizować różnice w liczbie żywych komórek pomiędzy poszczególnymi grupami. Na przykład traktowanie diamidem przeprowadzono przy stosunkowo wysokim stężeniu (250 μm), lecz przez krótki czas, aby umożliwić wszystkim komórkom równiejszy wzrost, wyrównując tym samym liczbę analizowanych żywych komórek. W tych warunkach eksperymentalnych komórki HCC827 i PC-9 rosły w równym stopniu przez 3 h (Rysunek 1). Analiza CE-MS komórek traktowanych diamidem w porównaniu z komórkami traktowanymi PBS (kontrola) wykazała odpowiednio 175 i 150 metabolitów różniących się stężeniem w komórkach HCC827 i PC-9. Wśród nich kilka produktów pośrednich szlaku pentozofosforanowego (PPP) oraz górnego etapu glikolizy było znacznie wyższych w warunkach traktowania diamidem w obu liniach komórkowych, podczas gdy kilka produktów pośrednich cyklu kwasu trkarboksylowego (TCA) było niższych w warunkach traktowania (Rysunek 2 oraz Rysunek 3).
Szlak pentozofosforanowy (PPP) generuje ekwiwalenty redukcyjne w postaci zredukowanego nikotynamido-adenyno-dinukleotydu fosforanu (NADPH), który jest wykorzystywany do utrzymania homeostazy redoks oraz biosyntezy kwasów tłuszczowych15. Po zastosowaniu diamidu poziom kwasu glukonowego – utlenionej formy glukozy – wzrósł 12-krotnie w komórkach HCC827 i 10-krotnie w komórkach PC-9; podobnie po traktowaniu diamidem poziom glukozo-6-fosforanu (G6P) – fosforylowanej glukozy i pierwszego produktu glikolizy katalizowanego przez heksokinazę – wzrósł odpowiednio 6,3- i 3,5-krotnie w komórkach HCC827 i PC-9 (Rycina 4). Ponadto po zastosowaniu diamidu poziomy 6-fosfoglukonianu (6PG) – pierwszego produktu pośredniego w PPP – gwałtownie wzrosły 89-krotnie w komórkach HCC827 i 231-krotnie w komórkach PC-9 w porównaniu do poziomów obserwowanych w kontroli PBS (Rycina 4). W przeciwieństwie do tego, poziomy innych produktów pośrednich glikolizy, takich jak fruktozo-6-fosforan (F6P) i fruktozo-1,6-bisfosforan (F1,6P), nie uległy zmianie w warunkach eksperymentalnych z diamidem (Rycina 4). Całkowite poziomy nikotynamido-adenyno-dinukleotydu fosforanu (NADP+) były niemal równoważne między warunkami traktowania diamidem a kontrolą PBS (Rycina 4), co sugeruje, że glukoza była katabolizowana głównie poprzez PPP.
<img alt="Wykres słupkowy liczby komórek w liniach HCC827 i PC-9 po zastosowaniu PBS oraz diamidu w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Brak zmian w liczbie komórek po zastosowaniu diamidu. Reakcje wzrostu komórek na 250 μm diamidu zmierzono za pomocą barwienia błękitem trypanu. Przedstawiono liczbę komórek (A) HCC827 oraz (B) PC-9 traktowanych PBS (niebieski) lub diamidem (czerwony; 250 μm) przez 1 lub 3 h. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii, wykresy natężenia w funkcji czasu, identyfikacja kwasu glukonowego, G6P, 6PG, NADP+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne piki MS metabolitów. Elektroferogramy opisane jako (A) kwas glukonowy, (B) glukozo-6-fosforan (G6P), (C) 6-fosfoglukonian (6PG) oraz (D) nikotynamidoadeninodynukleotydofosforan (NADP+) uzyskane w analizie CE-MS. Każda linia wskazuje zastosowaną linię komórkową (ciągła: HCC827; przerywana: PC-9) oraz rodzaj traktowania (niebieska: PBS; czerwona: diamid). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza szlaków metabolicznych; wykres porównawczy; dane log(diamide/PBS) dla HCC827 vs PC-9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Profile metabolomiczne metabolitów wewnątrzkomórkowych. Zmiany krotności metabolitej w komórkach (A) HCC827 i (B) PC-9 traktowanych diamidem przedstawiono jako log2(diamide/PBS). Łącznie zidentyfikowano 175 i 150 metabolitów odpowiednio w komórkach HCC827 i PC-9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat metabolizmu glukozy; wykresy słupkowe przedstawiają poziomy metabolitów w komórkach HCC827 i PC-9 z PBS oraz diamidem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Up-regulacja PPP po traktowaniu diamidem. Przedstawiono wewnątrzkomórkowe stężenia (pmol/106 komórek) kluczowych metabolitów uczestniczących w glikolizie oraz szlaku pentoz fosforanowych (PPP) po traktowaniu diamidem. Metabolity wyekstrahowano z komórek HCC827 i PC-9 traktowanych PBS (kolor niebieski) lub diamidem (kolor czerwony, 250 μm) przez 30 min. Przedstawiono reprezentatywne metabolity, takie jak kwas glukonowy, glukozo-6-fosforan (G6P), fruktozo-6-fosforan (F6P), 6-fosfoglukonian (6PG) oraz nikotynamido-adenyno-dinukleotyd fosforanowy (NADP+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Celem tego artykułu jest opisanie protokołu ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek przylegających do analizy metabolomicznej, w szczególności elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas.

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowego, krokowego protokołu wizualnego ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek nowotworowych w celu późniejszej analizy metabolomu. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i niezawodność w ekstrakcji metabolitów z przylegających komórek. Ale przede wszystkim jest dobrze zoptymalizowany pod kątem analizy metabolomu przy użyciu elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas lub CEMS.Metabolomika jest potężną techniką identyfikacji biomarkerów lub wykrywania wczesnego stadium raka i przewidywania odpowiedzi na chemioterapię u pacjentów z rakiem. W tej demonstracji używamy komórek rakowych. Jednak technika ta może być również stosowana do zbierania metabolitów z innych przylegających komórek, takich jak fibroblasty w komórkach iPS.Stężenia metabolitów są normalizowane na podstawie liczby żywotnych komórek. Tak więc staranne przygotowanie kultury jest kluczem do uzyskania dobrych, powtarzalnych danych. Procedurę zademonstruje Ami Maruyama, technik z mojego laboratorium.Na początek umieść komórki HCC827 i PC-9 w 100-milimetrowych szalkach zawierających 10 mililitrów pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. Umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza na 24 godziny do hodowli. Po inkubacji delikatnie przechyl 100-milimetrowe szalki hodowlane, aby zassać pożywkę do hodowli komórkowych.Umyj komórki na każdym naczyniu za pomocą dwóch mililitrów buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej bez wapnia i magnezu. Delikatnie kołysz każdym naczyniem tak, aby roztwór PBS całkowicie pokrył powierzchnię naczynia, a następnie przechyl naczynia, aby zassać bufor do mycia. Podgrzej 0,25% roztwór trypsyny-EDTA do 37 stopni Celsjusza.Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej dodaj dwa mililitry podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA do każdego naczynia. Delikatnie kołysz każdym naczyniem tak, aby trypsyna całkowicie pokryła powierzchnię naczynia. Inkubuj szalki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć minut.Następnie dodaj cztery mililitry wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej do każdego naczynia. I delikatnie pipetuj kilka razy, aby ponownie zawiesić komórki w podłożu. Przenieś zawiesinę każdej komórki do oddzielnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Wirować 800 razy g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę komórkową w dwóch mililitrach wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki wzrostowej. Wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami 0,4% roztworu błękitu trypanowego w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra.Załaduj 10 mikrolitrów mieszaniny do komory zliczania komórek, przesuń się przez działanie kapilarne. Włóż szkiełko komory do automatycznego licznika komórek i naciśnij przycisk przechwytywania, aby przechwycić obraz i wyświetlić wyniki całkowitej liczby i procentowej żywotności komórek. Jeśli całkowita liczba komórek przekracza 0,5 miliona komórek na mililitr, dodaj dalszą pożywkę wzrostową do 15-mililitrowej stożkowej probówki, aby uzyskać pożądane stężenie komórek.Teraz dodaj od dwóch do pięciu mililitrów kultury do każdej 100-milimetrowej płytki do hodowli komórek, aby wysiać około jednego do 2 1/2 miliona komórek na szalkę. Inkubuj szalki hodowlane w 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Najpierw w 15-mililitrowej kolbie miarowej rozcieńczyć handlowy roztwór wzorca wewnętrznego zawierający sulfosulfon L-metioniny i kwas D-kamforo-10-sulfonowy 1000-krotnie w ultraczystej wodzie.Rozpuść mannitol w ultraczystej wodzie, aby przygotować 0,05 grama na mililitr roztworu mannitolu w ultraczystej wodzie jako bufor do mycia. Następnie do kubka filtracyjnego każdej odśrodkowej jednostki filtrującej odpipetuj 250 mikrolitrów ultraczystej wody. Szczelnie zamknij jednostki filtrujące i odwiruj przy 9, 100 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Sprawdzić objętość każdego filtratu. Jeśli podczas pierwszego krótkiego wirowania nagromadziła się znaczna ilość filtratu, jednostka filtrująca może być uszkodzona. Wyrzuć jednostkę filtrującą i zamiast niej użyj nowej jednostki filtrującej.Zamknij szczelnie pokrywy jednostek filtrujących i ponownie odwiruj w temperaturze 9,100 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Upewnij się, że w żadnym z kubków filtra nie pozostała woda ultraczysta i usuń przefiltrowaną wodę ultraczystą z każdej probówki za pomocą pipety. Umieść kubki filtracyjne z powrotem w probówkach zbiorczych i użyj odśrodkowych jednostek filtrujących w ciągu godziny, aby uniknąć uszkodzenia podczas suszenia.Wyjmij 100-milimetrowe szalki hodowlane z inkubatora i odessaj pożywkę do hodowli komórkowych z każdej płytki. Do każdej potrawy dodać 10 mililitrów pożywki hodowlanej PBS z lub bez 250 mikromolowego diamidu, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórkowej. Inkubuj naczynia hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Po inkubacji odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej 100-milimetrowej płytki hodowlanej. Lekko przechyl naczynie i delikatnie dodaj dwa mililitry 5% mannitolu do płukania bufora do mycia na krawędzi każdego naczynia, aby umyć komórki, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek. Odessać bufor do płukania z każdej płytki hodowlanej i ponownie umyć komórki, lekko przechylając naczynie i delikatnie dodając 10 mililitrów buforu do płukania na naczynie.Następnie całkowicie zassaj bufor do płukania od krawędzi każdej płytki hodowlanej. Teraz dodaj 800 mikrolitrów 99,7% metanolu na szalkę hodowlaną i delikatnie kołysz każdą szalką hodowlaną w przód iw tył, aby pokryć całą jej powierzchnię. Pozostaw naczynia w temperaturze pokojowej na 30 sekund.Powoli dodawać 550 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu wzorca wewnętrznego na każde naczynie, zanurzając końcówkę pipety w metanolu i delikatnie pipetując w górę i w dół, kilka razy. Delikatnie kołysz każdą miskę kulturową w przód iw tył, aby pokryć całą jej powierzchnię, i pozostaw naczynia w temperaturze pokojowej na 30 sekund. Następnie przenieś wyekstrahowany roztwór z każdej płytki hodowlanej do oddzielnej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Odwirować probówki w temperaturze 2 300 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Przenieś 700 mikrolitrów każdego supernatantu do dwóch odśrodkowych jednostek filtrujących, po 350 mikrolitrów na jednostkę. Odwirować probówki filtracyjne pod ciśnieniem 9, 100 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około dwie godziny, aż w kubkach filtracyjnych nie pozostanie płyn.Wyjmij kubki filtrujące i szczelnie zamknij pokrywki probówek zbiorczych. W tym badaniu komórki HCC827 i PC-9 rosły równomiernie przez trzy godziny. Analiza CEMS wskazuje na różnicę między komórkami traktowanymi diamidem a komórkami traktowanymi PBS dla obu linii komórkowych.Spośród nich kilka produktów pośrednich w szlaku pentozofosforanowym i w górnej glikolizie było znacznie wyższych w warunkach traktowanych diamidem, podczas gdy kilka produktów pośrednich cyklu trikarboksylowego było niższych w warunkach leczonych. Profile metabolomu metabolitów wewnątrzkomórkowych ujawniły 175 i 150 zróżnicowanych metabolitów odpowiednio w komórkach HCC827 i PC-9. Po leczeniu diamidem poziom kwasu glukonowego i utlenionej glukozy wzrósł 12-krotnie w komórkach HCC827 i 10-krotnie w komórkach PC-9.Podobnie, poziom glukozy 6-fosforanu, fosforylowanej glukozy w pierwszym produkcie glikolizy katalizowanym heksokinazą, również wzrósł 6,3 i 3,5-krotnie odpowiednio w komórkach HCC827 i PC-9. Ponadto poziomy 6-fosfoglukonianu, pierwszego produktu pośredniego w szlaku pentozofosforanowym, dramatycznie wzrosły 89-krotnie w komórkach HCC827 i 231-krotnie w komórkach PC-9. W przeciwieństwie do tego, poziomy innych glikolitycznych produktów pośrednich, takich jak 6-fosforan fruktozy, nie zmieniły się w warunkach eksperymentalnych diamidu.Całkowite poziomy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego były prawie równoważne między leczeniem diamidem a warunkami kontrolnymi PBS. Stosowanie 5% roztworu mannitolu, innego niż PBS, jako buforu płuczącego do mycia komórek jest bardzo ważne dla analizy CEMS, ponieważ na bazie soli zakłócają analizę i niekorzystnie wpływają na pomiar. Protokół ten nie nadaje się do ekstrakcji metabolitów hydrofobowych, takich jak lipidy, dlatego musimy opracować protokół wygodnej ekstrakcji zarówno metabolitów hydrofilowych, jak i hydrofobowych w celu bardziej kompleksowej analizy metabolomu.Technika ta umożliwia łatwą ekstrakcję metabolitów z prawie wszystkich przylegających komórek, a zatem ma zastosowanie w różnych badaniach, takich jak rak, komórki macierzyste, farmakologia, żywienie i kosmetyka.

extraction-aqueous-metabolites-from-cultured-adherent-cells-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Naucz się ekstrakcji metabolitów wodnych z komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas. Ta metoda jest prosta i niezawodna.

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów