Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Protokół ten ma duży wpływ na odkrywanie i opracowywanie leków, zwłaszcza na opracowywanie nowych, pierwszych w swojej klasie leków o minimalnych skutkach ubocznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do dowolnego systemu GPCR i wykorzystać do uzyskania dokładnych informacji na temat farmakologii receptorów w żywych systemach w czasie rzeczywistym. Implikacje tej techniki są ściśle związane z nowymi terapiami, szczególnie tam, gdzie istotne są beta-aresztiny.

Należą do nich receptory opiodowe w bólu i receptory dopaminy w schizofrenii. Metoda ta może być przydatna w wielu medycznych obszarach badań naukowych, od neurologii po choroby krążeniowo-oddechowe. Demonstracja naszej metody metodą PCR jest ważna, ponieważ pozwala na szczegółową prezentację krytycznych etapów w protokole, co nie byłoby możliwe przy konwencjonalnej publikacji.

Zacznij od zaprojektowania starterów, aby wprowadzić interesujące geny do wektorów pBiT. Ze względu na kodon stop w ramce, który dzieli miejsce wielokrotnego klonowania, wybierz co najmniej jedno z trzech miejsc jako jedno z dwóch unikalnych enzymów restrykcyjnych potrzebnych do klonowania kierunkowego. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się z sekwencjami nukleotydowymi w celu zakodowania reszt łącznikowych i włączenia ich do starterów.

W przypadku pBiT1.1-C i pBiT2.1-C upewnij się, że starter do przodu zawiera kodon ATG i silną sekwencję konsensusu Kozaka. W przypadku pBiT1.1-N i pBiT2.1-N upewnij się, że starter odwrotny zawiera kodon stop. Użyj zaprojektowanych starterów, aby amplifikować wstawione DNA interesującego genu.

Połącz odczynniki PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, upewniając się, że używasz polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zminimalizować mutacje. Zaprogramuj termocykler i rozpocznij reakcję. Po zakończeniu PCR należy roztrawić produkt w reakcji trawienia o pojemności 50 mikrolitrów.

W 1,5-mililitrowej probówce wymieszaj 12 mikrolitrów wody destylowanej, pięć mikrolitrów odpowiedniego 10-krotnego buforu do wytrawiania restrykcyjnego i 30 mikrolitrów produktu PCR. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra każdego enzymu restrykcyjnego. Odwirować mieszaninę reakcyjną.

I inkubować przez noc w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza. Przygotuj drugą reakcję w celu strawienia plazmidu biorcy. W 1,5-mililitrowej probówce wymieszaj 23 mikrolitry wody, pięć mikrolitrów odpowiedniego 10-krotnego buforu do trawienia restrykcyjnego, 15 mikrolitrów plazmidu biorcy i 1,5 mikrolitra każdego enzymu restrykcyjnego.

Krótko wymieszaj probówkę. I inkubować przez noc w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza. Następnego dnia po sklonowaniu i transformacji należy wybrać od trzech do 10 pojedynczych kolonii bakteryjnych i przenieść je do jednego mililitra pożywki LB z ampicyliną.

Inkubuj komórki przez sześć godzin. A następnie przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do pięciu mililitrów świeżej pożywki LB z ampicyliną. Inkubuj kulturę w temperaturze 37,5 stopnia Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez noc.

Następnego dnia wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA mini-prep. Przesiewać oczyszczony plazmid pod kątem pomyślnej ligacji za pomocą PCR. Na dzień przed transfekcją wysiewaj komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną, używając zmodyfikowanego podłoża Eagle's firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostek na mililitr penicyliny G i 100 mikrolitrów na mililitr streptomycyny.

Do 60 dołków wewnętrznych należy dodawać tylko ogniwa, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia gradientów termicznych na płycie i efektów krawędziowych spowodowanych parowaniem. Dodaj 200 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej do 36 zewnętrznych studzienek i 150 mikrolitrów do przestrzeni między studzienkami. Następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia wykonaj transfekcję, używając łącznie 100 nanogramów DNA. Ustaw cztery różne kombinacje plazmidów zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Używając 20 mikrolitrów zmodyfikowanej minimalnej niezbędnej pożywki Eagle buforowanej HEPES i 0,3 mikrolitra odczynnika do transfekcji lipidowej na studzienkę.

Dodaj 20 mikrolitrów odczynnika do transfekcji lipidowej i mieszaniny DNA do każdej studzienki i mieszaj płytkę w kółko przez 10 sekund. Inkubuj płytkę w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin. Odśwież nośnik.

I inkubować przez kolejne 24 godziny. Po inkubacji odessać pożywkę i dodać 100 mikrolitrów minimalnej niezbędnej pożywki zmodyfikowanej Eagle buforowanej HEPES do każdej studzienki. Pozwól płytce ustabilizować się w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

W międzyczasie przygotuj substrat furimazyny, łącząc jedną objętość substratu 100X z 19 objętościami buforu rozcieńczającego LCS, tworząc 5-krotny zapas do zmieszania z pożywką do hodowli komórkowych. Gdy komórki będą gotowe, dodaj 25 mikrolitrów bulionu do każdego dołka i delikatnie mieszaj płytkę przez 10 sekund. Następnie mierz luminescencję przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu stabilizacji sygnału.

W przypadku eksperymentów z dodawaniem ligandów należy przygotować 13,5-krotny roztwór liganda w zmodyfikowanym roztworze Eagle'a buforowanym za pomocą HEPES i dodać 10 mikrolitrów na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do badania interakcji między prototypowym GPCR a dwiema izoformami beta-aresztyny.

Przebadano cztery różne kombinacje plazmidów, a do dalszych eksperymentów wybrano tę o najwyższym sygnale luminescencyjnym. Wartości EC50 dla każdej izoformy beta-aresztyny określono za pomocą krzywych dawka-odpowiedź, które uzyskano na podstawie maksymalnej odpowiedzi każdego stężenia z badań kinetycznych. Bardzo ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę podczas projektowania starterów PCR.

Opracowanie odpowiednich konstruktów ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tych testów. Postępując zgodnie z tą metodologią, będziesz w stanie monitorować interakcje receptor-beta-aresztyna, a także interakcje receptorów z innymi białkami cytozolowymi. Metodologia ta pomoże odpowiedzieć na fundamentalne pytania w dziedzinie farmakologii GPCR poprzez badanie, w jaki sposób oddziaływania GPCR-beta-aresztyna mogą być modulowane przez modyfikacje w strukturze liganda.