Name: Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj metodę hodowli plastrów ex vivo z embrionalnych myszy GFP do obrazowania wzrostu nerwu okoruchowego. Technika umożliwia badanie szlaków prowadzenia aksonów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie zapewnione przez National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant] oraz Children's Hospital Ophthalmology Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE jest badaczem Instytutu Medycznego Howarda Hughesa.

Wszystkie opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z protokołami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Krycia czasowe
<ol>
	<li>Miejsce ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Nr magazynowy: 017952) samce i samice myszy razem przez noc. Zważ samice i zapisz wagę przed kryciem. 
	UWAGA: ISLMN:GFP specjalnie oznacza neurony ruchowe farnezylowanym GFP, który nie jest cytotoksyczny, lokalizuje się w błonie komórkowej neuronów ruchowych i ich aksonach oraz umożliwia wizualizację nerwów podczas rozwoju25. Można również użyć innych linii znakowanych fluorescencyjnie.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma zatyczek dopochwowych wczesnym rankiem. Data zidentyfikowania wtyczki jest oznaczona jako E0.5.</li>
	<li>Potwierdź ciążę za pomocą przyrostu masy ciała i/lub ultradźwięków przy E10.5. Ciężarne matki powinny przybrać na wadze co najmniej 1 g. Zarodki można zobaczyć w badaniu ultrasonograficznym pod kątem E10,5.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników i wibratomu do hodowli plastrów
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml buforu do krojenia: dodaj 5 ml HEPES i 5 ml penicyliny/streptomycyny do 500 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) bez Ca2+ i Mg2+. Schłodzić do 4 °C. 
	UWAGA: Dodatkowy bufor do krojenia powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C i może być wykorzystany do przyszłych eksperymentów z kulturami plastrów.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml pożywki hodowlanej: W sterylnym kapturze dodaj 12,5 ml HBSS, 12,5 ml płodowej surowicy bydlęcej, 250 μl glukozy, 250 μl L-glutaminy, 125 μl HEPES do 24,4 ml Fluorobright DMEM. (Stężenia końcowe: FlouroBright DMEM z 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glukozy, 1 mM glutaminy i 2,5 mM HEPES.). Podgrzać pożywkę hodowlaną do temperatury 37 °C w sterylnej łaźni wodnej. 
	UWAGA: Pożywki hodowlane można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
	<ol>
		<li>W sterylnym kapturze dodaj 1,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Dodaj wkładkę do hodowli komórkowej (tabela materiałów) do każdej studzienki. Umieść w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia: rozpuść 2 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml sterylnego PBS. Kuchenka mikrofalowa w odstępach 30-60 s, aż do całkowitego rozpuszczenia. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C, aby utrzymać płyn. 
	UWAGA: Dodatkowa agaroza może być przechowywana w temperaturze pokojowej (RT) i stopiona do przyszłych eksperymentów z kulturą plastrów.</li>
	<li>Skonfiguruj wibratom: Umieść nowe ostrze na wibratomie. Sprawdź ustawienia: grubość 400-450 μm. Wstępnie schłodź etap wibratomowy. Umieść trochę lodu w zewnętrznej komorze. Skorzystaj z komory i sceny poświęconej żywym plastrom. Nie używaj tej samej komory wibratomu do utrwalenia tkanki, ponieważ resztkowy utrwalacz może być szkodliwy dla plastrów.</li>
	<li>Przygotować górny inkubator ze stopniem mikroskopu do temperatury 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotuj się do sekcji: Oczyść narzędzia chirurgiczne i spryskaj 70% etanolem. Napełnij dwie szalki Petriego HBSS, umieść na lodzie. Otwórz 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i umieść pokrywkę na lodzie spodem skierowanym do góry. Otwórz 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i umieść wkładki błony do hodowli komórkowych oraz 1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych w każdym dołku. Podgrzej płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . </li>
</ol>
3. Pobieranie zarodków E10.5 i przygotowanie plastrów
UWAGA: Wszystkie kroki od tego momentu powinny być wykonane tak szybko, jak to możliwe. Trzymaj zarodki na lodzie przez cały czas.
<ol>
	<li>Poddać eutanazji ciężarną matkę (E10.5) w komorze CO2 . Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Spryskaj brzuch 70% etanolem. Rozetnij brzuch nożyczkami, usuń macicę i umieść ją na szalce Petriego z lodowatym HBSS, aby szybko zmyć krew. Przenieś umytą macicę do drugiego Petriego wypełnionego lodowatym naczyniem HBSS.</li>
	<li>Pod lunetą sekcyjną usuń zarodki z rogu macicy i poszczególnych worków owodniowych. Umieścić zarodki na spodniej stronie pokrywy płytki 12-dołkowej. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Pod lunetą sekcyjną użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć płyn otaczający każdy zarodek. 
	UWAGA: Zarodki przykleją się do bibuły filtracyjnej po dotknięciu.</li>
	<li>Osadź zarodki w agarozie. Wlej roztopioną agarozę na każdy zarodek, aby go przykryć. Trzymaj na lodzie. Gdy tylko agaroza stwardnieje, odwróć każdy zarodek i wlej dodatkową agarozę na drugą stronę. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą fluorescencyjnej lunety preparacyjnej przytnij agarozę wokół każdego zarodka, aby była prawidłowo zorientowana po przyklejeniu do etapu wibratomu. Jądro okoruchowe i wczesny wyrostek aksonów są fluorescencyjne. Ustaw zarodek tak, aby jądro, wyrastające aksony i oko tworzyły linię, a agarozę przyciąć żyletką przeciętą równolegle do tej linii (grzbietowo do zarodka, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Będzie to strona przyklejona do stopnia wibratomu (zarodek zostanie umieszczony na plecach, głowa najbliżej ostrza wibratomu). Linia między jądrem okoruchowym a okiem powinna być równoległa do ostrza wibratomu.</li>
	<li>Napełnij komorę wibratomu lodowatym buforem do plastrów. Przyklej zarodek do etapu wibratomu, tak aby ostrze było równoległe do jądra okoruchowego i oczu. Gdy superglue wyschnie, zanurz etap wibratomu tak, aby zarodek był zorientowany odwrotnie niż ostrze.</li>
	<li>Pokrój plastry o grubości 400-450 μm. Zbierz każdy plasterek za pomocą sterylnej pipety transferowej. Umieść w buforze do krojenia na zimno.</li>
	<li>Pod lunetą sekcyjną wybierz wycinek zawierający jądra okoruchowe i oczy. Za pomocą sterylnej pipety transferowej umieścić ją na wkładce do hodowli komórkowej w płytce 6-dołkowej. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Alternatywnie, niech jedna osoba kroi, a druga układa plasterki. Zminimalizuj czas między krojeniem a umieszczeniem w inkubatorze. 
	UWAGA: Plastry powinny być zorientowane w taki sposób, aby maksymalna fluorescencja emitowana z jąder i aksonów była najbliższa obiektywowi mikroskopu obrazowego. W mikroskopie odwróconym plastry należy umieścić na membranie z jądrami i aksonami najbliżej obiektywu pod płytką.</li>
	<li>Usuń pozostałą agarozę ze stadium wibratomu, przyklej następny zarodek do etapu i powtarzaj kroki 3.7-3.9, aż wszystkie zarodki zostaną pokrojone i pokryte.</li>
	<li>Dodać wybrany inhibitor lub rekombinowaną cząsteczkę do pożywki w każdym dołku, aby utworzyć krzywą dawka-odpowiedź. Rozcieńczyć w odpowiednim rozpuszczalniku. 
	UWAGA: Jeśli używasz DMSO, używaj tylko DMSO klasy kultur tkankowych. Alternatywnie, kulki uwalniające białko można umieścić w określonych miejscach na plastrze.</li>
	<li>Umieścić na mikroskopie w komorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Ustaw mikroskop tak, aby wykonywał zdjęcia kontrastu fazowego i fluorescencji każdego wycinka co 30 minut (lub częściej, jeśli jest to pożądane). Plastry można przechowywać przez 48-72 godziny.</li>
</ol>

<ol><li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+%28CCDDs%29%3A+insights+into+axon+growth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li>
<li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li>
<li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li>
<li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics%2C+kinesin+interactions%2C+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit%2FRobo+repulsion+and+Netrin%2FDCC+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li>
<li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li>
<li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li>
<li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li>
<li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li>
<li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li>
<li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li>
<li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li>
<li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li>
<li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li>
<li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li>
<li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+in+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li>
<li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li>
<li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96(2018).</li>
<li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li>
<li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CXCR4%2FCXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li>
<li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309(2011).</li>
<li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li>
<li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li>
<li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li>
<li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół hodowli warstwowej ex vivo zapewnia znaczące korzyści w porównaniu z tradycyjnymi testami naprowadzania aksonów23. Wielkość każdego jądra ruchowego czaszki nie jest czynnikiem ograniczającym i nie jest konieczna trudna sekcja. Endogenne mikrośrodowisko, przez które przemieszczają się aksony, jest utrzymywane, co pozwala na modyfikację jednego szlaku sygnałowego przy jednoczesnym zachowaniu innych szlaków sygnałowych. Dodatkowo efekty można oceniać w różnych punktach trajektorii aksonó...

System motoryczny oka dostarcza eleganckiego systemu do badania mechanizmów kierowania aksonami. Jest stosunkowo nieskomplikowany, składa się z trzech nerwów czaszkowych unerwiających sześć mięśni zewnątrzgałkowych (EOM), które poruszają okiem, oraz dźwigacza powieki górnej (LPS), który unosi powiekę. Nerw okoruchowy unerwia LPS i cztery EOM - mięśnie skośne dolne oraz mięśnie proste przyśrodkowe, dolne i górne. Pozostałe dwa nerwy, bloczek i odwodziciele, unerwiają tylko jeden mięsień, odpowiednio mięsień prosty skośny górny i boczny. Ruchy gałek ocznych zapewniają łatwy odczyt, pokazując, czy unerwienie było odpowiednie, brakujące lub nieprawidłowe. Ponadto istnieją zaburzenia ruchu gałek ocznych u człowieka, które wynikają z deficytów w rozwoju neuronów lub przewodnictwa aksonów, zbiorczo określane jako wrodzone zaburzenia unerwienia czaszki (CCDDs)1.
Pomimo tych zalet, układ motoryczny oka jest rzadko używany w badaniach nad prowadzeniem aksonów2,3,4,5,6,7,8,9,10, ze względu na wady techniczne. Testy naprowadzania aksonów in vitro mają wiele wad11. Testy kohodowlane, w których eksplantaty neuronalne są hodowane razem z eksplantatami tkanki docelowej12 lub transfekowane komórki13, zależą zarówno od symetrii eksplantatu, jak i precyzyjnego pozycjonowania między eksplantatem a tkanką docelową. Testy paskowe14,15, w których dwie wskazówki są ułożone w naprzemiennych paskach, a aksony są oceniane pod kątem preferencyjnego wzrostu na jednym pasku, wskazują tylko, że jeden substrat jest lepszy od drugiego, a nie, że jest atrakcyjny lub odpychający, lub fizjologicznie istotny. Komory mikroprzepływowe mogą tworzyć precyzyjne gradienty chemiczne, ale narażają rosnące aksony na naprężenia ścinające16,17,18, co może wpływać na ich wzrost. Co więcej, w każdym z tych podejść zbieranie eksplantatów lub zdysocjowanych komórek wymaga akstomizacji wyrastających aksonów, a zatem testy te faktycznie badają regenerację aksonów, a nie początkowy wzrost aksonów. Wreszcie, te podejścia in vitro usuwają mikrośrodowisko, które wpływa na aksony i ich reakcje na sygnały w różnych punktach ich przebiegu, i tradycyjnie testują tylko jedną wskazówkę w izolacji. Na domiar złego, niewielki rozmiar każdego jądra w układzie motorycznym oka sprawia, że sekcja jest technicznie trudna zarówno dla eksplantatów, jak i kultur zdysocjowanych. Dodatkowo, pierwotne hodowle neuronów ruchowych oka są zwykle niejednorodne, mają znaczną śmierć komórek i są zależne od gęstości, co wymaga łączenia komórek z wielu zarodków (Ryosuki Fujiki, komunikacja osobista). Jednak metody in vivo, w tym modele myszy z nokautem, nie są odpowiednie do stosowania w badaniach przesiewowych, biorąc pod uwagę wymagany czas i koszty.
Metody opracowane do hodowli całych zarodków19 pozwalają na znakowanie migrujących komórek20 lub blokadę określonych molekuł21, ale całe kultury zarodków wymagają inkubacji w butelkach rolkowych, co uniemożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym oznakowanych struktur. Możliwe są również techniki chirurgiczne, które pozwalają na manipulację zarodkiem, a następnie dalszy rozwój w macicy lub w jamie brzusznej matki (utrzymanie połączenia łożyskowego)22 są również możliwe, ale one również nie pozwalają na obrazowanie poklatkowe.
Aby pokonać przeszkody związane z testami in vitro i umożliwić szybkie badanie szlaków sygnałowych, opracowano technikę hodowli embrionalnej ex-vivo slice23, zaadaptowaną z wcześniej opublikowanego protokołu dla rozrostu nerwów obwodowych24. Korzystając z tego protokołu, rozwijający się nerw okoruchowy można obrazować w czasie w obecności wielu otaczających struktur wzdłuż jego trajektorii, w tym celów EOM. Dodając inhibitory małych cząsteczek, czynniki wzrostu lub wskazówki naprowadzające do pożywki, możemy ocenić perturbacje naprowadzania w wielu punktach wzdłuż trajektorii aksonów, umożliwiając szybszą ocenę potencjalnych czynników wzrostu i naprowadzania.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta Pasteura (szkło krzemienne)</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (200 g/L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hank's (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (250 nM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Loctite Superglue</td><td>Loctite Agaroza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert (30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 um)</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini perforowana łyżka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100 x 15 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X, pH 7,4)</td>Nożyczki do golenia <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr> Nożyczki chirurgiczne <tr><td></td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>- Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-12</td><td></td></tr><tr><td>Ti Eclipse Perfect Focus z TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome (VT 1200S)</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza wibratomu (podwójna krawędź, stal nierdzewna)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją gfp do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Dokładne ruchy gałek ocznych są kluczowe dla widzenia, ale rozwój układu motorycznego oka, zwłaszcza szlaków molekularnych kontrolujących prowadzenie aksonów, nie został w pełni wyjaśniony. Wynika to częściowo z ograniczeń technicznych tradycyjnych testów naprowadzania aksonów. Aby zidentyfikować dodatkowe wskazówki dotyczące aksonów wpływające na nerw okoruchowy, opracowano test warstwowy ex vivo do obrazowania nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym, gdy rośnie w kierunku oka. Zarodki E10.5 IslMN-GFP są wykorzystywane do generowania wycinków ex vivo poprzez osadzanie ich w agarozie, krojenie na wibratomie, a następnie hodowanie w inkubatorze mikroskopowym z fotomikroskopią poklatkową przez 24-72 godziny. Warstwy kontrolne podsumowują czas in vivo wzrostu aksonów z jądra na orbitę. Inhibitory małocząsteczkowe lub białka rekombinowane można dodawać do pożywki hodowlanej, aby ocenić rolę różnych szlaków kierowania aksonami. Zaletą tej metody jest utrzymanie większej ilości lokalnego mikrośrodowiska, przez które przechodzą aksony, bez aksotomizacji rosnących aksonów i oceny aksonów w wielu punktach wzdłuż ich trajektorii. Może również identyfikować wpływ na określone podzbiory aksonów. Na przykład hamowanie CXCR4 powoduje, że aksony nadal w śródmózgowiu rosną grzbietowo, a nie brzusznie, ale aksony, które już opuściły je brzusznie, nie są dotknięte.

Normalne wyniki: Rysunek 1 przedstawia schemat eksperymentu. Już od stadium E9.5 u myszy pierwsze aksony zaczynają wyłaniać się z jądra okoruchowego26. Do stadium E10.5 w mezenchymie można zaobserwować pęczkowaty nerw okoruchowy, zawierający wczesne neurony pionierskie. W stadium E10.5 występuje znaczna zmienność między embrionami (nawet w obrębie jednego miotu) pod względem stopnia zaawansowania wzrostu nerwu w stronę oczodołu, co prawdopodobnie wynika z różnic rozwo...

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Protokół ten pozwala nam zidentyfikować szlaki naprowadzania aksonów aktywne w nerwie okoruchowym i ocenić ich rolę w różnych punktach trajektorii nerwu w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala zachować lokalne środowiska, przez które przemieszczają się aksony i ich ostateczne cele. Rosnące aksony nie są cięte, więc można ocenić początkowy wzrost aksonów, a nie regenerację.Metoda ta zapewnia wgląd w prowadzenie aksonów w układzie motorycznym oka, ale może być dostosowana do badania kierowania aksonami innych nerwów. Opanowanie tej techniki wymaga praktyki, a szybka praca jest niezwykle ważna. Próbując po raz pierwszy, użyj tylko kilku zarodków, a nie całego miotu.Przed rozpoczęciem zabiegu należy najpierw potwierdzić ciążę za pomocą badania ultrasonograficznego w 10,5 dniu zarodka od krycia czasowego. Zbierz zarodki, spryskaj brzuch ciężarnej myszy 70% etanolem i użyj nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszną, aby usunąć macicę. Umyj macicę na szalce Petriego z lodowatym HBSS przed umieszczeniem narządu na drugiej szalce Petriego ze świeżym, lodowatym HBSS.Pod lunetą sekcyjną wyjąć zarodki z rogu macicy i ich indywidualnych worków owodniowych, umieszczając każdy zarodek na spodniej st

ex-vivo-oculomotor-slice-culture-from-embryonic-gfp-expressing-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Ten film demonstruje hodowlę ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych embrionów myszy. Zarodki są izolowane i osadzane w agarozie. Za pomocą wibratomu uzyskuje się plastry zawierające jądra okoruchowe i oczy. Plastry są utrzymywane w kulturze i obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Hodowla ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych zarodków myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę hodowli plastrów ex vivo z embrionalnych myszy GFP do obrazowania wzrostu nerwu okoruchowego. Technika umożliwia badanie szlaków prowadzenia aksonów w czasie rzeczywistym.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego (Wideo) | JoVE Journal

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Przeglądaj więcej filmów