Name: Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj wykorzystanie Galleria mellonella jako alternatywnego modelu infekcji do badania gruźlicy. Ta metoda pozwala na etyczne i ekonomiczne badanie interakcji patogen-gospodarz oraz skuteczności leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt był wspierany przez granty Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC), przyznane PRL i YL (BB/P001262/1), oraz Narodowemu Centrum Wymiany, Udoskonalenia i Redukcji Zwierząt w Badaniach (NC3Rs) przyznane PRL, SMN, BDR i YL (NC/R001596/1).

UWAGA: Wszystkie prace opisane poniżej mają być wykonywane w laboratorium CL2 w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy 2 (MSC) zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.
1. Przygotowanie M. bovis BCG lux do infekcji
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożony 1,2 ml glicerolu (15%) zapasu M. bovis BCG lux, szczepu szczepionki montrealskiej przekształconego za pomocą plazmidu wahadłowego pSMT1 przenoszącego geny luxAB z Vibrio harveyi kodujące enzym lucyferazy19.</li>
	<li>Zaszczepić 15 ml bulionu Middlebrook 7H9 zawierającego 0,2% glicerolu, 10% albuminy, dekstrozę, wzbogacenie katalazą (ADC) i 50 μg/ml higromycyny rozmrożoną 1,2 ml porcji BCG luks, w oznakowanej kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Umieścić kolbę w szczelnie zamkniętym pojemniku zapewniającym bezpieczeństwo biologiczne i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 220 obr./min przez 72 godziny (lub do momentu, gdy kultura osiągnie środkową fazę wzrostu).</li>
	<li>Sprawdź wzrost kultury BCG lux, przygotowując rozcieńczenia kultury w skali 1:10 w probówkach z luminometrem przy użyciu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4, 0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu) w dwóch egzemplarzach. Odwiruj i załaduj rurki luminometru do luminometru i zmierz bioluminescencję (względna jednostka światła [RLU]/ml) przy użyciu aldehydu n-decylowego jako substratu (1% v/v w absolutnym etanolu)<klasa sup = "xref">20, 
	nuta: Stosunek RLU do jednostek tworzących kolonię (CFU) został wcześniej określony na 3:1, gdy BCG lux był hodowany in vitro w Middlebrook 7H9 bulion20.</li>
	<li>Odwirować kulturę przy 2,175 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek i odrzucenia supernatantu do odpowiedniego środka dezynfekującego o znanej aktywności prątkobójczej. Wszystkie odpady z kultur należy zutylizować środkami dezynfekującymi odpowiednimi dla prątków zgodnie z lokalnymi wytycznymi.</li>
	<li>Umyj osad komórkowy dwukrotnie w PBS zawierającym 0,05% polisorbatu 80 (PBS-T), aby zapobiec zbrylaniu się bakterii.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu zdekantować supernatant odpadowy, ponownie zawiesić osad komórek mykobakteryjnych w PBS-T i rozcieńczyć zawiesinę prątków do pożądanej gęstości komórek za pomocą pomiarów RLU.</li>
	<li>Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia inokulum w 24-dołkowych płytkach przy użyciu PBS-T. Umieść 10 μl na płytkach agarowych Middlebrook 7H11 (0,5% glicerolu, 50 μg/ml higromycyny, 10% kwasu oleinowego, albuminy, dekstrozy, katalazy [OADC]) w dwóch egzemplarzach, aby wyliczyć liczbę CFU inokulum.</li>
</ol>
2. Przygotowanie larw G. mellonella
<ol>
	<li>Kupuj larwy w ostatnim stadium rozwoju z odpowiednich źródeł i utrzymuj larwy w ciemności w temperaturze 18 °C po przybyciu i zużyciu w ciągu 1 tygodnia od zakupu. Alternatywnie, larwy mogą być hodowane samodzielnie zgodnie z protokołem Jojāo et al.21. W przypadku zakupionych larw należy wyrzucić wszelkie martwe, odbarwione lub przepoczwarzające się larwy przed przechowywaniem. 
	nuta: Larwy przepoczwarzające się są morfologicznie rozróżnialne do ostatnich larw w stadium rozwojowym.</li>
	<li>Zidentyfikuj i wybierz zdrowe larwy do eksperymentów, na podstawie jednolitego kremowego koloru z niewielkimi lub żadnymi przebarwieniami (melanizacja), rozmiarem (2-3 cm długości), wagą (około 250 mg), wykazującymi wysoki poziom ruchliwości i posiadającymi zdolność do prostowania się po odwróceniu.</li>
	<li>Ostrożnie policz zdrowe larwy (minimum 20−30 na grupę) na szalkę Petriego (94/15 mm) wyłożoną warstwą bibuły filtracyjnej (94/15 mm) za pomocą pęsety z końcem, aby zminimalizować zanieczyszczenie i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Zakażenie G. mellonella BCG lux
<ol>
	<li>Zminimalizuj bałagan w MSC, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i zranienia igłą.</li>
	<li>Przygotować platformę iniekcyjną, przyklejając okrągłą bibułę filtracyjną (94 mm) do płaskiej, podniesionej powierzchni. Można używać miękkich lub twardych powierzchni, które są całkowicie zależne od preferencji użytkownika, np. pokrywki pudełek na pipety lub nylonowa gąbka do szorowania.</li>
	<li>Wysterylizuj mikrostrzykawkę o pojemności 25 μl (25 G), odsysając 3 objętości 70% etanolu, a następnie przepłukać 3 objętościami sterylnego PBS-T.</li>
	<li>Odessać 10 μl inokulum BCG lux (przygotowanego w sekcji 1) lub PBS-T do wysterylizowanej mikrostrzykawki o pojemności 25 μl. Użyć oddzielnej strzykawki do kontroli negatywnej PBS-T. 
	nuta: Ponownie zawiesić inokulum BCG lux po 10 wstrzyknięciach, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek.</li>
	<li>Za pomocą pęsety podnieś jedną larwę i umieść ją na platformie iniekcyjnej.</li>
	<li>Na platformie przewróć larwę na plecy i unieruchom, zabezpieczając głowę i ogon pęsetą. Zlokalizuj ostatnią lewą nogę odliczającą w dół od głowy larwy i ostrożnie włóż końcówkę igły (5−6 mm) pod kątem 10−20° do płaszczyzny poziomej. 
	nuta: Krótka i wąska pęseta pozwala na łatwe unieruchomienie przy minimalnym stresie larwalnym. Zwróć uwagę, aby nie przeniknąć nadmiernie, co może przebić jelito i spowodować melanizację lub śmierć niespecyficzną dla BCG luksów.</li>
	<li>Policz zainfekowane larwy na szalce Petriego wyłożonej warstwą bibuły filtracyjnej, pojedyncza szalka Petriego o średnicy 90 mm może pomieścić do 30 larw.</li>
	<li>Przechowywać szalkę Petriego zawierającą larwy w wentylowanym lub nieszczelnie zamkniętym ciemnym pudełku w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Monitorowanie przeżywalności G. mellonella po zakażeniu
<ol>
	<li>W miarę upływu czasu monitoruj przeżywalność larw co 24 godziny. Larwy są uważane za martwe, gdy nie poruszają się w odpowiedzi na dotyk.</li>
</ol>
5. Pomiar in vivo obciążenia luksami BCG u G. mellonella
<ol>
	<li>W każdym punkcie czasowym losowo wybieraj pięć zakażonych larw przygotowanych wcześniej w sekcji 3 i delikatnie sterylizuj powierzchnie larw za pomocą wacików nasączonych 70% etanolem. 
	nuta: Ten krok jest ważny podczas posiewania homogenatu larw w celu zliczenia prątków CFU, ponieważ niewysterylizowane larwy mogą prowadzić do zanieczyszczenia.</li>
	<li>Umieścić larwy pojedynczo w probówkach z matrycą lizy o pojemności 2 ml zawierających 800 μl sterylnego PBS.</li>
	<li>Homogenizować larwy za pomocą homogenizatora przez 60 s z prędkością 6,0 m/s.</li>
	<li>Odwirować probówki lizujące o sile 3 500 x g przez 5 sekund w celu usunięcia homogenatu z pokrywek i ostrożnie zdekantować homogenat indywidualnie do sterylnych probówek luminometru. 
	nuta: W przypadku oznaczania liczby CFU (krok 5.7) należy upewnić się, że zarezerwowano 100 μl homogenatu w sterylnej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odzyskać pozostały homogenat przez przemycie probówek z matrycą lizującą 1 ml PBS-T i odpipetować do odpowiednich probówek z luminometrem.</li>
	<li>Wirować rurki luminometru i zmierzyć bioluminescencję homogenatów opisanych wcześniej w kroku 1.4.</li>
	<li>Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia homogenatu na 24-dołkowych płytkach hodowlanych przy użyciu PBS-T. Umieścić 10 μl rozcieńczenia na płytkach agarowych Middlebrook 7H11 zawierających 0,5% glicerolu, 50 μg/ml higromycyny, 10% OADC i 20 μg/ml piperacyliny, w celu określenia stosunku RLU/CFU luksów BCG po zakażeniu in vivo. 
	nuta: Piperacylina eliminuje natywną mikrobiotę G. mellonella przy minimalnym hamowaniu wzrostu BCG lux16.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykreśl krzywą przeżycia Kaplana-Meiera na podstawie zebranych danych i przeprowadź test Mantela-Coxa (log-ranga) w celu określenia istotności wyniku, gdzie *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, a ****p < 0,0001.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report+2018%22">Global tuberculosis report 2018</a>. , Geneva. (2018).</li>
<li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis%3A+meta-analysis+of+the+published+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li>
<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li>
<li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717(2017).</li>
<li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development%3A+a+landscape+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li>
<li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+tuberculosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).</li>
<li>Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li>
<li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li>
<li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li>
<li>Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li>
<li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li>
<li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li>
<li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li>
<li>López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38(2015).</li>
<li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li>
<li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection%2C+pathogenesis%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).</li>
<li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae%2C+Galleria+mellonella%2C+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li>
<li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
<li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria%2C+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+%28BCG+lux%2FM.Tb+lux%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).</li>
<li>Jorjão, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+moths+to+caterpillars%3A+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li>
<li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113(2018).</li>
<li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108(2018).</li>
<li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Maria+Curie-Sklodowska+University%22%5BJournal%5D)">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li>
<li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li>
<li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li>
<li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li>
<li>Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie G. mellonella jako modelu infekcji zostało ustalone dla wielu patogenów bakteryjnych i grzybiczych do badania zjadliwości, interakcji gospodarz-patogen oraz jako badanie przesiewowe dla nowych terapii10,22. Poniższa dyskusja opiera się na eksperymentalnej procedurze wykorzystania G. mellonella jako modelu infekcji MTBC. 
Stan zdrowia naiwnych larw przed eksperymentem może mieć znaczący wpływ na w...

Gruźlica (TB) jest głównym zagrożeniem dla globalnego zdrowia publicznego z 9 milionami nowych przypadków rocznie i 1,5miliona zgonów1. Ponadto szacuje się, że jedna czwarta światowej populacji jest zarażona czynnikiem wywołującym chorobę, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Wśród zakażonej populacji u 5-10% rozwinie się aktywna gruźlica w ciągu swojego życia. Co więcej, pojawienie się i rozprzestrzenianie Mtb opornego na wiele leków (MDR) i intensywnie lekoopornego (XDR) stanowi poważne zagrożenie dla kontroli choroby, a 123 kraje zgłosiły co najmniej jeden przypadek XDR1. Leczenie gruźlicy wymaga koktajlu co najmniej czterech leków przeciwprątkowych, z których izoniazyd i ryfampicyna są przepisywane na okres co najmniej sześciu miesięcy; Leczenie często wiąże się ze złożonymi skutkami ubocznymi i toksycznością. Ochrona przed jedyną zarejestrowaną szczepionką przeciwko gruźlicy, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), wynosi zmienna2. Niepełne zrozumienie patogenezy gruźlicy znacznie utrudnia opracowywanie nowych strategii terapeutycznych i szczepień.
Przez dziesięciolecia modele infekcji zwierzęcych były niezbędne do badań nad gruźlicą, aby zrozumieć podstawową patogenezę i odpowiedź gospodarza na infekcję, a także ocenić nowe środki przeciw prątkom, immunoterapie i nowe kandydatki na szczepionki3,4. Jednak badania z wykorzystaniem zwierzęcych modeli zakażenia gruźlicą są niezwykle trudne, ponieważ patogeneza i progresja zakażenia gruźlicą są złożone i nie ma jednego modelu zwierzęcego, który naśladowałby pełne spektrum i ważne cechy choroby5,6. Ponadto eksperymenty na zwierzętach są kosztowne, czasochłonne i wymagają pełnego uzasadnienia etycznego. Niemniej jednak, zwierzęce modele zakażenia gruźlicą zostały opisane u naczelnych innych niż ludzie (np. makaki), świnki morskie, króliki, bydło, świnie, myszy i danio pręgowane, przy czym każdy z nich ma swoje ograniczenia3,4. Model mysi jest najczęściej stosowanym modelem ze względu na koszty, dostępność linii wsobnych, powtarzalność infekcji i obfitość odczynników immunologicznych. Jednak zazwyczaj nie tworzą ziarniniaków związanych z obszarami niedotlenienia, które są charakterystyczne dla utajonego zakażenia gruźlicą (LTBI)6. Świnki morskie są bardzo podatne na zakażenie Mtb, z patologią i wczesnym powstawaniem ziarniniaka podobnymi do tych u ludzi i są szeroko stosowane w testach szczepionek; Jednak brak odczynników immunologicznych utrudnia ich wykorzystanie jako modelu infekcji7. Danio pręgowany nadaje się do badań przesiewowych na dużą skalę we wczesnych fazach badań przedklinicznych ze względu na ich niewielkie rozmiary, szybką reprodukcję i zaawansowane narzędzia genetyczne, ale anatomicznie i fizjologicznie różnią się od ludzi i są podatne tylko na zakażenie Mycobacterium marinum3. Modele zwierzęce najbardziej przypominające ludzką infekcję Mtb to naczelne inne niż ludzie (np. makaki), ale są drogie i mają istotne względy etyczne i praktyczne, co znacznie ogranicza ich zastosowanie8.
Larwa owadów woskowej lub o strukturze plastra miodu, Galleria mellonella, staje się coraz bardziej popularna jako model infekcji dla różnych patogenów bakteryjnych i grzybiczych9, oraz jako badanie przesiewowe dla nowych kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe10. G. mellonella jest udanym modelem bezkręgowców ze względu na wyrafinowany wrodzony układ odpornościowy (składający się z obrony komórkowej i humoralnej), który ma wysoki stopień strukturalnego i funkcjonalnego podobieństwa do kręgowców11. Obejmuje to mechanizmy immunologiczne, takie jak fagocytoza patogenów przez hemocyty (funkcjonalnie podobne do makrofagów ssaków i neutrofili)12,13, produkcja i krążenie peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) i białek podobnych do dopełniacza w hemolimfie (analogicznie do krwi ssaków) G. mellonella11. Inne zalety9,14,15 larw G. mellonella jako modelu: 1) 1) ich duży rozmiar (20−30 mm), który pozwala na łatwą manipulację i infekcję, a także pobieranie tkanek i hemolimfy do analiz, 2) łatwa konserwacja w temperaturze 37 °C, kompatybilna z badaniem ludzkich patogenów, 3) precyzyjna infekcja przez iniekcję bez konieczności znieczulenia, 4) skuteczność środków przeciwdrobnoustrojowych można ocenić przy użyciu mniejszej ilości leków do oceny, 5) brak ograniczeń etycznych w porównaniu z wykorzystaniem ssaków, 6) można stosować duże grupy w porównaniu z modelami zwierzęcymi, co pozwala na większą odtwarzalność, oraz 7) wymagany jest krótszy czas eksperymentów z infekcjami.
W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że G. mellonella może być wykorzystany jako nowy model infekcji do badania patogenezy infekcji przez bioluminescencyjny M. bovis BCG lux, genetycznie zmodyfikowaną wersję szczepu szczepionki i członka kompleksu Mtb (MTBC)16. Podczas gdy G. mellonella była wcześniej używana jako model infekcji dla prątków niegruźliczych (NTM), głównie M. marinum i Mycobacterium abscessus17,18, badania z użyciem MTBC są ograniczone do badań Li et al.16. Bioluminescencyjne, niepatogenne szczepy prątków, które mogą być stosowane na poziomie hermetyczności (CL) 2 jako substytut Mtb, oferują zalety bezpieczeństwa i praktyczności w porównaniu z prątkami chorobotwórczymi. Po zakażeniu BCG lux larwy zaczynają rozwijać wczesne struktury podobne do ziarniniaka, co może dostarczyć cennych informacji na temat roli odporności wrodzonej w powstawaniu zakażenia gruźlicą16. Ponadto ten prosty model infekcji bezkręgowców może zapewnić szybką, tanią i wiarygodną ocenę patogenezy gruźlicy, obejmującą kontrolowane prowokacje i wielokrotne powtórzenia w celu zapewnienia odtwarzalności. Co więcej, model ten może zostać wykorzystany do badań przesiewowych nowych leków przeciwgruźliczych i kandydatów na szczepionki we wczesnym stadium rozwoju, zmniejszając ogólną liczbę zwierząt biorących udział w eksperymentach. Korzystna jest również możliwość pomiaru zmian w strukturze gospodarza i patogenu, transkryptomu i proteomie w celu określenia celów leków i oceny mechanizmów działania nowych leków i szczepionek terapeutycznych.
Tutaj opisujemy eksperymentalne protokoły przygotowania bioluminescencyjnego inokulum M. bovis BCG lux i larw G. mellonella do infekcji prątkami, a także określanie przeżywalności zarówno larw, jak i prątków w odpowiedzi na infekcję.

<table><tbody><tr><td>Probówka reakcyjna 1,5 ml (Eppendorf)</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>20, 200 i 1 000 &mikro; L pipeta i końcówki z filtrem</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowej płytki hodowlanej</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 25 ml i chłopiec do pipet</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>3-komorowej szalki Petriego (94/15 mm)</td><td>Wirówka Greiner</td><td>637102</td><td></td></tr><tr><td>Dowolny</td><td>dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa klasy II</td><td>Dowolny dostawca</td><td>n/ </td><td></td></tr><tr><td>kolba Erlenmeyera z wentylowaną nakrętką (250 ml)</td><td>Corning</td><td>CLS40183</td><td></td></tr><tr><td>etanol (>99,7%)</td><td>VWR</td><td>208221.321</td><td></td></tr><tr><td>Galleria mellonella (250 / opakowanie)</td><td>Livefood Direct UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator glicerolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>(FastPrep-24 5G) MP</td> <td>Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Luminometr Corning</td><td>30-240CR</td><td></td></tr><tr><td>(Autolumat LB 953)</td><td>Berthold</td><td>34622</td><td></td></tr><tr><td>Rurki luminometru</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Matryca lizująca (S, 2,0 mL)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka (25 i mikro; L, 25 G)</td><td>SGE</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11 agar</td><td>BD Bioscience</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 bulion</td><td>BD Bioscience</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Wzbogacanie Middlebrook ADC</td><td>BD Bioscience</td><td>212352</td><td></td></tr><tr><td>Wzbogacanie Middlebrook OADC</td><td>BD Bioscience</td><td>212240</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium bovis BCG lux</td><td>Various</td><td>n/a n/decyl</td><td></td></tr><tr><td>aldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7384-100G</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do wytrząsania orbitalnego</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 80 (Tween-80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8074-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Małe pudełko</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td>zalecanego ciemnego lub nieuszczelnionego pudełka</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td>Krótka i wąska końcówka/długa pęseta</td></tr><tr><td>Winterm (V1.08)</td> <td>Berthold</td><td>n/a</td><td>Program LB953. TTB</td></tr><tr><td>szalka Petriego (94/15 mm)</td><td>Greiner</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (94 mm)</td><td>Dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td>Cięte na dopasowanie</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie bezkręgowców galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu mycobacterium tuberculosis

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Gruźlica jest główną przyczyną śmiertelności z powodu chorób zakaźnych i uważa się, że około jedna czwarta światowej populacji jest zarażona Mycobacterium tuberculosis. Pomimo dziesięcioleci badań, wiele mechanizmów stojących za sukcesem M. tuberculosis jako organizmu chorobotwórczego pozostaje do zbadania, a opracowanie bezpieczniejszych, skuteczniejszych leków przeciwprątkowych jest pilnie potrzebne, aby przeciwdziałać wzrostowi i rozprzestrzenianiu się gruźlicy lekoopornej. Jednak postęp w badaniach nad gruźlicą jest hamowany przez tradycyjne modele zakażeń ssaków, które są drogie, czasochłonne i etycznie trudne. Wcześniej ustaliliśmy, że larwy owada Galleria mellonella (woskowa) są nowatorskim, powtarzalnym, tanim, wysokoprzepustowym i etycznie akceptowalnym modelem infekcji dla członków kompleksu M. tuberculosis. Tutaj opisujemy utrzymanie, przygotowanie i zakażenie G. mellonella bioluminescencyjnym Mycobacterium bovis BCG lux. Korzystając z tego modelu infekcji, można zaobserwować zjadliwość zależną od dawki prątków, a szybki odczyt obciążenia prątkami in vivo za pomocą pomiarów bioluminescencji jest łatwo osiągalny i powtarzalny. Chociaż istnieją ograniczenia, takie jak brak w pełni opisanego genomu do analizy transkryptomicznej, można przeprowadzić analizę ontologiczną przeciwko genetycznie podobnym owadom. Jako tani, szybki i etycznie akceptowalny model gruźlicy, G. mellonella może być stosowany jako wstępne badanie przesiewowe w celu określenia skuteczności i toksyczności leku oraz do określenia porównawczej zjadliwości prątków przed zastosowaniem konwencjonalnych modeli ssaków. Zastosowanie modelu G. mellonella-prątki doprowadzi do zmniejszenia znacznej liczby zwierząt wykorzystywanych obecnie w badaniach nad gruźlicą.

W niniejszej pracy przedstawiamy reprezentatywne dane, które można uzyskać przy użyciu modelu infekcji G. mellonella — BCG lux, oraz podkreślamy zalety wykorzystania G. mellonella jako modelu infekcji dla przedstawicieli kompleksu MTBC (Rysunek 1). Procedury eksperymentalne wraz z kluczowymi uwagami technicznymi przedstawiono na Rysunku 2.
<im...

Galleria mellonella została niedawno uznana za powtarzalny, tani i etycznie akceptowalny model infekcji dla kompleksu Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kroki podjęte w celu ustalenia skutecznego zakażenia G. mellonella bioluminescencyjnym Mycobacterium bovis BCG lux.

Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie Galleria mellonella jako alternatywnego modelu zakażeń do badania gruźlicy, co pozwala na ograniczenie liczby stosowanych w badaniach modeli ssaków. W porównaniu z konwencjonalnymi modelami ssaków, takimi jak myszy, Galleria mellonella jest tańszym, akceptowalnym etycznie i bardziej dostępnym modelem do badania gruźlicy. Dalsza optymalizacja tego modelu umożliwi przesiewowe badanie skuteczności i toksyczności potencjalnych leków przeciwprątkowych oraz przyczyni się do opracowania pilnie potrzebnych nowych terapii gruźlicy.Galleria mellonella posiada złożony wrodzony układ odpornościowy porównywalny z układem ssaków. Badanie interakcji między gospodarzem a patogenem może dodatkowo ujawnić rolę odporności wrodzonej w gruźlicy. Wykorzystanie Galleria mellonella jako modelu infekcyjnego nie ogranicza się do gruźlicy i w ciągu ostatniej dekady było szeroko stosowane w przypadku innych patogenów bakteryjnych i grzybiczych.Na początek rozmroź zamrożony 1,2-mililitrowy stok glicerolowy Mycobacterium bovis BCG lux, szczep szczepionkowy z Montrealu przekształcony plazmidem wahadłowym pSMT1 zawierającym geny luxAB. W oznakowanej kolbie Erlenmeyera o poj

use-invertebrate-galleria-mellonella-as-an-infection-model-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji Mycobacterium bovis u larw woskowej większej, Galleria mellonella. Bioluminescencyjny szczep Mycobacterium bovis BCG jest wstrzykiwany do hemolimfy larwy w celu wywołania infekcji, a bioluminescencja jest mierzona w określonych odstępach czasu w celu zbadania postępu infekcji.

Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej u larw owadów

Ten film prezentuje pomiar obciążenia bakteryjnego in vivo za pomocą Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larw owadów zakażonych luksem. Proces obejmuje homogenizację larw, traktowanie substratem lucyferazy i pomiar bioluminescencji w celu określenia względnych jednostek światła, które korelują z obciążeniem bakteryjnym.

Pomiar obciążenia in vivo bakteriami eksprymującymi lucyferazy w larwie owada

Larwa woskowej Galleria mellonella została niedawno ustanowiona jako model in vivo do badania infekcji Legionella pneumophila. W tym miejscu demonstrujemy podstawowe techniki charakteryzujące patogenezę Legionelli w larwach, w tym inokulację, pomiar zjadliwości i replikacji bakterii, a także ekstrakcję i analizę zakażonych hemocytów.

Wykorzystanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia Legionella pneumophila

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

Galleria mellonella służy jako model bezkręgowców dla rozsianej kandydozy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół infekcji i podajemy dane pomocnicze dotyczące skuteczności modelu.

Model zakażenia robakiem woskowym Galleria mellonella dla rozsianej kandydozy

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół dla modelu doustnego podawania z użyciem larw Galleria mellonella i jak scharakteryzować indukowane wrodzone reakcje immunologiczne. Korzystając z tego protokołu, naukowcy bez praktycznego doświadczenia będą mogli stosować metodę wymuszonego karmienia G. mellonella.

Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem

Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowane ramy optymalizacji modeli zakażenia G. mellonella do zastosowań w przedklinicznej ocenie antybakteryjnej. Zastosowanie modelu G. mellonella w ramach przedklinicznego procesu rozwoju środków przeciwdrobnoustrojowych może zmniejszyć liczbę nieskutecznych związków przechodzących do badań klinicznych.

Galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania śródskórnej inokulacji Mycobacterium avium w uchu myszy w niskiej dawce, aby odzwierciedlić warunki podobne do ekspozycji.

Śródskórne inokulowanie Mycobacterium avium w uchu myszy

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj wykorzystanie Galleria mellonella jako alternatywnego modelu infekcji do badania gruźlicy. Ta metoda pozwala na etyczne i ekonomiczne badanie interakcji patogen-gospodarz oraz skuteczności leków.

Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis

Przeglądaj więcej filmów