Name: Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj protokół przygotowania swobodnie unoszącej się kultury plastrów z ludzkiego mózgu dorosłego. Ta uproszczona metoda umożliwia badania biochemiczne i immunohistochemiczne mechanizmów neurodegeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez FAPESP (Grant 25681-3/2017 dla AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM dla A.F. i Pre-Doctoral fellowship dla N.D.M.) oraz FAEPA. G.M.A. posiada stypendium magisterskie z FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. posiada stypendium badawcze CNPq. Dziękujemy pacjentom i ich rodzinom za oddanie wyciętych tkanek do tego badania. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie rezydentów, pielęgniarek, techników i zespołu CIREP ze Szpitala Klinicznego w Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, którzy pomogli na różnych etapach tego procesu.

Żywe tkanki mózgu dorosłych zostały pobrane od pacjentów poddawanych neurochirurgii resekcyjnej w leczeniu farmakoopornej padaczki skroniowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ze Szpitala Klinicznego w Szkole Medycznej Ribeirão Preto (17578/2015), a pacjenci (lub ich osoba prawna odpowiedzialna) zgodzili się i podpisali warunki świadomej zgody. Pobranie tkanki zostało wykonane przez zespół neurochirurgów w Centrum Chirurgii Padaczki (CIREP - Clinics Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brazylia).
1. Sterylizacja materiałów
UWAGA: Wszystkie materiały i roztwory muszą być wysterylizowane przed użyciem.
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i wibratomiowy materiał do krojenia (uchwyt noża, krążek próbki, taca buforowa) w suchym piecu sterylizacyjnym przez 4 godziny w temperaturze 180 °C.</li>
	<li>Sterylizuj materiały lub urządzenia wrażliwe na temperaturę za pomocą promieniowania UV lub gamma.</li>
	<li>Sterylizuj media i roztwory przez autoklawowanie lub filtrację przez membrany porowe 0,22 μm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 15-20 ml roztworu transportowego: 50% v/v Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) pH 7,4, 50% v/v podłoże podstawowe do utrzymania neuronów mózgowych po urodzeniu i u dorosłych (tabela materiałów), uzupełniony 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (Hepes), 3 mg/ml glukozy i 33 μg/ml gentamycyny. 
	UWAGA: Roztwór transportowy musi być schłodzony i natleniony (bulgoczący gazem karbogenowym) przez co najmniej 20 minut przed pobraniem próbki.</li>
	<li>Przygotuj 300 ml roztworu do krojenia (HBSS uzupełniony 10 mM HEPES i 3 mg/ml glukozy) i schłodzić go w zamrażarce do punktu początkowego tworzenia się kryształów.</li>
	<li>Przygotuj 20 ml pożywki hodowlanej: podstawowej pożywki do utrzymania neuronów mózgowych po urodzeniu i dorosłych (tabela materiałów) uzupełnionej 1% pochodną L-glutaminy (tabela materiałów), 2% suplementem do hodowli neuronalnej (tabela materiałów), 1% penicyliną/streptomycyną i 0,25 μg/ml amfoterycyny B.</li>
</ol>
3. Ustawianie urządzenia do krojenia
UWAGA: Ten protokół jest idealnie wykonywany z pomocą kolegi ze względu na logistykę pobierania próbek na sali operacyjnej.
<ol>
	<li>W wiadrze z lodem z dodatkiem soli pozostaw roztwór do krojenia pod bulgoczącą mieszanką karbogeniczną (95% O2, 5% CO2 ) przez co najmniej 20 minut przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj blok 3% agarozy (około 2 cm x 2 cm x 2 cm) i przyklej go do krążka próbki wibratomu, aby stworzyć dodatkowe mechaniczne wsparcie dla próbki tkanki podczas krojenia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Ustaw wibratomium do krojenia: grubość przekroju 200 μm, częstotliwość drgań 100 Hz i prędkość krojenia w zakresie 0,5-1,0 mm/s.</li>
	<li>Zablokuj tackę buforową wibratomu na podstawie wibratomu i dodaj lód, aby utrzymać ją w lodówce przed otrzymaniem roztworu do krojenia i próbki oraz przez całą procedurę krojenia.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek
UWAGA: W tym protokole, ludzka tkanka kory nowej została pobrana na sali operacyjnej i przetransportowana do laboratorium.
UWAGA: Podczas pracy z próbkami ludzkimi, postępuj zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa ustalonymi przez instytucję.
<ol>
	<li>Ustaw aparaturę transportową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), która składa się z: przenośnej butli gazowej z mieszaniną karbogenu podłączonej do zaworu ciśnienia/strumienia, który kontroluje wydatek gazu, podłączonego do silikonowej rurki łączącej wylot gazu ze zbiornikiem transportowym; naczynia transportowego, zwykle stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z perforowaną pokrywą do wprowadzania gazu, zawierające roztwór transportowy; oraz lód do chłodzenia próbki podczas transportu.</li>
	<li>Zbierz i przetransportuj próbkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) natychmiast do laboratorium. Zanurzyć próbkę w zimnym roztworze transportowym (stale bąbelkowanym mieszaniną karbogenu).</li>
</ol>
5. Krojenie
<ol>
	<li>Przenieść próbkę na szalkę Petriego (100 mm x 20 mm) zawierającą roztwór do krojenia i za pomocą precyzyjnych narzędzi chirurgicznych ostrożnie usunąć jak najwięcej pozostałych opon mózgowych w próbce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Wybierz najlepszą orientację próbki do produkcji plastrów o szczególnych cechach projektu eksperymentalnego, a za pomocą ostrza skalpela nr 24 przytnij płaską powierzchnię, która będzie podstawą przyklejoną do krążka próbki.</li>
	<li>Za pomocą jednorazowej plastikowej łyżki i delikatnych pędzli należy zebrać fragment z szalki Petriego i osuszyć nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej (wysuszyć kapilarno i unikać dotykania fragmentu tkanki papierem).</li>
	<li>Za pomocą superglue przymocuj tkankę do krążka próbki wibratomu, aż mocno przylgnie do dysku i zetknie się z blokiem agarozy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Umieść krążek próbki wibratomu (z prawidłowo przymocowaną tkanką) na tacce buforowej wibratomu wypełnionej roztworem do krojenia, który musi bulgotać podczas całego procesu.</li>
	<li>Zablokuj uchwyt noża na miejscu, gdy żyletka jest mocno zamocowana.</li>
	<li>Roztwór do krojenia musi pokryć zarówno próbkę, jak i ostrze, dopiero wtedy rozpocznij krojenie (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1F).</li>
	<li>Pokrój próbkę w plastry o grubości 200 μm. 
	UWAGA: Chociaż niektóre wibratory tną próbki automatycznie, dokładna obserwacja i drobne korekty prędkości krojenia podczas tego procesu mogą pomóc w uzyskaniu lepszych plastrów. Odrzuć początkowe nieregularne plasterki.</li>
	<li>Przenieś plastry z tacki buforowej na szalkę Petriego z roztworem do krojenia i przytnij luźne brzegi i nadmiar białej masy do proporcji około 70% kory mózgowej/30% masy białej.</li>
</ol>
6. Kultura
UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze z przepływem laminarnym w sterylnym środowisku.
<ol>
	<li>Dodać 600 μl pożywki do hodowli na basenik (na płytce 24-dołkowej) i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze 36 °C i 5% CO2 przed posiewem plastrów.</li>
	<li>Ułóż jeden plasterek na dołek za pomocą pędzla (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1G).</li>
	<li>Jeśli na płytce znajdują się jakieś niewykorzystane studzienki, napełnij je 400 μl sterylnej wody.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 36 °C, 5% CO2, 
	UWAGA: Pierwsza wymiana podłoża musi być wykonana w ciągu 8-16 godzin po poszyciu, w zależności od wielkości plastra.</li>
	<li>Uzupełnić 10 ml wcześniej przygotowanej pożywki o 50 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF). 
	UWAGA: W ciągu pierwszych 8-16 godzin plastry inkubuje się w 600 μl podłoża, aby uniknąć niedoboru składników odżywczych i zakwaszenia, ponieważ zużycie pożywki w tej fazie jest przyspieszone. Od następnego kroku objętość pożywki na studzienkę dostosowuje się do 400 μl.</li>
	<li>Usunąć 333 μl kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i dodać 133 μl świeżej pożywki uzupełnionej BDNF.</li>
	<li>Powtarzaj proces wymiany pożywki co 24 godziny, zastępując jedną trzecią kondycjonowanej pożywki świeżą pożywką uzupełnioną BDNF.</li>
</ol>
7. Ocena zdrowia, morfologii i funkcji w hodowanych wycinkach
UWAGA: Aby wywołać śmierć komórki, dla celów ilustracji w reprezentatywnych wynikach, niektóre wycinki poddano 24-godzinnej obróbce induktorem stresu oksydacyjnego H2O2. Kroki 7.1.2 i 7.1.3 opisują zastosowanieH2O2do wywołania śmierci komórki.
<ol>
	<li>Żywotność komórki 
	UWAGA: Prostą, nieskomplikowaną metodą oceny neurotoksyczności/neuroprotekcji w kulturach prowokowanych plastrów jest test 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy (MTT)36, który mierzy procent aktywnych metabolicznie komórek w normalnych warunkach w porównaniu z próbkami poddanymi działaniu substancji.
	<ol>
		<li>W komorze z przepływem laminarnym zastąp jedną trzecią pożywki świeżą.</li>
		<li>Z 30% roztworu podstawowego H2O2 dodać objętośćH2O2na studzienkę, aby osiągnąć zamierzone stężenie końcowe (30 mM lub 300 mM). 
		UWAGA: H2O2 dodawano po codziennej zmianie podłoża, aby zagwarantować prawidłowe zaopatrzenie w świeże składniki odżywcze przed wyzwaniem.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 36 °C, 5% CO2, 
		UWAGA: Po podaniu H2O2 (lub innego bodźca toksycznego będącego przedmiotem zainteresowania), poniższe kroki opisują oznaczanie żywotności komórek za pomocą testu MTT.</li>
		<li>Dodać 40 μl roztworu MTT do końcowego stężenia 0,5 mg/ml do każdego dołka w płytce.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 36 °C, 5% CO2 przez 3 godziny.</li>
		<li>Umyj plastry solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i przenieś do mikroprobówki.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć pozostały roztwór, pipetując.</li>
		<li>Zważyć mikroprobówki zawierające plasterki, aby określić masę każdej próbki (jest to kluczowe dla normalizacji uzyskanych odczytów absorbancji). 
		UWAGA: W razie potrzeby próbki można na tym etapie zamrozić (-20 °C) w celu późniejszego przetworzenia.</li>
		<li>Homogenizować plastry w 200 μl izopropanolu/HCl za pomocą zmotoryzowanego tłuczka.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty przy 2600 x g.</li>
		<li>Zebrać supernatant i zmierzyć absorbancję przy 540 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depolaryzacja neuronalna wywołana przez KCl 
	UWAGA: Fosforylacja kaskadowego białka kaskadowego sygnalizacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), a następnie western blotting, może być wykorzystana do ilościowego określenia odpowiedzi neuronalnej na depolaryzację wywołaną przez KCl37 .
	<ol>
		<li>W komorze przepływowej zastąpić pożywkę hodowlaną 300 μl HBSS uprzednio zrównoważoną do 36 °C.</li>
		<li>Zastąp HBSS 300 μl świeżego HBSS uprzednio zrównoważonego do 36 °C.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 36 °C, 5% CO2 przez 15 minut.</li>
		<li>Zastąp HBSS świeżym HBSS lub 80 mM roztworem depolaryzującym KCl (oba w temperaturze 36 °C) i inkubuj w temperaturze 36 °C, 5% CO2 przez 15 minut.</li>
		<li>Przenieś plastry z płytki do mikroprobówek. Na tym etapie plastry można przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej obróbki.</li>
		<li>Przygotować ekstrakty tkankowe w 150 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny; 0,1% dodecylosiarczan sodu; pH 7,5). Odwirować ekstrakty w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16000 x g, zebrać supernatant i oznaczyć całkowite stężenie białka metodą Bradforda.</li>
		<li>Załaduj 30 μg białka całkowitego na elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z 12% dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).</li>
		<li>Po elektroforezie przenieść zawartość żelu na membranę nitrocelulozową.</li>
		<li>Po zablokowaniu błony 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w TBS plus 0,1% Tween, inkubować z mysim anty-pERK (1:1 000) przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Po umyciu inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z króliczym anty-ERK1/2 (1:1 000).</li>
		<li>Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w RT przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odsłonięcie z preferowanym podłożem HRP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena morfologiczna 
	UWAGA: Oprócz oceny przeżycia komórek i funkcjonalnej ważna jest analiza morfologii tkanek. Należy pamiętać, że resekcja wyhodowanego wycinka jest ważnym krokiem do wyprodukowania jak największej ilości wysokiej jakości materiału do analizy morfologicznej.
	<ol>
		<li>Mocowanie, krioochrona i resekcja plastrów
		<ol>
			<li>Przenieść wycinki z dołków z pożywką hodowlaną na nową 24-dołkową płytkę zawierającą PBS.</li>
			<li>Usuń PBS i dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Ważne jest, aby plastry były płaskie przed dodaniem PFA. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Ostrożnie usuń roztwór PFA i dodaj 1 ml 30% roztworu sacharozy. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Ustawić mikrotom zamrażania na -40 °C.</li>
			<li>Przygotuj bazę sacharozy na etapie mikrotomu, w którym należy umieścić plastry (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Pozwól mu całkowicie zamrozić i ostrożnie pokrój część zamrożonej sacharozy, aby uzyskać płaską powierzchnię, na której zostanie umieszczony plasterek.</li>
			<li>Umieść każdy plasterek na rozciągniętej folii z tworzywa sztucznego i użyj pędzla, aby spłaszczyć chusteczkę.</li>
			<li>Przenieś rozciągnięty plasterek na zamrożoną bazę sacharozy jednym ruchem. 
			UWAGA: Nie ma możliwości przesunięcia plastra po jego przekroczeniu nad zamrożoną bazą sacharozy. Wykonaj ten krok przenoszenia ostrożnie.</li>
			<li>Odstaw plasterek na 5-10 minut, aby zapewnić prawidłowe zamrożenie.</li>
			<li>Pokrój plasterek na kawałki o grubości 30 μm.</li>
			<li>Przenieść skrawki 30 μm na szalkę Petriego zawierającą PBS.</li>
			<li>Przejdź do protokołu histologicznego bardziej odpowiedniego do projektu eksperymentalnego. 
			UWAGA: Skrawki 30 μm mogą być łatwo wykorzystane do swobodnej immunohistochemii, zamontowane na szkiełkach mikroskopowych w celu dalszej histologii lub przechowywane w roztworze niezamarzającym w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Immunohistochemia 
		UWAGA: Standardowe protokoły immunohistochemii i immunofluorescencji różnią się w zależności od laboratorium. Aby uzyskać szczegółową wersję używanego tutaj protokołu, zapoznaj się z Horta et al.38. Pierwszorzędowe przeciwciała używane do barwienia immunologicznego przedstawione w <silna klasa="xfig">Rycina 2 obejmują jądra neuronalne (NeuN), zdrowy marker dojrzałego neuronu, kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), marker astorcytów, zjonizowany łącznik wiążący wapń (Iba-1) i marker mikrogleju.
		<ol>
			<li>Plastry inkubować w roztworze blokującym (np. 2% normalnej surowicy osła w PBS) przez 40 minut.</li>
			<li>Inkubować przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym w łagodnym mieszaniu w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Po przemyciu PBS inkubować przez 120 minut z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym pod łagodnym wzburzeniem w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Po przemyciu PBS inkubować w temperaturze pokojowej przez 120 minut ze sprzężonym peroksydazą awidyny (tabela materiałów).</li>
			<li>Odsłonięcie z DAB + 0,04% niklu amonowego.</li>
			<li>Zamontuj zabarwione skrawki na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Odwodnić w etanolu, przepłukać w ksylenie, wykończyć podłożem montażowym (tabela materiałów), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obrazem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół produkcji swobodnie pływających, krótkoterminowych kultur warstwowych jest alternatywną metodą hodowli wycinków kory nowej dorosłego człowieka. Taki protokół dla kultur warstwowych może być podatny na badania nad (ale nie tylko) optogenetyką 1,44,45, elektrofizjologią 2,3,4,5, plastycznością krótkotrwałą <sup cl...

Wykorzystanie próbek ludzkich w badaniach jest zdecydowanie świetną opcją do badania patologii ludzkiego mózgu, a nowoczesne techniki otworzyły nowe sposoby na solidne i etyczne eksperymenty z wykorzystaniem tkanek pochodzących od pacjenta. Metody takie jak hodowle organotypowe/warstwowe przygotowane z dorosłego ludzkiego mózgu są coraz częściej stosowane w paradygmatach takich jak optogenetyka1, electrophysiology2,3,4,5, plasticity6,7,8,9, neurotoksyczność/neuroprotekcja10,11,12,13, terapia komórkowa14, badanie przesiewowe leków15,16,17, genetyka i edycja genów12,18,19,20, między innymi, jako strategia lepszego zrozumienia chorób neurologicznych w wieku dorosłym.
Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw patologii ludzkiego mózgu zależy od strategii eksperymentalnych, które wymagają dużej liczby badanych. I odwrotnie, w przypadku kultur warstwowych, chociaż dostęp do próbek ludzkich jest nadal utrudniony, możliwość wygenerowania do 50 wycinków z jednej próbki korowej częściowo omija wymóg rekrutacji wielu ochotników poprzez zwiększenie liczby powtórzeń i wykonanych testów na pobraną tkankę21.
Opisano kilka protokołów dla kultur organotypowych/warstwowych mózgu, począwszy od klasycznych oculo drafts22,23 do rury rolkowej24,25,26, interfejs membran półprzepuszczalnych27,28,29,30, oraz swobodnie pływające slices31,32. W zależności od specyfiki projektu eksperymentalnego, każda technika ma swoje zalety i wady. Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury wycinków z mózgów dorosłych ludzi jest w niektórych przypadkach korzystniejsze niż metoda stosowana przez Stoppini et al.27, jeśli weźmie się pod uwagę fakt, że chociaż długoterminowe przeżycie komórek in vitro jest zwykle głównym problemem przy ocenie metody hodowli, w wielu eksperymentach potrzebne są tylko krótkie okresy czasu w hodowli12, 31,32,33,34,35. W tych warunkach zastosowanie kultur swobodnie pływających ma tę zaletę, że jest prostsze i bardziej opłacalne, a także dokładniej przypomina pierwotny stan tkanki ludzkiej niż plastry trzymane w kulturze przez 2-3 tygodnie.
Pomimo potencjału kultur plasterkowych dla neuronauki, badania wykorzystujące dorosłą tkankę nerwową do przygotowania takich kultur są nadal rzadkie, szczególnie wśród ludzi. W artykule opisano protokół wykorzystania tkanki mózgowej pobranej od żywych dawców ludzkich poddanych resekcyjnej operacji mózgu w celu przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych. Procedury utrzymywania i przeprowadzania testów biochemicznych i biologii komórki z wykorzystaniem tych kultur są szczegółowe. Protokół ten okazał się przydatny do analizy żywotności i funkcji neuronów w badaniach nad mechanizmami neuropatologii związanych z dorosłością.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>1096341000</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid/Bis-Akrylamid, 30% roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3449&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ERK 2 (królik)</td> <td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-154</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 w BSA 2,5%</td></tr> <tr><td>Przeciwciało anty-pERK (mysz)</td> <td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-7383</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 w BSA 2,5%</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3014</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 1x Odczynnik barwnikowy</td><td>BioRad</td><td>500-0205</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Stosowany w buforze RIPA</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważone sole Hanka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1387-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2)</td><td>Vetec</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG, cały Ab sprzężony z HRP (anty-mysz)</td> <td>GE</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1064041000</td><td>Stosowany w buforze RIPA</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku (Molico)</td><td>Nestl&eacute;</td><td></td><td>Służy do blokowania</td></tr><tr><td>błony PBS Bufor pH 7,2</td><td>Laborclin</td><td>590338</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Prime Western Blotting Detection Odczynnik</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>IgG królika, cały Ab (anty-królik) sprzężony z HRP</td> <td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750</td><td>Stosowany w buforze RIPA</td></tr><tr><td>TEMEM GE</td><td></td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromek tetrazolowy tiazolylu Blue (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma T-1378</td><td></td><td>Używany w buforze RIPA</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Używany w buforze RIPA</td></tr><tr><td>Ultrapure Water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Sterylna woda, pochodząca z systemu oczyszczania wody MiliQ</td></tr> <tr><td>Sprzęt i materiał</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Corning</td><td>CL S3526</td><td>Płaskie dno z pokrywką</td></tr><tr><td>Amersham Potran Premium (membrana nitrocelulozowa)&nbsp;</td><td>GE</td><td>29047575</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen Mieszanina</td><td>White Martins</td><td></td><td>95% O2, 5% CO2 CO2</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>CO-24</td><td>Inkubacja plastrów 5% CO2, 36&ordm; C</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne Mikroprobówki</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner</td><td>001608</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany tłuczek</td><td>Kimble Chase</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa łyżka</td><td></td><td></td><td>Rozmiar łyżki deserowej</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Bic</td><td></td><td>Chrome Platinum, używana do krojenia za pomocą wibratomu</td></tr><tr><td>Ostrze</td> <td>skalpelaBecton Dickinson (BD)</td><td>Numer 24</td><td>Służy do krojenia tkanki; zalecany ten sam rozmiar lub mniejszy</td></tr><tr><td>Superglue (Loctite Super Bonder)</td><td>Henkel</td><td></td><td>Skład: Etilcianoacrilato; Kwas 2-propenowy; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-krezol; homopolimer</td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica</td><td>14047235612 - VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa materiału/sprzętu do immunohistochemii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-NeuN (mysz)</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>MAB377</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 w buforze fosforanowym</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFAP (mysz)</td><td>Merck</td><td>MAB360</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 w buforze fosforanowym</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Iba1 (królik)</td><td>Abcam</td><td>EPR16588 - ab178846</td><td>Rozcieńczenie 1:2,000 w buforze fosforanowym</td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Vector</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-9015</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>Syntezator</td><td>żelatynowy</td><td>00G1002.02.AE</td><td>Używany do powlekania szkiełek</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td>Wyposażony w Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), ustawiony na -40&ordm; C</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>IgG królika, całe Ab (anty-królik) sprzężone z HRP</td> Szkiełka <td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>(Star Frost)</td><td>Knittel Glaser</td><td></td><td>Szkiełka pokryte żelatyną</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Vetec</td><td>60REAVET017050</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC HRP Kit (peroksydaza, standardowa)</td><td>Vector</td><td>PK-4000, zestaw standardowy</td><td></td></tr><tr><td>syntezator</td><td>ksylenowy</td><td>01X1001.01.BJ</td><td></td></tr></tbody></table>

krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kultury organotypowe, czyli warstwowe, były szeroko stosowane do modelowania aspektów funkcjonowania ośrodkowego układu nerwowego in vitro. Pomimo potencjału kultur warstwowych w neurobiologii, badania wykorzystujące dorosłą tkankę nerwową do przygotowania takich kultur są nadal rzadkie, szczególnie te pochodzące od ludzi. Wykorzystanie tkanek dorosłych ludzi do przygotowania kultur plastrów jest szczególnie atrakcyjne dla lepszego zrozumienia ludzkich neuropatologii, ponieważ posiadają one unikalne właściwości typowe dla dojrzałego ludzkiego mózgu, których brakuje w wycinkach wytwarzanych z tkanki nerwowej gryzoni (zwykle noworodków). Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać tkankę mózgową pobraną od żywych dawców ludzkich poddanych resekcyjnej operacji mózgu w celu przygotowania krótkoterminowych, swobodnie unoszących się kultur warstwowych. Przedstawiono również procedury utrzymania i wykonywania testów biochemicznych i biologicznych z wykorzystaniem tych kultur. Reprezentatywne wyniki pokazują, że typowa ludzka laminacja korowa jest zachowana w postaci plastrów po 4 dniach in vitro (DIV4), przy oczekiwanej obecności głównych typów komórek nerwowych. Co więcej, plastry w DIV4 ulegają silnej śmierci komórkowej pod wpływem bodźca toksycznego (H2O2), co wskazuje na potencjał tego modelu do służenia jako platforma w testach śmierci komórki. Metoda ta, prostsza i tańsza alternatywa dla powszechnie stosowanego protokołu wykorzystującego wkładki membranowe, jest zalecana głównie do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem. Wreszcie, chociaż protokół poświęcony jest wykorzystaniu tkanki korowej pobranej od pacjentów poddanych leczeniu chirurgicznemu farmoopornej padaczki płata skroniowego, argumentuje się, że tkanka pobrana z innych regionów/stanów mózgu powinna być również brana pod uwagę jako źródło do produkcji podobnych swobodnie pływających kultur warstwowych.

Kluczowym aspektem oceny jakości i stanu zdrowia hodowanych przekrojów jest obecność i typowa morfologia oczekiwanych typów komórek nerwowych: neuronów oraz komórek glejowych. Typową architekturę laminacji kory ludzkiej zaobserwowano w przekroju w dniu DIV4, co wykazało neuronalne znakowanie immunologiczne (Ryc. 2D). Ponadto stwierdzono oczekiwaną obecność mikrogleju i astrogleju (Ryc. 2B,C). Wyniki te dowodzą, że architektura t...

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Przedstawiamy protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z tkanki mózgowej pobranej od żywych dawców ludzkich poddanych resekcyjnej operacji mózgu. Kultura ta jest podatna na wykonywanie testów biochemicznych i biologii komórki lub immunohistochemii. Oczekuje się, że przyczyni się to do wyjaśnienia mechanizmu leżącego u podstaw neurodegeneracji w powiązanych chorobach mózgu.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prostsza i tańsza alternatywa dla klasycznego protokołu hodowli plastrów przy użyciu wkładek membranowych. Chociaż ogólny protokół nie jest złożony, niektóre kroki, takie jak usunięcie opon mózgowych, przyklejenie tkanki do krążka próbki wibratomu i resekcja w celu immunohistochemii, są najlepiej zrozumiałe, gdy zostaną zademonstrowane wizualnie. W zademonstrowaniu procedury pomogą Niele Mendes i Glaucia Almedia, które są studentkami, oraz Giovanna Nogueira, inna studentka.Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj sól do wiadra z lodem. Przenieś roztwór do krojenia do tego wiadra i pozostaw go pod bulgoczącą mieszanką karbogenu przez co najmniej 20 minut przed użyciem. Następnie przygotuj blok 3% agarozy o wymiarach około dwóch centymetrów na dwa centym

short-term-free-floating-slice-cultures-from-the-adult-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Ten film demonstruje technikę przygotowywania swobodnie pływających kultur warstwowych z mózgu dorosłego człowieka. Cienkie plasterki są generowane z części mózgu za pomocą wibratomu. Wycinki te są następnie zawieszane w pożywce hodowlanej uzupełnionej czynnikami wzrostu w celu utrzymania żywotności tkanek.

Przygotowanie swobodnie unoszących się kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

W tym artykule pokazujemy metodę przygotowania ostrych wycinków mózgu w temperaturze fizjologicznej, przy użyciu konwencjonalnego roztworu fizjologicznego bez specjalnych modyfikacji krojenia (takich jak dodanie sacharozy) i bez wewnątrzsercowej perfuzji zwierzęcia przed przygotowaniem plastrów.

Slice It Hot: Ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Ten protokół opisuje długoterminowe hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej w połączeniu z dokorowym przeszczepem ex vivo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych, które prezentują nowatorską metodologię do dalszego testowania terapii opartych na komórkach macierzystych dla ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Hodowle organotypowe kory mózgowej dorosłego człowieka jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych

Poznaj protokół przygotowania swobodnie unoszącej się kultury plastrów z ludzkiego mózgu dorosłego. Ta uproszczona metoda umożliwia badania biochemiczne i immunohistochemiczne mechanizmów neurodegeneracji.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Przeglądaj więcej filmów