Name: Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę obrazowania in vivo i kwantyfikacji odpowiedzi angiogennej w ksenoprzeszczepach guza u larw Danio rerio. Technika umożliwia precyzyjne pomiary zwaskularyzacji nowotworu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu Alhadowi Mahagaonkarowi za zarządzanie obiektem dla zebry na Uniwersytecie w Auckland oraz Jednostce Badawczej Obrazowania Biomedycznego, Szkole Nauk Medycznych, Uniwersytecie w Auckland, za pomoc w poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Prace te były wspierane przez grant projektowy Health Research Council of New Zealand (14/105), grant projektu Royal Society of New Zealand Marsden Fund (UOA1602) oraz grant projektowy Auckland Medical Research Foundation (1116012) przyznany J.W.A.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRibatti%2C+D+%22Tumor+Angiogenesis+Assays%22">Tumor Angiogenesis Assays</a>. , 1st. edn, Humana Press. (2016).</li>
<li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li>
<li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis%2C+growth+and+metastasis+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKLB1002%2C+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling%2C+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li>
<li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li>
<li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).</li>
<li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%2Ftumor+xenograft+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li>
<li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7(2005).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li>
<li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768(2011).</li>
<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRN951%2C+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases%2C+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li>
<li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li>
<li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors%3A+histological%2C+morphometrical%2C+and+ultrastructural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li>
<li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma%3A+an+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li>
<li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li>
<li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-%28Lymph%29Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment%3A+Promise+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404(2016).</li>
<li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486(2012).</li>
<li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish%3A+an+introduction+to+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwszym krytycznym krokiem w protokole jest implantacja komórek nowotworowych. Istotne jest, aby komórki zostały wstrzyknięte w miejsce, które pozwoli ksenoprzeszczepowi na pomyślne zagnieżdżenie się w zarodku bez powodowania obrzęku zarodka. Wstrzyknięcie, które jest zbyt przednie, może pozwolić komórkom przesunąć się w kierunku serca, blokując krwiobieg i prowadząc do obrzęku, podczas gdy wstrzyknięcie, które jest zbyt tylne, spowoduje źle wszczepiony ksenoprzeszczep. Najlepiej unikać wstrzyknięcia przedniego, wprowa...

Angiogeneza jest jedną z klasycznych cech charakterystycznych raka i stanowi cel terapii przeciwnowotworowej1,2. Aby zbadać ten proces, stworzono ksenoprzeszczepowe modele raka poprzez wszczepienie komórek nowotworowych ssaków zwierzętom, takim jak myszy3. Opracowano również model ksenoprzeszczepu danio pręgowanego, który polega na wszczepieniu komórek nowotworowych do 2 dni po zapłodnieniu (dpi) danio pręgowanego, co powoduje szybki wzrost naczyń krwionośnych danio pręgowanego do ksenoprzeszczepu4.
Ten protokół opisuje model ksenoprzeszczepu zarodka danio pręgowanego in vivo, w którym odpowiedź angiogenna może być dokładnie określona ilościowo w całym ksenoprzeszczepie. Metoda ta pozwala badaczowi na zbadanie in vivo mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw odpowiedzi angiogennej guza. Podatność genetyczna danio pręgowanego pozwala na zbadanie wkładu gospodarza, podczas gdy wybór różnych linii komórek nowotworowych pozwala również na zbadanie udziału guza w angiogenezie5,6,7. Ponadto, ponieważ larwy danio pręgowanego są przepuszczalne dla małych cząsteczek, można stosować specyficzne inhibitory szlaku lub przeszukiwać biblioteki leków w celu identyfikacji nowych inhibitorów angiogenezy nowotworów8,9,10,11.
Model ksenoprzeszczepu zarodka danio pręgowanego ma unikalne zalety w porównaniu z innymi modelami ksenoprzeszczepów ssaków. Ksenoprzeszczepy danio pręgowanego są tańsze i łatwiejsze do wykonania, można badać dużą liczbę zwierząt, a obrazowanie żywych komórek pozwala na szczegółowe badanie zachowania komórek4. W przeciwieństwie do innych modeli in vivo, które wymagają do kilku tygodni, aby zaobserwować znaczny wzrost naczyń, angiogenezę w ksenoprzeszczepach danio pręgowanego można zaobserwować w ciągu 24 godzin po implantacji3,4. Jednak brak adaptacyjnego układu odpornościowego u embrionalnego danio pręgowanego, choć korzystny dla utrzymania ksenoprzeszczepu, oznacza, że nie można zbadać adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i jej udziału w angiogenezie guza. Ponadto brak komórek zrębu guza, niemożność ortotopowego wszczepienia guza oraz różnica w temperaturze utrzymania między komórkami danio pręgowanego i ssaków są potencjalnymi słabościami tej metody. Niemniej jednak przydatność tego modelu do obrazowania na żywo i możliwość dokładnego ilościowego określenia odpowiedzi angiogennej sprawia, że jest on wyjątkowo korzystny dla badania procesów komórkowych, które regulują angiogenezę guza in vivo.

<table><tbody><tr><td>Butla powietrzna</td><td>BOC</td><td>011G</td><td>Ksenotransplantacja</td></tr><tr><td>Komórki B16-F1</td><td>ATCC</td><td></td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>BD Matrigel LDEV-free (mieszanina macierzy zewnątrzkomórkowej)</td><td>Corning</td><td>356235</td><td>Ksenotransplantacja</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Warner Instruments</td><td>G100T-4</td><td>OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Długość = 10 cm Komórka do wstrzykiwania komórek</td></tr><tr><td> naczynie hodowlane o średnicy 35 mm</td><td>Thermofisher NZ</td><td>NUN153066</td><td>Hodowla ryb</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167-500EA</td><td>Hodowla ryb</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych 75 cm2</td><td>In Vitro Technologie</td><td>COR430641</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>CellTracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td>Etykietowanie komórek, stężenie zapasów (10 mM w DMSO), stężenie robocze (0,2 &mu; M w pożywce bez surowicy)</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Leczenie farmakologiczne, znakowanie komórek</td></tr><tr><td>Pożywka E3 (60x w 2 l wody) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2&middot; 2H2O 9,78 g MgCl2&middot; 6H2O dostosuj do pH 7,2 za pomocą NaOH</td><td>W domu [1]</td><td></td> <td>Hodowla ryb</td></tr><tr><td>Metanosulfonian etylo-3-aminobenzoesanu (Trikaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Ksenotransplantacja, obrazowanie</td></tr><tr><td>Końcówka filtra 1,000 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1491</td><td>Używany podczas wielu etapów</td></tr><tr><td>Końcówka filtra 200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1489</td><td>Używany podczas wielu etapów</td></tr><tr><td>Końcówka filtra 10 i mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1487</td><td>Używany podczas wielu etapów</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Przygotowanie zarodków</td></tr><tr><td>FBS (pochodzenie z Nowej Zelandii)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10091148</td><td>Rękawice do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>Dowolna marka</td><td></td> handlowa <td>Używany podczas wielu etapów</td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek hemocytometru Ulepszony Neubauer</td><td>HawksleyVet</td><td>AC1000</td><td>Ksenotransplantacja</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R Wirówka</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75004500</td><td>Hodowla komórkowa, Znakowanie komórek</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>62249</td><td>Etykietowanie komórek, Stężenie wyjściowe (1 mg/ml w DMSO), Stężenie robocze (6 &mu; g/ml w pożywkach bez surowicy)</td></tr><tr><td>Niska temperatura topnienia, UltraPure Agaroza Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>16520050</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9004 67 5</td><td>Ksenotransplantacja</td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Mikroładowarka do hodowli ryb</td></tr><tr><td>0,5-20 &mu; L końcówka do pipet do ładowania mikrokapilar</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Mikropipety ksenotransplantacyjne</td></tr><tr><td></td><td>Dowolna marka</td><td></td> handlowa <td>Używany podczas wielu etapów</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet P 87</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Ksenotransplantacja</td></tr><tr><td>Mikroskop inkubator klatkowy</td><td>Okolab</td><td></td><td>Obrazowanie poklatkowe</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Dowolna marka handlowa</td><td></td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3516</td><td>Ksenotransplantacja</td></tr><tr><td>Minimal Essential Media (MEM) - alpha</td><td>Thermofisher Scientfic</td><td>12561056</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Wtryskiwacz ciśnieniowy MPPI-2</td><td>Stosowane oprzyrządowanie</td><td></td> naukowe <td>Ksenotransplantacja</td></tr><tr><td>Mikromanipulator Narishige</td><td>Grupa</td><td></td> <td>NarishigeKsenotransplantacja</td></tr><tr><td>Nikon D Eclipse C1 Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td></td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznika (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Hodowla ryb</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Napełniacz do pipet do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>S1 Thermoscientific</td><td>9501</td><td>Posiewy komórkowe</td></tr><tr><td>Paskietka serologiczna 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Paskietka serologiczna 25 ml</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Paskietka serologiczna 5 ml</td><td>Corning</td><td>4485</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Paskietka serologiczna 2 ml</td><td>Corning</td><td>4486</td> Igła Terumo do <td>hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>22 G</td><td>Amtech</td><td>SH 182</td><td>Hodowla ryb</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td><td>Thermofisher Scientfic</td><td>HeraCell 150i Hodowla</td><td>komórkowa</td></tr><tr><td>Tivozanib (AV951)</td><td>AVEO Pharmaceuticals</td><td>Leczenie farmakologiczne</td>Pipeta transferowa 3 ml Mediray RL200C Hodowla ryb Trypsyna/EDTA (0,25%)Life Technologies T4049 Pęseta do hodowli <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td> Oprogramowanie Volocity <td>do hodowli ryb</td></tr><tr><td>(v6.3)</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td></td><td>Analiza obrazu</td></tr></tbody></table>

obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Angiogeneza nowotworów jest kluczowym celem terapii przeciwnowotworowej, a ta metoda została opracowana, aby dostarczyć nowy model do badania tego procesu in vivo. Ksenoprzeszczep danio pręgowanego jest tworzony przez wszczepienie komórek nowotworowych ssaków do przestrzeni okołokwiatowej zarodków danio pręgowanego dwa dni po zapłodnieniu, a następnie pomiar zakresu odpowiedzi angiogennej obserwowanej w eksperymentalnym punkcie końcowym do dwóch dni po implantacji. Kluczową zaletą tej metody jest możliwość dokładnego ilościowego określenia angiogennej odpowiedzi gospodarza danio pręgowanego na przeszczep. Umożliwia to szczegółowe badanie mechanizmów molekularnych, a także udziału gospodarza i guza w odpowiedzi angiogennej. Ksenoprzeszczepione zarodki mogą być poddawane różnym zabiegom, takim jak inkubacja z potencjalnymi lekami antyangiogenezą, w celu zbadania strategii hamowania angiogenezy guza. Odpowiedź angiogenna może być również obrazowana na żywo w celu zbadania bardziej dynamicznych procesów komórkowych. Stosunkowo niewymagająca technika eksperymentalna, niskie koszty utrzymania danio pręgowanego i krótki czas trwania eksperymentów sprawiają, że model ten jest szczególnie przydatny do opracowywania strategii manipulowania angiogenezą guza.

Poprzez obrazowanie pojedynczego ksenoprzeszczepu w 6., 24. i 48. godzinie po implantacji (hpi), odpowiedź angiogenną w różnych punktach czasowych można obliczyć zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1A-C. Najsilniejszą odpowiedź angiogenną obserwuje się między 24. a 48. godziną po implantacji, przy czym maksymalny poziom unaczynienia przeszczepu stwierdza się około 2. dnia po implantacji (dpi) (Rysunek 1A-...

Celem tej metody jest wygenerowanie in vivo modelu angiogenezy guza poprzez ksenografowanie komórek nowotworowych ssaków do zarodka danio pręgowanego, który ma fluorescencyjnie znakowane naczynia krwionośne. Obrazując ksenoprzeszczep i związane z nim naczynia, można uzyskać ilościowy pomiar odpowiedzi angiogennej.

Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób transgeniczne larwy danio pręgowanego mogą być wykorzystane do ilościowego testu in vivo unaczynienia ksenoprzeszczepu guza. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z poprzednimi technikami jest to, że pozwala badaczowi na dokładne ilościowe określenie zmian w poziomach unaczynienia ksenoprzeszczepu. Kluczowym krokiem jest upewnienie się, że komórki nowotworowe są prawidłowo wstrzykiwane do larw danio pręgowanego, tak aby kolejne etapy obrazowania i oceny ilościowej nie były zagrożone.Po wyhodowaniu i znakowaniu komórek B16-F1 barwnikiem fluorescencyjnym należy przystąpić do przygotowania zarodków do implantacji. Napełnij 35-milimetrowe naczynie 2% metylocelulozą w roztworze E3 do jednej czwartej objętości naczynia. Za pomocą pipety transferowej umieść około 50 wcześniej przygotowanych transgenicznych zarodków na metylocelulozie, minimalizując objętość przenoszonego roztworu E3.Za pomocą końcówki pipety mikrokapilarnej ułóż zarodki tak, aby wszystkie były ustawione pionowo, z głowami do góry, ogonami do dołu, a zarodek lewą stroną do góry. Dodaj 50% ECM do wcześniej przygotowanej osadki komórek B16-F1, aby wytworzyć mieszaninę komórek do ECM w stosunku dwa do jednego. Dobrze wymieszaj, pipetując i mieszając, a następnie przechowuj mieszaninę na lodzie.Użyj pipety mikrokapilarnej, aby pobrać od trzech do 10 mikrolitrów komórek. Ostrożnie włożyć końcówkę pipety do wcześniej przygotowanej igły do mikroiniekcji, a następnie wysunąć mieszaninę matrycową B16-F1 do końcówki igły. Włóż igłę do uchwytu igły i przechyl pod kątem 45 stopni do naczynia.Użyj pęsety, aby złamać końcówkę igły, aby zrobić otwór wystarczająco duży, aby komórki mogły zostać wyrzucone z igły bez ściskania komórek. Włącz butlę ze sprężonym powietrzem dołączoną do aparatu iniekcyjnego, a następnie na chwilę włącz wtryskiwacz w trybie ciągłym na nie dłużej niż jedną sekundę, aby wepchnąć komórki do końcówki igły. Skieruj igłę w stronę woreczka żółtkowego zarodka i przepchnij ją przez woreczek żółtkowy w kierunku brzusznym, aż końcówka igły wyłoni się z woreczka żółtkowego i będzie popychać naskórek zarodka po brzusznej stronie zarodka, tuż za sercem.Ostrożnie i lekko popchnij końcówkę igły do przodu, aż utworzy się niewielka przestrzeń między naskórkiem a błoną woreczka żółtkowego. Impulsuj wstrzykiwacz, aby wyrzucić część mieszaniny komórek do tej przestrzeni perywitelinowej. Uważnie przyjrzyj się rozmiarowi, kształtowi i lokalizacji ksenoprzeszczepu podczas jego wszczepiania i odpowiednio dostosuj liczbę impulsów i położenie igły, aby zapewnić prawidłowo wszczepiony ksenoprzeszczep.Powtarzaj impulsy, aż 500 do 800 komórek zostanie wstrzykniętych do przestrzeni okołożółtowej, tworząc widoczne wybrzuszenie, które rozciąga się co najmniej w połowie długości wzdłuż dna woreczka żółtkowego. Wyjąć igłę z zarodka. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków użyj końcówki pipety mikrokapilarnej, aby ścisnąć wszystkie zarodki razem, aby można je było odpipetować z jak najmniejszą ilością metylocelulozy.Przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego zawierającego E3 z PTU i błękitem metylenowym. Następnie delikatnie odpipetuj E3 wokół zarodków, aby je umyć, a następnie inkubuj w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Następnie zobrazuj znieczulone zarodki za pomocą mikroskopu konfokalnego.Użyj kanału laserowego odpowiedniego dla komórek nowotworowych, aby określić objętość do zobrazowania, pozwalając na co najmniej jeden lub dwa odcinki optyczne po obu stronach przeszczepu. Użyj odstępów między sekcjami, które są oddalone od siebie o około pięć mikrometrów, aby utworzyć stos Z. Użyj obrazowania dwukanałowego, aby zobrazować zarówno naczynia krwionośne, jak i ksenoprzeszczep guza.Zobrazuj ksenoprzeszczep guza i naczynia krwionośne dla jednej larwy i powtórz te kroki dla każdej larwy, która ma być zobrazowana. Aby rozpocząć od oceny ilościowej odpowiedzi angiogennej na ksenoprzeszczep danio pręgowanego, przenieś wcześniej utworzone pliki obrazów konfokalnych stosu Z ksenoprzeszczepu guza do nowego folderu w oprogramowaniu do analizy obrazów 3D. Aby utworzyć protokół Tumor Volume do pomiaru objętości ksenoprzeszczepu guza, przejdź do zakładki Pomiar w górnym menu okna, a następnie z wyświetlonej listy protokołów przeciągnij protokół o nazwie Find Objects do miejsca zatytułowanego Przeciągnij zadania tutaj, aby dokonać pomiarów.Po upewnieniu się, że ten protokół jest ustawiony na pomiar obiektów w kanale guza, przeciągnij protokoły o nazwach Przytnij do ROIs i Utwórz ROI z populacji z listy protokołów do przestrzeni Przeciągnij tutaj do przestrzeni Przeciągnij tutaj do obszaru Przeciągnij tutaj do pomiarów, upewniając się, że te dwa polecenia mają zastosowanie do obiektów zidentyfikowanych przez Znajdź obiekty. Przed kalibracją ustawień tego protokołu przejdź do menu rozwijanego nad etykietą Tryb w lewym górnym rogu okna i wybierz widok Extended Focus. Odznacz kanały nienowotworowe w okienku po prawej stronie, klikając czarne kółko pod nagłówkiem każdego kanału, tak aby widoczny był tylko kanał nowotworowy.Następnie użyj narzędzia Rysunek odręczny w górnej części okna, aby narysować obszar zainteresowania lub ROI wokół całej objętości guza. W panelu poniżej obrazu wybierz etykietę Podsumowanie, a następnie ustaw opcję Wyświetlanie, aby wyświetlić populację drugą. Aby skalibrować, w zadaniu Znajdź obiekty kliknij gwiazdkę, aby otworzyć okno ustawień.Dostosuj próg za pomocą intensywności i określ dolny próg, aż zostaną wybrane tylko komórki nowotworowe, a nie fluorescencja tła. Określ minimalny rozmiar obiektu, tak aby mierzone były tylko nienaruszone komórki, w przeciwieństwie do mniejszych elementów szczątków komórek, ustawiając minimalny rozmiar obiektu na 100 mikrometrów sześciennych. Zapisz ten protokół jako objętość guza, klikając kartę Pomiary w górnym menu i klikając Zapisz protokół.Użyj tych samych ustawień do pomiaru wszystkich ksenoprzeszczepów. Aby zmierzyć objętość naczyń krwionośnych związanych z ksenoprzeszczepem, utwórz nowy protokół, przechodząc do górnego menu, a następnie klikając zakładkę Pomiary, a następnie Wyczyść protokół. Przeciągnij zadania Znajdź obiekty i Przytnij do ROI do obszaru zatytułowanego Przeciągnij zadania tutaj, aby dokonać pomiarów dla tego protokołu.Upewnij się, że pierwsze polecenie jest ustawione na pomiar obiektów w kanale naczynia krwionośnego, a następne polecenie jest ustawione na zastosowanie do obiektów zidentyfikowanych przez pierwsze polecenie. Następnie usuń zaznaczenie kanałów niezwiązanych z naczyniami w skrajnym prawym okienku, aby widoczne były tylko naczynia krwionośne. Określ ustawienia dla protokołu Objętość naczynia w podobny sposób, jak dla wcześniej opisanego protokołu Objętość Guza, i zapisz ten protokół jako Objętość naczynia.Wyczyść protokół i narysuj ROI wokół ksenoprzeszczepu, uważając, aby nie uwzględnić żadnej autofluorescencji nienowotworowej. Aby zmierzyć sumę objętości obiektów w kanale guza w tym ROI, kliknij kartę Pomiary, wybierz polecenie Przywróć protokół, wybierz protokół objętości guza i kliknij Przywróć. Korzystając z nowego zwrotu z inwestycji utworzonego przez protokół objętości guza, kliknij kartę Measurements (Pomiary) i wybierz polecenie Restore Protocol (Przywróć protokół), wybierz protokół Volume (Przywróć protokół) i kliknij wiersz sumy, aby obliczyć całkowitą objętość obiektów w kanale naczynia w tym ROI.Podziel objętość naczynia przez objętość guza i pomnóż odpowiedź przez 100, aby uzyskać procentową wartość unaczynienia przeszczepu. Obrazując pojedynczy ksenoprzeszczep po sześciu, 24 i 48 godzinach po implantacji, można obliczyć odpowiedź angiogenną w różnych punktach czasowych, przy czym największa odpowiedź angiogenna występuje między 24 a 48 godzinami po implantacji, a maksymalny poziom unaczynienia przeszczepu obserwuje się około 48 godzin. Konfokalne obrazowanie poklatkowe ksenoprzeszczepu B16-F1 wszczepionego do zarodka danio pręgowanego dwa dni po zapłodnieniu pokazuje naczynia krwionośne znakowane GFP rosnące przez ksenoprzeszczep, tworząc skręconą sieć z naczyniami o nieregularnym rozmiarze i morfologii typowej dla nieprawidłowej sieci naczyniowej obserwowanej w nowotworach ssaków.Ksenoprzeszczepy inkubowane w inhibitorze VEGFR wykazują dużą redukcję naczyń krwionośnych w porównaniu z ksenoprzeszczepami kontrolnymi inkubowanymi w DMSO. W zarodkach kontrolnych występowała ekspansywna sieć naczyniowa rozciągająca się na całym obszarze ksenoprzeszczepu, typowa reakcja angiogenna obserwowana po implantacji komórek B16-F1. W ujęciu ilościowym odpowiedź angiogenna wykazuje wyraźne zmniejszenie unaczynienia przeszczepu u ksenoprzeszczepów leczonych inhibitorem VEGFR w porównaniu z grupą kontrolną.Kanał nowotworowy wykazuje masę komórek B16-F1 znakowanych fluorescencyjnie poniżej woreczka żółtkowego, który wykazuje autofluorescencję. Dlatego wokół ksenoprzeszczepu należy ostrożnie narysować ROI, uważając, aby nie uwzględnić żadnej autofluorescencji z woreczka żółtkowego. Protokół Tumor Volume zidentyfikował wszystkie komórki B16-F1 w ROI, zmierzył ich objętość i przyciął ROI do ich objętości.Protokół objętości naczyń nowotworowych w tym nowym skróconym ROI pozwolił na identyfikację wszystkich naczyń związanych z masą komórek B16-F1 i zmierzenie ich objętości. Wartości z protokołów Objętość Guza i Objętość Naczyń Nowotworowych można wykorzystać do określenia miary unaczynienia przeszczepu. Genetyczna podatność i przepuszczalność danio pręgowanego pozwala na badanie szlaków sygnałowych o wysokim poziomie w angiogenezie guza, a także może działać jako platforma przesiewowa do identyfikacji związków antyangiogennych.

in-vivo-imaging-quantitation-host-angiogenic-response-zebrafish-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Ta metoda wykorzystuje embriony danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności komórek rakowych do naczyń krwionośnych. Fluorescencyjne komórki rakowe są wstrzykiwane do zatoki przedsercowej lub woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków. Inwazję naczyniową i wynaczynienie komórek rakowych ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej obszaru ogonowego od 24 do 96 godzin później.

Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Ten protokół opisuje stworzenie mysiego modelu z guzem do monitorowania progresji guza i angiogenezy w czasie rzeczywistym za pomocą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego.

Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza i angiogenezy

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Modele przedkliniczne mają na celu poszerzenie wiedzy na temat biologii nowotworów i przewidywanie skuteczności leczenia. W artykule opisano wytwarzanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) na podstawie danio pręgowanego z fragmentami tkanki nowotworowej. ZPDX leczono chemioterapią, której efekt terapeutyczny oceniano pod kątem apoptozy komórek przeszczepionej tkanki.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania in vivo i kwantyfikacji odpowiedzi angiogennej w ksenoprzeszczepach guza u larw Danio rerio. Technika umożliwia precyzyjne pomiary zwaskularyzacji nowotworu.

Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów