Name: Naturalne odkrywanie produktu z diagnostycznym filtrowaniem fragmentacji LC-MS/MS: zastosowanie do analizy mikrocystyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę diagnostycznego filtrowania fragmentacji LC-MS/MS w oprogramowaniu MZmine do wykrywania mikrocystyn i nowych produktów naturalnych w złożonych mieszaninach. Technika ta umożliwia identyfikację toksyn zanieczyszczających żywność i wodę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Heather Roshon (Canadian Phycological Culture Centre, University of Waterloo za dostarczenie badanej kultury sinic oraz Sawsan Abusharkh (Carleton University) za pomoc techniczną.

1. Przygotowanie zestawów danych z chromatografii cieczowej (LC)-MS/MS bez celu
UWAGA: DFF można wykonać przy użyciu dowolnego spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości i metody analitycznej zoptymalizowanej dla docelowej klasy analitów. Zoptymalizowane przez MC warunki LC-MS/MS na spektrometrze mas Orbitrap są wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Pobieranie MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) 
	UWAGA: Przykładowe CPCC300.raw danych można znaleźć na stronie https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
	<ol>
		<li>W menu rozwijanym Metody danych nieprzetworzonych wybierz opcję Import danych nieprzetworzonych.</li>
		<li>Wybierz pliki danych, które mają być analizowane. Można importować jeden lub wiele plików.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli format danych dostawcy nie jest obsługiwany przez MZmine, użyj Proteowizard16, aby wygenerować centroidalne pliki danych .mzml.
	<ol>
		<li>Wybierz filtr Pobieranie szczytowe, aby zastosować algorytm centroidingu dostarczony przez dostawcę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Diagnostyczne filtrowanie fragmentacji importowanych plików DDA
<ol>
	<li>Za pomocą kursora wybierz i podświetl plik(i) danych w kolumnie Pliki danych surowych na głównym ekranie MZmine.</li>
	<li>W menu rozwijanym Wizualizacja wybierz opcję Filtrowanie fragmentacji diagnostycznej.</li>
	<li>W wyświetlonym oknie dialogowym DFF (Rysunek 3) wprowadź następujące opcje:
	<ol>
		<li>Czas retencji – użyj automatycznego zakresu lub zdefiniuj zakres czasów retencji w minutach, w których docelowa klasa analitów będzie eluować.</li>
		<li>Prekursor m/z - użyj automatycznego zakresu lub zdefiniuj zakres m/z docelowej klasy analitów, w tym możliwość dla wielu naładowanych związków, jeśli jest to właściwe.</li>
		<li> tolerancja m/z – Wprowadź osiągalną dokładność masy MS/MS MSinstrumentu; 0,01 m/z lub 3,0 ppm jest odpowiednie dla platformy Orbitrap. Jeśli badane będą tylko jony produktu diagnostycznego, wprowadź wartość 0,0 w opcji Diagnostyczna wartość utraty neutralności (Da). I odwrotnie, jeśli badane będą tylko straty neutralne diagnostycznie, wprowadź wartość 0,0 do opcji Diagnostyczne jony produktu (m/z).</li>
		<li>Diagnostyczne jony produktu (m/z) – Wprowadź specyficzne dla klasy jony produktu m/z. Oddziel wiele jonów produktu przecinkiem. 
		UWAGA: Wprowadzenie wielu jonów produktu spowoduje wizualizację widm zawierających wszystkie wymienione jony produktowe.</li>
		<li>Diagnostyczna wartość utraty neutralnego przewodu (Da) – Wprowadź specyficzne dla klasy straty neutralne. Oddziel wielokrotne straty neutralne przecinkiem. 
		UWAGA: Wprowadzenie wielu strat neutralnych spowoduje wizualizację widm, które zawierają wszystkie wymienione straty neutralne. Wprowadzenie zarówno jonów diagnostycznych produktu, jak i strat neutralnych pozwoli na wizualizację widm spełniających wszystkie kryteria.</li>
		<li>Minimalna intensywność jonów diagnostycznych (% piku podstawowego) – Jako % piku bazowego widm MS/MS określ minimalną intensywność jonów produktu diagnostycznego i/lub strat obojętnych, które należy uwzględnić.</li>
		<li>Plik wyjściowy Peaklist — wybierz ścieżkę i nazwę pliku, aby wyświetlić wyniki.</li>
		<li>Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć analizę DFF. Wykres DFF pojawi się po pomyślnym wykonaniu powyższych kroków 
		UWAGA: Zostaną wygenerowane dwa .csv pliki danych. {Plik wyjściowy listy szczytów}.csv zawiera prekursor m/z, numery skanów i czasy przechowywania skanów. Można to wykorzystać w istniejących modułach MZmine, w tym w metodach danych surowych > wykrywaniu pików > wykrywaniu pików w celu wygenerowania wyekstrahowanych chromatogramów jonowych prekursorów, które spełniały zdefiniowane kryteria DFF. {Plik wyjściowy Peaklist}_data.csv zawiera prekursor m/z, jon produktu m/z i czasy retencji, aby umożliwić generowanie wykresów DFF poza MZmine.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przykładowe zastosowanie DFF do analizy mikrocystyny
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Wysterylizuj 250 ml kolb Erlenmeyera zawierających 30 ml sterylnego podłoża MA 17 lub innego podłoża do wzrostu sinic (BG-11) wyposażonych w korek piankowy.</li>
		<li>Zaszczepić wysterylizowane pożywki wzrostowe kulturą sinic do około 5 × 105 komórek mL-1 w warunkach aseptycznych. Monitoruj gęstość komórek za pomocą hemocytometru. W tym przykładzie szczep M. aeruginosa CPCC300 fotoautotroficznie w temperaturze 27 °C, oświetlony chłodnym białym światłem fluorescencyjnym (30 μE m-2 s-1) w reżimie 12 godzin światła: 12 godzin ciemności. Obracaj komórki raz dziennie.</li>
		<li>Oddzielić komórki od pożywki hodowlanej po 26 dniach przez filtrację próżniową przy użyciu bibuły filtracyjnej z mikrofibry szklanej GF/C o średnicy 47 mm.</li>
		<li>Dodaj 3 ml 80% metanolu (aq) do pobranych komórek w 14 ml probówki.</li>
		<li>Wirować, a następnie sonikować probówkę (probówki) zawierającą komórki sinic przez 30 s każda. Przechowywać probówkę (probówki) w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę. Umieść probówkę z powrotem w temperaturze pokojowej i pozwól próbce (próbkom) rozmrozić się przez 15 minut.</li>
		<li>Powtórz krok 3.1.5 jeszcze dwa razy, aby skutecznie zmodyfikować komórki.</li>
		<li>Przefiltruj powstały ekstrakt(y) z komórek sinic przez filtr(y) strzykawkowy (filtry) PTFE 0,22 μm.</li>
		<li>Suchy ekstrakt(-y) za pomocą parownika w temperaturze 30 °C przy użyciu delikatnego strumienia azotu gazowego. Przechowywać ekstrakt w suchym miejscu w temperaturze -20 °C do czasu analizy LC-MS/MS.</li>
		<li>Przed analizą rozpuścić wysuszoną pozostałość w 500 μl 90% metanolu (aq) i wirować przez 30 s w bursztynowej fiolce HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ekstraktu z sinic przy użyciu metody akwizycji DDA na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości. 
	UWAGA: Zoptymalizowane warunki LC-MS dla analizy MC użyte tutaj są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Przygotuj plik(i) danych DDA i zaimportuj je do MZmine, wykonując kroki 1.1 i 1.2.</li>
	<li>Wybierz pliki danych i uruchom moduły DFF, wykonując kroki 2.1-2.2.</li>
	<li>W przypadku analizy MC użyj następujących ustawień w module DFF (Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Czas retencji – Wprowadź zakres od 2.00 do 6.00 min.</li>
		<li>Prekursor m/z – Zakres wejściowy m/z od 430,00 do 1200,00.</li>
		<li> Tolerancja m/z – Zastosuj tolerancję m/z 0,01 m/z lub 3,0 ppm.</li>
		<li>Jony produktu diagnostycznego (m/z) – Wejście m/z 135.0803, 163.1114 jako jony produktu diagnostycznego</li>
		<li>Wartość strat neutralności diagnostycznej (Da) - Wejście 0.0 w celu zdefiniowania, że nie są używane żadne straty neutralne diagnostycznie.</li>
		<li>Minimalna intensywność jonów diagnostycznych (% piku podstawowego) – Użyj 15.00 jako minimalnego progu intensywności</li>
		<li>Plik wyjściowy Peaklist — umożliwia zdefiniowanie pliku wyjściowego jako putative_MCs.csv.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć analizę DFF. Wykres DFF (Rysunek 4) pojawi się po pomyślnym wykonaniu powyższych kroków</li>
</ol>

<ol><li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li>
<li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS%E2%80%93NRPS%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li>
<li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li>
<li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).</li>
<li>Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%3A+An+International+Journal+Devoted+to+the+Rapid+Dissemination+of+Up-to-the-Minute+Research+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li>
<li>Bartók, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+%28FB1%29+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395(2010).</li>
<li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+3%3A+tables+of+microcystins+and+nodularins%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+cyanobacterial+monitoring+and+cyanotoxin+analysis%22%5BJournal%5D)">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li>
<li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blooming+algae%3A+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Fisheries+and+Aquatic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li>
<li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms%3A+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+algae%22%5BJournal%5D)">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li>
<li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+microcystins+by+LC%2FMS%2FMS+under+ion+trap+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antibiotics%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710(2006).</li>
<li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+%28Microcystis+aeruginosa%29+under+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li>
<li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li>
<li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions%3A+differences+of+electrospray+ionization%2Fcollision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda%5BTitle%5D)+AND+%22European+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li>
<li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science & technology. 48 (4), 2097(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

DFF to prosta i szybka strategia wykrywania całych klas związków, szczególnie istotna dla odkrywania związków produktów naturalnych. Najważniejszym aspektem DFF jest określenie konkretnych kryteriów fragmentacji MS/MS dla docelowej klasy związków. W tym reprezentatywnym przykładzie DFF użyto do wykrycia wszystkich pozostałości Adda zawierających MC obecnych w ekstrakcie komórkowym M. aeruginosa. Chociaż zdecydowana większość MC zawiera resztę Adda, znane są inne pozostałości w tej pozycji, w szczególności waria...

Tandemowa spektrometria mas (MS/MS) jest powszechnie stosowaną metodą spektrometrii mas, która polega na izolowaniu jonu prekursorowego i wywoływaniu fragmentacji poprzez zastosowanie energii aktywacji, takiej jak dysocjacja wywołana zderzeniem (CID)1. Sposób, w jaki jon się fragmentuje, jest ściśle związany z jego strukturą molekularną. Produkty naturalne są często biosyntetyzowane jako mieszaniny strukturalnie podobnych związków, a nie jako pojedyncza unikalna substancja chemiczna2. W związku z tym strukturalnie pokrewne związki, które są częścią tej samej klasy biosyntezy, często mają kluczowe cechy fragmentacji MS/MS, w tym wspólne jony produktowe i/lub straty obojętne. Możliwość badania przesiewowego złożonych próbek pod kątem związków, które zawierają jony produktowe specyficzne dla danej klasy i/lub ubytki neutralne, jest potężną strategią wykrywania całych klas związków, potencjalnie prowadzącą do odkrycia nowych produktów naturalnych3,4,5,6. Przez dziesięciolecia metody spektrometrii mas, takie jak skanowanie strat obojętnych i skanowanie jonów prekursorowych wykonywane na instrumentach o niskiej rozdzielczości, pozwalały na wykrywanie jonów o tej samej utracie neutralnej lub jonów produktowych. Jednak konkretne jony lub przejścia musiały zostać zdefiniowane przed przeprowadzeniem eksperymentów. Ponieważ spektrometry masowe o wysokiej rozdzielczości stają się coraz bardziej popularne w laboratoriach badawczych, złożone próbki są obecnie powszechnie badane przy użyciu nieukierunkowanych, zależnych od danych metod akwizycji (DDA). W przeciwieństwie do tradycyjnego skanowania utraty neutralności i jonów prekursorowych, związki pokrewne strukturalnie można zidentyfikować za pomocą analizy po akwizycji7. W tej pracy demonstrujemy opracowaną przez nas strategię określaną jako filtrowanie fragmentacji diagnostycznej (DFF)5,6, proste i przyjazne dla użytkownika podejście do wykrywania całych klas związków w złożonych matrycach. Ten moduł DFF został zaimplementowany na platformie open source MZmine 2 i jest dostępny po pobraniu MZmine 2.38 lub nowszych wersji. DFF umożliwia użytkownikom efektywne badanie zestawów danych DDA pod kątem widm MS/MS, które zawierają jony produktowe i/lub straty neutralne, które są diagnostyczne dla całych klas związków. Ograniczeniem DFF jest to, że charakterystyczne jony produktowe i/lub straty obojętne dla danej klasy związków muszą być określone przez analityka.
Na przykład, każda z ponad 60 różnych zidentyfikowanych mykotoksyn fumonizyny8,9 posiadają trikarbaliliczny łańcuch boczny, który generuje m/z 157.0142 (C6H5O5-) jon po rozdrobnieniu [M-H]- ion4. W związku z tym wszystkie przypuszczalne fumonizyny w próbce można wykryć za pomocą DFF, przesiewając wszystkie widma MS/MS w zestawie danych DDA, które zawierają wyraźny jon produktowy m / z 157.0142. Podobnie, związki siarczanowe można wykryć, przeprowadzając badania przesiewowe zestawów danych DDA dla widm MS/MS, które zawierają neutralną stratę diagnostyczną 79,9574 Da (SO3)3. Podejście to zostało również z powodzeniem zastosowane do wykrywania nowych cyklicznych peptydów5 oraz produktów naturalnych, które zawierają reszty tryptofanu lub fenyloalaniny6.
Aby zademonstrować skuteczność DFF i łatwość jego użycia w ramach platformy MZmine10, zastosowaliśmy to podejście do analizy mikrocystyn (MCs); klasy ponad 240 strukturalnie powiązanych toksyn wytwarzanych przez słodkowodne cyjanobakterie11,12,13.
Najczęściej zgłaszanymi cyjanotoksynami są MCs, a najczęściej badany jest kongener MC-LR (leucyna [L]/arginina [R]) (Rysunek 1). MC to monocykliczne nierybosomalne heptapeptydy, biosyntetyzowane przez wiele rodzajów sinic, w tym Microcystis, Anabaena, Nostoc i Planktothrix12,13. MC składają się z pięciu wspólnych reszt i dwóch zmiennych pozycji zajmowanych przez L-aminokwasy. Prawie wszystkie MC posiadają charakterystyczną resztę β kwasu 3-amino-9-metoksy-2,6,8-trimetylo-10-fenylodeka-4,6-dienowego (Adda) na pozycji 511. Ścieżki fragmentacji MS/MS MC są dobrze opisane14,15; reszta Adda jest odpowiedzialna za wyraźny jon produktowy MS/MS, m/z 135.0803+ (C9H11O+), a także inne jony produktowe, w tym m/z 163.1114+ (C11H15O+) (Rysunek 2). Nieukierunkowane zestawy danych DDA ekstraktów komórkowych Microcystis aeruginosa można przebadać pod kątem wszystkich obecnych mikrocystyn przy użyciu tych jonów diagnostycznych, pod warunkiem, że mikrocystyny mają resztę Adda.

<table><tbody><tr><td>Cyanobacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td><td>KANADYJSKIE CENTRUM KULTUR FILOLOGICZNYCH</td><td></td> CPCC300 <td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteowizard (oprogramowanie)</td><td></td><td>oprogramowanie</td><td>Oprogramowanie http://proteowizard.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>Mzmine 2</td><td></td><td></td><td>http://mzmine.github.io/</td></tr><tr><td>LC-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap</td><td>Wyposażony w</td><td></td> <td>źródło jonizacji HESI</td></tr><tr><td>1290 UHPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Wyposażony w pompę binarną, autosampler, komorę kolumny</td></tr><tr><td>C18</td><td>Kolumna Agilent</td><td>959757-902</td><td>Eclipse Plus C18 RRHD (2,1 &razy; 100 mm, 1,8 &mu; m)</td></tr> <tr><td>< mocny>Rozpuszczalniki< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima LC-MS klasa Metanol</td><td>Fisher</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS klasa acetonitrylu</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS klasa Fisher</td><td></td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS klasa Kwas mrówkowy</td><td>Fisher</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Micro 21</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-772-436</td><td></td></tr><tr><td>Inne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bursztynowe fiolki HPLC 2 ml/nakrętki</td><td>Agilent</td><td>5182-0716/5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>0,2-&mu; m Filtry strzykawkowe z PTFE</td><td>Pall Corp.</td><td>4521</td><td></td></tr><tr><td>Filtry z mikrowłókna szklanego Whatman 47mm GF/A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1820047</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MA media (pH 8,6) (ilość / L)</td><td></td><td></td><td>Watanabe, MF & Oishi, S. Wpływ czynników środowiskowych na toksyczność cyjanobakterii (Microcystis aeruginosa) w warunkach hodowli. Mikrobiologia stosowana i środowiskowa. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td></tr><tr><td>Ca(NO3)&middot; 4H2O, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2786</td><td></td></tr><tr><td>KNO3, 100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5022</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4, 40 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5640</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Glicerofosforan sodu, 100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3, 20 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bicine, 500 mg</td><td>roztwór metalu Sigma-Aldrich</td><td>RES1151B-B7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>P(IV), 5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doprowadzić następujące ilości do 1 l za pomocą ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaEDTA&middot; 2HO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3 &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Baker</td><td>2540</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Baker</td><td>3764</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanobakterie BG-11 50X Roztwór słodkowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

naturalne odkrywanie produktu z diagnostycznym filtrowaniem fragmentacji lc-ms/ms: zastosowanie do analizy mikrocystyny

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Produkty naturalne są często biosyntetyzowane jako mieszaniny strukturalnie podobnych związków, a nie jako pojedynczy związek. Ze względu na ich wspólne cechy strukturalne, wiele związków z tej samej klasy ulega podobnej fragmentacji MS/MS i ma kilka identycznych jonów produktowych i/lub strat obojętnych. Celem diagnostycznego filtrowania fragmentacyjnego (DFF) jest skuteczne wykrycie wszystkich związków danej klasy w ekstrakcie złożonym poprzez badanie przesiewowe niedocelowych zestawów danych LC-MS/MS pod kątem widm MS/MS, które zawierają jony produktowe specyficzne dla klasy i/lub straty neutralne. Metoda ta opiera się na module DFF zaimplementowanym w ramach platformy MZmine o otwartym kodzie źródłowym, który wymaga analizy ekstraktów próbek poprzez akwizycję zależną od danych na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości, takim jak kwadrupolowy Orbitrap lub kwadrupolowe analizatory masy czasu przelotu. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest to, że analityk musi najpierw określić, które jony produktowe i/lub straty neutralne są specyficzne dla docelowej klasy produktów naturalnych. DFF pozwala na późniejsze odkrycie wszystkich powiązanych produktów naturalnych w złożonej próbce, w tym nowych związków. W tej pracy wykazujemy skuteczność DFF poprzez badanie przesiewowe ekstraktów z Microcystis aeruginosa, wybitnego szkodliwego zakwitu glonów powodującego sinice, pod kątem produkcji mikrocystyny.

Wykres DFF wygenerowany po analizie M. aeruginosa CPCC300 pokazano na Rycina 4. The x-osią tego wykresu jest m/z jonów prekursorowych, które spełniły określone kryteria DFF, podczas gdy yOś - pokazuje m/z wszystkich jonów produktowych w widmach MS/MS dla MC. W tej analizie kryteria detekcji MC obejmowały jony prekursorowe w obrębie m/z zakres 440–1200, czasy retencji od 2,00 do 6,00 min. Co najważniejsze, ...

Diagnostyczne filtrowanie fragmentacji, zaimplementowane w MZmine, to eleganckie, post-akwizycyjne podejście do przesiewania zbiorów danych LC-MS/MS dla całych klas zarówno znanych, jak i nieznanych produktów naturalnych. To narzędzie przeszukuje widma MS/MS pod kątem jonów produktowych i/lub strat neutralnych, które analityk zdefiniował jako diagnostyczne dla całej klasy związków.

Naturalne odkrywanie produktu z diagnostycznym filtrowaniem fragmentacji LC-MS/MS: zastosowanie do analizy mikrocystyny

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Produkty naturalne są często biosyntetyzowane jako klasa związków, a nie jako pojedynczy produkt. Diagnostyczne filtrowanie fragmentacji to proste podejście do wykrywania wszystkich związków powiązanych strukturalnie w złożonej mieszaninie. Diagnostyczne filtrowanie fragmentacji, zaimplementowane w oprogramowaniu MZmine, pozwala analitykowi na eksplorację zbiorów danych spektrometrii mas dla nowych produktów naturalnych, które w przeciwnym razie zostałyby pominięte.Obejmuje to nowe bioprodukty, a także nowe toksyny. Diagnostyczne filtrowanie fragmentacji, stosowane do klas toksyn, które zanieczyszczają żywność i wodę, może pomóc w ocenie narażenia. W przypadku stosowania do ekstraktów mikrobiologicznych i roślinnych może prowadzić do odkrycia nowych związków.Korzystanie z diagnostycznego filtrowania fragmentacji wymaga zrozumienia kluczowych cech tandemowej spektrometrii mas, które definiują klasę chemiczną. Oznacza to, że strukturalnie podobne związki będą generować charakterystyczne jony. Nazywam się Shawn Hoogstra.Jestem technikiem badawczym i programistą w naszym centrum i będę demonstrować procedurę. Aby przygotować próbkę do analizy mikrocystyny, należy zaszczepić 30 mililitrów sterylnej pożywki wzrostowej sinic do około pięciu razy 10 do piątej komórki na mililitr, w warunkach aseptycznych, w 250-mililitrowych kolbach Erlenmeyera, monitorując gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Po 26 dniach hodowli fotoautotroficznej, oświetlonej chłodnym białym światłem fluorescencyjnym przy użyciu 12-godzinnego reżimu światło-ciemność w temperaturze 27 stopni Celsjusza, z wirowaniem raz dziennie, użyj bibuły filtracyjnej z mikrowłókna szklanego GF / C o średnicy 47 mililitrów, aby oddzielić komórki od pożywki hodowlanej za pomocą filtracji próżniowej.Dodaj trzy mililitry 80% metanolu do zebranych komórek w 14-mililitrowych probówkach i wiruj, a następnie sonikuj każdą probówkę przez 30 sekund. Po sonikacji próbki poddać lizie za pomocą trzech kolejnych jednogodzinnych cykli zamrażania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i 15-minutowych cyklach rozmrażania w temperaturze pokojowej i przefiltrować każdy powstały ekstrakt z komórek sinic przez indywidualne filtry strzykawkowe z politetrafluoroetylenu o grubości 0,22 mikrometra. Używając delikatnego strumienia azotu gazowego, wysusz ekstrakty za pomocą parownika w temperaturze 30 stopni Celsjusza i przechowuj ekstrakty w stanie suchym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.W przypadku analizy metodą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej należy rozpuścić wysuszoną pozostałość do analizy w 500 mikrolitrach 90% metanolu i wirować próbki przez 30 sekund. Przenieść do bursztynowej fiolki do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Następnie przeanalizuj ekstrakt z sinic przy użyciu metody akwizycji zależnej od danych na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości zgodnie ze standardowymi protokołami.Większość mikrocystyn zawiera resztę ATA, która wytwarza dwa jony produktu diagnostycznego w tandemowej spektrometrii mas, od M do Z 135.0803 i 163.1114. Aby przygotować zestaw danych tandemowej spektrometrii mas do chromatografii cieczowej bez celu, otwórz MZmine 2 i wybierz Import surowych danych"w obszarze Metody surowych danych"menu rozwijane. Następnie wybierz pliki danych z analizy mikrocystyny i wybierz filtr pobierania pików, aby zastosować algorytm centroidingu dostarczony przez dostawcę.W przypadku filtrowania fragmentacji diagnostycznej (DFF) zaimportowanych plików akwizycji zależnych od danych użyj kursora, aby wyróżnić pliki danych, a następnie otwórz menu rozwijane Wizualizacja, aby wybrać opcję DFF. W wyświetlonym oknie dialogowym DFF wprowadź zakres czasów retencji i minut, w których docelowa klasa analitów zostanie elucja, oraz znajdź zakres stosunku masy do ładunku docelowej klasy analitów, w tym możliwość wielu naładowanych związków, jeśli to konieczne. Wprowadź osiągalną dokładność masową tandemowej spektrometrii mas przyrządu do spektrometrii mas i wprowadź specyficzne dla klasy jony produktowe stosunku masy do ładunku.Wprowadzić straty obojętne właściwe dla danej klasy i określić minimalne natężenie jonów produktu diagnostycznego i/lub strat obojętnych, które należy uwzględnić jako procent piku podstawowego widm tandemowej spektrometrii mas. Następnie wybierz ścieżkę i nazwę pliku, aby wyświetlić wyniki i kliknij OK"aby uruchomić DFF. Wykres DFF pojawi się po pomyślnym zakończeniu instalacji.Analityk musi zinterpretować tandemowe widma masowe znanych związków w ramach klasy związków w celu zidentyfikowania jonów poprodukcyjnych i/lub strat obojętnych, które są diagnostyczne dla całej klasy związków. Ten wykres DFF został wygenerowany po analizie M.aeruginosa CPCC 300. Oś x reprezentuje stosunek masy do ładunku jonów prekursorowych, które spełniały zdefiniowane kryteria DFF, podczas gdy oś y pokazuje stosunek masy do ładunku wszystkich jonów produktowych w widmach tandemowej spektrometrii mas mikrocystyny.Do tej analizy kryteria wykrywania mikrocystyny obejmowały jony prekursorowe w stosunku masy do ładunku 400 do 1 200 i czasy retencji od dwóch do sześciu minut. Co najważniejsze, te widma tandemowej spektrometrii mas zawierały oba stosunki masy do ładunku powyżej zdefiniowanego 15% progu intensywności piku bazowego. Spośród 4 116 widm tandemowej spektrometrii mas uzyskanych podczas analizy, 26 spełniało kryteria DFF i zostało wykrytych w ekstrakcie M.aeruginosa CPCC 300.Główne wykryte mikrocystyny można z pewnością przypisać jako mikrocystynę, leucynę, argininę i demetylowany kwas asparaginowy, mikrocystynę, leucynę, argininę. Ponieważ nowe związki są odkrywane za pomocą diagnostycznego filtrowania fragmentacji, organizmy mogą być hodowane na dużą skalę w celu izolacji i scharakteryzowania związków za pomocą NMR. W przypadku zastosowania do mikrocystyn, diagnostyczne filtrowanie fragmentacji pozwala nam określić, czy tradycyjne metody ukierunkowanych badań przesiewowych wykrywają główne toksyny obecne w próbce.

natural-product-discovery-with-lc-msms-diagnostic-fragmentation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Tutaj prezentujemy protokół sekwencyjnej celowanej kwantyfikacji i nieukierunkowanej analizy związków fluorowanych w wodzie za pomocą spektrometrii mas. Metodologia ta zapewnia ilościowe poziomy znanych związków fluorochemicznych i identyfikuje nieznane substancje chemiczne w powiązanych próbkach wraz z półilościowymi oszacowaniami ich obfitości.

Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Szybka multidyscyplinarna strategia wczesnego wykrywania zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn jest opisana tutaj. Pozwala na wykrycie cyjanobakterii i pokrewnych sinic w próbkach wody oraz w matrycach organicznych, takich jak próbki małży, w ciągu 24 godzin.

Wczesne wykrywanie zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn przy użyciu strategii szybkiego wykrywania

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Opracowano zintegrowany autosampler i kolektor frakcji (LC-mate), aby zautomatyzować powtarzalne separacje HPLC. Kompatybilny z detektorami HPLC generującymi sygnały analogowe, LC-mate zwiększa wydajność systemów obsługiwanych ręcznie i przyspiesza procesy badawcze oparte na wysokowydajnej chromatografii cieczowej.

Automatyczne rozdzielanie HPLC z wykorzystaniem LC-Mate: zintegrowany powtarzalny automatyczny próbnik i kolektor frakcji do mikroskalowego oczyszczania

Tu przedstawiamy standardowy protokół, który łączy wieloetapowe drzewa spektrometrii masowej z procesem fragmentacji opartym na peroralnym płynie Huoxiang Zhengqi.

Podejście techniczne do analizy strukturalnej nieznaego związku w płynie doustnym Huoxiang Zhengqi na podstawie liniowej spektrometrii mas z pułapką jonów

Poznaj metodę diagnostycznego filtrowania fragmentacji LC-MS/MS w oprogramowaniu MZmine do wykrywania mikrocystyn i nowych produktów naturalnych w złożonych mieszaninach. Technika ta umożliwia identyfikację toksyn zanieczyszczających żywność i wodę.

Naturalne odkrywanie produktu z diagnostycznym filtrowaniem fragmentacji LC-MS/MS: zastosowanie do analizy mikrocystyny

Przeglądaj więcej filmów