Name: Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę genetyki do przodu do identyfikacji genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster. Protokół obejmuje test wspinaczkowy, analizę histologiczną i sekwencjonowanie DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy szczególnie wdzięczni doktorowi Barry'emu Ganetzky'emu, w którego laboratorium przeprowadzono badanie genetyczne, co pozwoliło zidentyfikować i scharakteryzować bachora jako gen neuroprotekcyjny. Dziękujemy dr Stevenowowi Robinowowi za uprzejme udostępnienie kolekcji much zmutagenizowanych ENU, które zostały wykorzystane w genetycznym badaniu przesiewowym przedstawionym w tym artykule. Dziękujemy członkom laboratorium Ganetzky, dr Grace Boekhoff-Falk i Davidowi Wassarmanowi za pomocne dyskusje przez cały czas trwania tego projektu, Ling Ling Ho i Bobowi Kreberowi za pomoc techniczną, dr Aki Ikeda za korzystanie z jego urządzenia do mikrotomów na Uniwersytecie Wisconsin oraz dr Kim Lackey i Optical Analysis Facility na Uniwersytecie w Alabamie.

<ol><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+cycle%3A+the+neuron+itself+and+its+circumstances%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li>
<li>Aranda-Anzaldo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-mitotic+state+in+neurons+correlates+with+a+stable+nuclear+higher-order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).</li>
<li>Haelterman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+chemically+induced+mutations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).</li>
<li>Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+forward+with+genetics%3A+recent+technological+advances+and+forward+genetics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice.</a> The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing%3A+The+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+microRNA+miR-8+tunes+atrophin+levels+to+prevent+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila.</a> Cell. 131 (1), 136-145 (2007).</li>
<li>Helfrich, C., Engelmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian-Rhythm+of+the+Locomotor-Activity+in+Drosophila-Melanogaster+and+Its+Mutants+Sine+Oculis+and+Small+Optic+Lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes.</a> Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , Foundation for Statistical Computing. (2008).</li>
<li>Bokel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+screens+%3A+from+mutagenesis+to+screening+and+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Bioogyl%22%5BJournal%5D)">EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping.</a> Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Genome of Drosophila Melanogaster</a>. , (1992).</li>
<li>Cook, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+chromosomal+deletions+to+provide+extensive+coverage+and+subdivision+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome.</a> Genome Biology. 13 (3), R21(2012).</li>
<li>Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Mutation+in+Brain+Tumor+Causes+Both+Neural+Over-Proliferation+and+Neurodegeneration+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila.</a> Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).</li>
<li>Gloor, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+repressors+of+P+element+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Type I repressors of P element mobility.</a> Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).</li>
<li>Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+specifies+intermediate+progenitor+cell+identity+by+attenuating+beta-catenin%2FArmadillo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity.</a> Development. 141 (1), 51-62 (2014).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Nuclear+Interactions+Affecting+Lifespan+and+Neurodegeneration+in+a+Drosophila+Model+of+Leigh+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li>
<li>Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnr1+mutations+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+by+activating+the+innate+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).</li>
<li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+brain%3A+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Polo+ameliorates+APP-induced+Alzheimer%27s+disease-like+symptoms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 16816(2015).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagens%2C+transposons%2C+and+transgenes+to+interrogate+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 15-28 (2014).</li>
<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Genome+Sequencing+and+a+New+Bioinformatics+Platform+Allow+for+Rapid+Gene+Identification+in+D.+melanogaster+EMS+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens.</a> Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila.</a> Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zaawansowane badania genetyczne u Drosophila są skutecznym podejściem do identyfikacji genów zaangażowanych w różne procesy biologiczne, w tym neuroprotekcję zależną od wieku 5,23,24,25. Korzystając z tej strategii, udało nam się zidentyfikować bachora jako nowy gen neuroprotekcyjny17.
Jednym z kluczowych etapów tego protokoł...

Neurony są w większości postmitotyczne i niezdolne do podziału1,2. U większości zwierząt istnieją mechanizmy neuroprotekcyjne, które utrzymują te komórki przez całe życie organizmu, zwłaszcza w starszym wieku, kiedy neurony są najbardziej podatne na uszkodzenia. Geny leżące u podstaw tych mechanizmów można zidentyfikować u mutantów wykazujących neurodegenerację, fenotypowy wskaźnik utraty neuroprotekcji, przy użyciu protokołu genetycznego do przodu. Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem mutagenów chemicznych, takich jak metanosulfonian etylu (EMS) lub N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU), są szczególnie przydatne ze względu na losowe mutacje punktowe, które wywołują, co skutkuje z natury bezstronnym podejściem, które rzuciło światło na liczne funkcje genów w eukariotycznych organizmach modelowych3,4,5 (w przeciwieństwie do tego, mutageneza rentgenowska powoduje pęknięcia DNA i może powodować rearanżację, a nie mutacje punktowe6).
Pospolita muszka owocowa Drosophila melanogaster jest idealnym obiektem do tych badań ze względu na jej wysokiej jakości, dobrze opisaną sekwencję genomu, długą historię jako organizmu modelowego z wysoko rozwiniętymi narzędziami genetycznymi, a co najważniejsze, jej wspólną historię ewolucyjną z ludźmi7,8. Czynnikiem ograniczającym możliwość zastosowania tego protokołu jest wczesna śmiertelność spowodowana przez zmutowane geny, co uniemożliwiłoby testowanie w starszym wieku9. Jednak w przypadku mutacji nieletalnych, test wspinaczkowy, który wykorzystuje ujemną geotaksję, jest prostą, choć obszerną metodą ilościowego określania upośledzonych funkcji motorycznych10. Aby wykazywać wystarczającą reaktywność lokomotoryczną, muchy polegają na funkcjach neuronalnych, które określają kierunek, wyczuwają jego położenie i koordynują ruch. Niezdolność much do wystarczającego wspinania się w odpowiedzi na bodźce może zatem wskazywać na defekty neurologiczne11. Po zidentyfikowaniu konkretnego wadliwego fenotypu wspinaczkowego, dalsze badania z wykorzystaniem wtórnego badania przesiewowego, takie jak analiza histologiczna tkanki mózgowej, mogą być wykorzystane do identyfikacji neurodegeneracji u much z wadami wspinaczki. Późniejsze mapowanie genów może być następnie wykorzystane do ujawnienia regionu genomu na chromosomie przenoszącym wadliwy gen neuroprotekcyjny, który jest przedmiotem zainteresowania. Aby zawęzić obszar chromosomowy będący przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić mapowanie mejotyczne przy użyciu zmutowanych linii muchówek przenoszących dominujące geny markerowe o znanych lokalizacjach na chromosomie. Geny markerowe służą jako punkt odniesienia dla mutacji, ponieważ częstotliwość rekombinacji między dwoma loci zapewnia mierzalną odległość, którą można wykorzystać do mapowania przybliżonej lokalizacji genu. Wreszcie, skrzyżowanie zmutowanych linii z liniami niosącymi zrównoważone niedobory w mejotycznym zmapowanym regionie chromosomalnym będącym przedmiotem zainteresowania tworzy test komplementacji, w którym gen będący przedmiotem zainteresowania może zostać zweryfikowany, czy jego znany fenotyp ulega ekspresji5. Polimorficzne sekwencje nukleotydowe w zidentyfikowanym genie, które mogą prowadzić do zmiany sekwencji aminokwasów, można ocenić poprzez sekwencjonowanie genu i porównanie go z sekwencją genomu Drosophila. Późniejsza charakterystyka genu będącego przedmiotem zainteresowania może obejmować testowanie dodatkowych zmutowanych alleli, eksperymenty ratowania mutacji i badanie dodatkowych fenotypów.

<table><tbody><tr><td><mocny>Główny sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>dygestorium do histologii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon</td><td>Eclipe E100</td><td>Preferowany obiektyw do obrazowania to 20x</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat mikroskopowy</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test pchania i wspinania strong</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Fiolka Drosophila, wąska</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Taśma do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczenia VWR</td><td></td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa podkładka</td><td></td><td></td><td></td>pod mysz</tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Motic</td><td></td><td>Model SMZ-168</td></tr><tr><td>Stacja anestezjologiczna CO2 (Pistolet pneumatyczny, zawór stopowy, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td>Doesn' t iinclude CO2 Zbiornik</td></tr><tr><td>CO2 Szczotki z cienką końcówką</td><td>SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Inkubator</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Mapowanie genów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila linia używana do mapowania rekombinacji</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Genotyp: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Linia równoważąca Drosophila używana do mapowania rekombinacji</td></tr><tr><td>Zestaw niedoborów dla chromosomu 2L</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Analiza histologiczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, (100%)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Probówki do mikrowirówek premium: 1,5 ml</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Środek czyszczący Histochoice 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; Richard-Allan Nauka i handel; Mocowanie medium</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Unifrost Poly-L-Lysine, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Okulary nakrywkowe: Prostokąty</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Wymiary: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Identyfikowalny timer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz do slajdów</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>nr modelu 26025</td></tr><tr><td>Taca na suwaki i stojaki</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Stojak na 20 slajdów</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Ekstra-długie kleszcze ogólnego przeznaczenia</td><td>Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark&handel; Profesjonalista&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-calowe aplikatory Puritan Hardwood</td><td>Products Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tupperware lub szklane pojemniki na płyny</td><td></td><td></td> histologiczne <td>16 + 1 do bieżącej wody</td></tr><tr><td>Ostrza mikrotomu z powłoką o wysokim profilu</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; &nbsp; Okrągłe wiaderko na lód z pokrywką, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td><td>Lub inny pojemnik na wodę lodową i kasety</td></tr><tr><td>Kąpiel tkankowa</td><td>Precyzyjna firma naukowa</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analiza molekularna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Żel i system do czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq Polimeraza DNA</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Invitrogen i handel; &nbsp; SYBR&handel; Bezpieczny i handlowy; Barwienie żelem DNA&nbsp;</td><td>&nbsp; Invitrogen&handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&handel; Agaroza</td><td>&nbsp; Invitrogen&handel;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus drabinka DNA</td><td>&nbsp; Invitrogen&handel;</td><td></td><td></td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>ApE-A Plasmid Editor</td><td>Dostępne do bezpłatnego pobrania</td></tr><tr><td>Analiza statystyczna</pakiet</td> oprogramowania <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> strong>R<tr><td>Dalsza analiza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Centrum magazynowe Bloomington Drosophila</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Jest wiele do zrozumienia na temat powstawania i postępu chorób neurodegeneracyjnych, w tym genów odpowiedzialnych za ich powstanie. Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem mutagenów chemicznych są użyteczną strategią mapowania zmutowanych fenotypów do genów wśród Drosophila i innych organizmów modelowych, które dzielą konserwatywne szlaki komórkowe z ludźmi. Jeśli zmutowany gen będący przedmiotem zainteresowania nie jest śmiertelny we wczesnych stadiach rozwojowych much, można przeprowadzić test wspinaczkowy w celu wykrycia fenotypowych wskaźników zmniejszonego funkcjonowania mózgu, takich jak niskie tempo wspinania się. Następnie można przeprowadzić wtórną analizę histologiczną tkanki mózgowej w celu zweryfikowania neuroprotekcyjnej funkcji genu poprzez ocenę fenotypów neurodegeneracji. Strategie mapowania genów obejmują mapowanie mejotyczne i niedoborów, które opierają się na tych samych testach, a następnie sekwencjonowanie DNA w celu zidentyfikowania możliwych zmian nukleotydowych w genie będącym przedmiotem zainteresowania.

W niniejszym artykule przedstawiamy kroki podjęte w celu zidentyfikowania genu brain tumor (brat) jako odgrywającego rolę w utrzymaniu integralności neuronalnej (np. neuroprotekcji) u dorosłych much17; jest to metodologia, która może być wykorzystana do identyfikacji genów zaangażowanych w neuroprotekcję. Zastosowaliśmy podejście genetyki forward (strategia została przedstawiona na Rysunku 1A), aby przeszukać kolekcję...

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Głównym celem tego protokołu jest wykorzystanie mocy genetyki do przodu do identyfikacji genów, które po rozregulowaniu prowadzą do neurodegeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia bezstronne i proste podejście do identyfikacji genów neuroprotekcyjnych, które mogą być trudniejsze do wykonania w modelach ssaków. Technika ta może być wykorzystana do identyfikacji nowych genów zaangażowanych w proces neurodegeneracji, który jest związany z wieloma stanami chorobowymi, takimi jak choroba Alzheimera i Parkinsona.Oprócz identyfikacji genów neuroprotekcyjnych, podejście genetyczne może być wykorzystane do odkrycia genów zaangażowanych w inne procesy biologiczne, takie jak funkcje neuronów i przekaźnictwo. Na początek zbierz homozygotyczne muchy z linii należących do zmutagenizowanej kolekcji mutantów Drosophila zmapowanych do drugiego chromosomu. Wrzuć muchy w wieku od 10 do 12 dni do komory testowej bez znieczulenia, po jednej linii na raz i pozwól im dojść do siebie przez pięć minut.Pięciocentymetrowym znacznikiem linii skierowanym w dół na siłę postukaj trzykrotnie w komorę w podkładkę pod mysz umieszczoną na twardej powierzchni, tak aby wszystkie muchy rozpoczęły test od dołu. Obserwuj lokomocję much przez okres 10 sekund. Zapisz liczbę much, które w tym czasie osiągną lub przekroczą linię pięciu centymetrów, a także całkowitą liczbę przebadanych much.Odczekaj minutę przed rozpoczęciem drugiej próby. Powtórzyć co najmniej trzy powtórzenia próbne na linię. Po znieczuleniu much na podkładce z dwutlenkiem węgla, odetnij głowy much ostrzem chirurgicznym i za pomocą pędzla delikatnie umieść je w jednym mililitrze utrwalacza Carnoya w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej.Następnie przechowuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia upewnij się, że główki są zatopione w roztworze utrwalającym. Pod wyciągiem użyj pipety P1000, aby zastąpić roztwór utrwalający jednym mililitrem 70% etanolu i utrzymuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do przyszłej analizy.Za pomocą pipety Pasteura przenieś stałe głowice do kaset do mikrobiopsji i zamknij kasety. Wyślij kasety do zakładu histologicznego w celu przetworzenia lub umieść je w automatycznej maszynie do przetwarzania tkanek, jeśli jest dostępna na miejscu. Uruchom program, aby odwodnić, oczyścić i nacieknąć głowy parafiną.Następnie przenieś kasety do stacji zatapiania parafiny z parafiną podgrzaną do 60 stopni Celsjusza i umieść na ogrzewanej stacji formy z metalową podstawą, które pasują do kaset. Użyj cienkich kleszczyków, aby ustawić głowy tak, aby były skierowane do góry w formie podstawowej. Właściwa orientacja głowy ma kluczowe znaczenie dla analizy histologicznej.Po utwardzeniu przytnij każdy blok parafiny, aby zminimalizować powierzchnię, która zostanie przecięta. Wytnij pięć odcinków mikrometrycznych każdego bloku na mikrotomie. Następnie umieść pokrojone wstęgi parafinowe w podgrzewanej łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni Celsjusza na maksymalnie pięć minut.Zanurz szkiełko pokryte polilizyną w podgrzewanej łaźni wodnej i za pomocą drewnianego aplikatora umieść pokrojone wstążki na szkiełku. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia użyj podgrzewacza do szkiełków, aby podgrzać szkiełka przez 15 minut w temperaturze 63 stopni Celsjusza.Pod wyciągiem umieść szkiełka na stojaku do barwienia szkiełek i umieść stojak w HistoChoice na pięć minut dwa razy, a następnie wykonaj kilka zabiegów w kąpieli etanolowej i destylowanej zgodnie z rękopisem. Przenieś stojak do pojemnika wypełnionego hematoksyliną Harris na dwie do pięciu minut, aby zabarwić. Następnie wyjmij stojak z roztworu Hematoxyliny i umieść go pod bieżącą wodą z kranu na 10 minut przed kolejnymi etapami barwienia.Po barwieniu za pomocą kleszczy wyjmij szkiełka z roztworu HistoChoice lub ksylenu. Nałóż cienką warstwę trwałego podłoża mocującego na próbkę i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.Po utwardzeniu podłoża mocującego umieść szkiełko pod mikroskopem świetlnym, aby uzyskać obrazy reprezentatywnych odcinków mózgu w przybliżeniu śródmózgowia. Najpierw przygotuj fiolkę zawierającą pokarm do generowania heterozygotycznych samic much. Po znieczuleniu dwutlenkiem węgla użyj pędzla, aby przenieść pięć samców z linii mutantów i 10 dziewiczych samic z zablokowanego płata mostkowo-opłucnowego i przypiąć przez linię Curly O do fiolki, aby wykonać krzyż.Umieścić fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po 10 do 12 dniach należy zebrać co najmniej 15 dziewiczych żeńskich samic będących nosicielami zmutowanego chromosomu i chromosomu markerowego. Skrzyżuj je z pięcioma samcami ze zrównoważonej linii, która niesie inny widoczny dominujący marker, Curly O nad tarczką lub równoważnym.Po 10 do 12 dniach zbierz heterozygotyczne męskie potomstwo z tarczką lub kędzierzawą O i potencjalnie zrekombinowanym chromosomem z krzyżówki. Indywidualnie kojarz je z dziewiczymi samicami ze stada noszącego zmutowany chromosom. Dziesięć do 12 dni później zbierz potomstwo z ostatniej krzyżówki do nowego pokarmu zawierającego fiolki i leżakuj muchy w temperaturze 29 stopni Celsjusza do 10 do 14 dni.Wykonaj histologię na głowach much i powtórz dla potomstwa każdej pojedynczej krzyżówki. Mając te informacje, wykonaj mapowanie niedoborów w zwężonym regionie chromosomu, aby doprecyzować lokalizację mutacji recesywnej. Każda linia niedoboru ma delecję innego regionu chromosomów, co pozwala na wykorzystanie ich do badania komplementarności.Następnie należy skrzyżować linie z zestawu niedoboru Drosophila dla drugiego chromosomu i poszukać braku uzupełnienia fenotypu zainteresowania. Aby uzyskać odniesienie do analizy sekwencji DNA, należy pobrać plik w formacie FASTA zawierający genomową sekwencję konsensusu genu BRAT z FlyBase lub użyć pliku zawierającego wyniki sekwencji BRAT genetycznej kontroli tła, na przykład pierwotnie zmutagenizowanej linii Drosophila. Otwórz pliki sekwencjonowania w edytorze plazmidu.Przejdź do opcji Edycja i kliknij przycisk Wyrównaj sekwencje. Za pomocą myszy komputera wybierz wszystkie sekwencje do porównania. W menu rozwijanym wskaż sekwencję odwołań dla tego wyrównania.Sprawdź sekwencjonowany region pod kątem zmian nukleotydów w porównaniu z sekwencją referencyjną. W razie potrzeby zapisz wyrównanie na komputerze w formacie RTF, klikając Tekst, a następnie Zapisz. Przeprowadź eksperyment ratunkowy, zbierając potomstwo F1 z każdej krzyżówki.Ostrożnie wybieraj oznaczone balansery. Starzej muszki na pożywce pokarmowej Drosophila w temperaturze 29 stopni Celsjusza i przeprowadź analizę histologiczną na mózgach w poszukiwaniu neurodegeneracji, tak jak poprzednio. Aby przeprowadzić zależną od wieku analizę neurodegeneracji u 867 mutantów, należy postarzyć muszki do pięciu, 15 i 25 dni, a następnie przeprowadzić analizę histologiczną.Protokół ten przedstawia postępowe genetyczne podejście do badań przesiewowych poprzez zbiór chemicznie zmutagenizowanych much przy użyciu testu wspinaczkowego. Spośród 235 linii homozygotycznych, około 37% badanych linii wykazywało wskaźnik zdawalności wspinaczki poniżej 50% podczas testowania w wieku od 10 do 12 dni. Późniejsze badanie histologiczne na 51 liniach wykazujących najniższy wskaźnik zdawalności wspinaczki wykazało, że 29 z tych linii wykazywało widoczny wygląd w mózgu neuropil, od łagodnych do ciężkich, wskazujących na neurodegenerację.Fenotyp neurodegeneracji u 867 much jest recesywny, ponieważ mózgi heterozygotycznych much 867, które zostały skrzyżowane ze szczepem typu dzikiego, były porównywalne z mózgami osób z grupy kontrolnej. Linia niedoboru Df24116 nie uzupełnia zmutowanego fenotypu 867 opartego na teście wspinaczkowym. Weryfikacja histologiczna pokazuje, że linia niedoboru Df24116 nie uzupełnia fenotypu neurodegeneracji 867, podczas gdy Df9296 tak.Badanie fenotypu mózgu 867 mutantów skrzyżowanych z dodatkowymi liniami niedoboru potwierdziło, że mutacja jest zawarta w regionie genomu, który zawiera gen BRAT. Ważne jest, aby pamiętać podczas tej procedury, aby pracować tak rygorystycznie i precyzyjnie, jak to tylko możliwe, ponieważ protokół ten łączy w sobie kilka kroków, które, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo, mogą wpłynąć na identyfikację mutantów z neurodegeneracją w genach kandydujących. W zależności od zidentyfikowanych genów, późniejsza analiza może obejmować testowanie dodatkowych zalążków genu będącego przedmiotem zainteresowania lub interakcji z genami, które odgrywają rolę w znanych szlakach neurodegeneracji.Podczas zabiegu histologicznego należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z roztworem utrwalającym Carnoya, ponieważ zawiera on chloroform. Nosić rękawice i używać z odpowiednią wentylacją, najlepiej pod wyciągiem. Podobnie wykonaj wszystkie barwienia histologiczne pod wyciągiem.

in-vivo-forward-genetic-screen-to-identify-novel-neuroprotective

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano szybki test in vivo służący do badania związków neuromodulacyjnych z wykorzystaniem systemu włókien olbrzymich (Giant Fiber System, GFS) u Drosophila melanogaster. Nanowstrzyknięcia do głowy zwierzęcia wraz z rejestracją elektrofizjologiczną GFS mogą ujawnić bioaktywność związków w obrębie neuronów lub mięśni.

Połączony test nanoiniekcji i elektrofizjologii do przesiewowej oceny bioaktywności związków z wykorzystaniem systemu włókien olbrzymich Drosophila melanogaster

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły zadawania penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu (PTBI) dorosłym Drosophila i badania wynikającej z tego neurogenezy.

Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Poznaj metodę genetyki do przodu do identyfikacji genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster. Protokół obejmuje test wspinaczkowy, analizę histologiczną i sekwencjonowanie DNA.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów