Name: Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Technika ta przyspiesza odkrywanie leków pierwszej klasy z minimalnymi efektami ubocznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Programu Badawczego (NRF- 2015M3A9E7029172) Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości.

1. Strategia projektowania podkładów
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do wprowadzenia interesujących genów do wektorów pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] i pBiT2.1-N [TK/SmBiT].</li>
	<li>Wybierz co najmniej jedno z tych trzech miejsc jako jedno z dwóch unikalnych enzymów restrykcyjnych potrzebnych do klonowania kierunkowego ze względu na obecność kodonu stop w ramce, który dzieli miejsce multiklonowania, jak pokazano w Rysunek 111.</li>
	<li>Włącz sekwencję nukleotydów do starterów, jak pokazano w Tabeli 1, aby zakodować reszty łącznika pokazane na czerwono w Tabeli 211.</li>
	<li>W przypadku wektorów pBiT1.1-C [TK/LgBiT] i pBiT2.1-C [TK/SmBiT] upewnij się, że starter 5 ́ zawiera kodon ATG i silną sekwencję konsensusu Kozaka (GCCGCCACC).</li>
	<li>Dla wektorów pBiT1.1-N [TK/LgBiT] i pBiT2.1-N [TK/SmBiT] upewnij się, że starter 3 ́ zawiera kodon stop. 
	UWAGA: Każdy wektor zawiera promotor HSV-TK w celu zminimalizowania niespecyficznych asocjacji i zmniejszenia artefaktów eksperymentalnych, a także każdy wektor ma kasetę ekspresji oporności na ampicylinę u bakterii.</li>
</ol>
2. PCR
<ol>
	<li>Przygotuj i uruchom reakcje PCR w celu amplifikacji wstawionego DNA interesującego genu przy użyciu starterów zaprojektowanych od kroku 1. Ważne jest, aby używać polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zminimalizować mutacje.</li>
	<li>Użyj dokładnie następującej kolejności, aby przygotować 50 μL reakcji PCR. Dodać 35,5 μl wody destylowanej, 5 μl 10x buforu polimerazy, 5 μl mieszaniny dNTP (po 2,5 mM), 1 μl matrycy plazmidu (200 ng/μL), 1,25 μl starterów do przodu i do tyłu (10 μM) i 1 μl polimerazy o wysokiej wierności (5 U/μL).</li>
	<li>Za pomocą termocyklera skonfiguruj następujący program amplifikacji DNA.
	<ol>
		<li>Denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 min.</li>
		<li>Powtórz 25 razy następujący cykl termiczny: 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 1 minutę, 72 °C przez 2 minuty na 1 kbp, aby zostać amplifikowanym.</li>
		<li>Uruchomić końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w termocyklerze. 
		UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie polimerazy o wysokiej wierności w celu zminimalizowania mutacji punktowych, szczególnie tych występujących podczas amplifikacji długich sekwencji. W miarę jak amplikon staje się dłuższy, stopień dokładności replikacji DNA maleje. W przypadku reakcji PCR wybierz temperaturę wyżarzania w oparciu o temperaturę topnienia obszaru, w którym oligonukleotydy bezpośrednio hybrydyzują z matrycą DNA, a nie z całą sekwencją startera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie produktu metodą PCR
	<ol>
		<li>Odizoluj produkt PCR od reszty reakcji PCR za pomocą zestawu od producenta preferencyjnego12. Produkt PCR jest teraz gotowy do trawienia restrykcyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trawienie DNA
<ol>
	<li>Do mineralizacji produktu PCR należy przygotować 50 μl reakcji trawienia w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Za pomocą probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 12 μl wody destylowanej.</li>
		<li>Dodaj 5 μl buforu 10x o najlepszej kompatybilności z obydwoma enzymami restrykcyjnymi.</li>
		<li>Z kroku 2.4 dodać 30 μl produktu PCR</li>
		<li>Na koniec dodaj 1,5 μl każdego enzymu restrykcyjnego.</li>
		<li>Krótko wymieszać wirowo i inkubować w temperaturze 37,5 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do trawienia plazmidu biorcy należy przygotować 50 μl reakcji trawienia w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Za pomocą probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 23 μl wody destylowanej.</li>
		<li>Dodaj 5 μl buforu 10x o najlepszej kompatybilności z obydwoma enzymami restrykcyjnymi.</li>
		<li>Dodać 15 μl plazmidu biorcy (200 ng/μL).</li>
		<li>Dodać 1,5 μl każdego enzymu restrykcyjnego.</li>
		<li>Krótko wymieszać przez wir i inkubować w temperaturze 37,5 °C przez noc. 
		UWAGA: Ważne jest, aby użyć 3 μg plazmidu biorcy w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału po oczyszczeniu DNA w żelu agarozowym. Istotne jest również pozostawienie trawienia DNA na noc przy użyciu obu enzymów w celu uzyskania wysokiej wydajności klonowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oczyszczanie i klonowanie żelu agarozowego DNA
<ol>
	<li>Przygotuj 1% żel agarozowy, aby uruchomić strawiony plazmid DNA i wstawki, a następnie przystąp do cięcia odpowiednich prążków. Po oczyszczeniu odpowiednich pasm wektorowych i insertowych12 należy określić stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Wykonaj ligację DNA, aby połączyć wstawkę z plazmidem biorcy.</li>
	<li>Przygotować reakcje ligacji około 100 ng całkowitego DNA, w tym 50 ng wektora plazmidowego.</li>
	<li>Ustaw stosunek plazmidu do wstawienia biorcy na poziomie około 1:3; można go obliczyć za pomocą kalkulatora wstawień wektorowych13.</li>
	<li>Równolegle ustanawia się kontrole ujemne. Na przykład ligacja DNA plazmidu biorcy bez żadnej wstawki dostarczy informacji o tym, ile tła jest obecne w niestrawionym lub samoligaturującym plazmidzie biorcy.</li>
</ol>
5. Transformacja klonów
<ol>
	<li>Umieścić probówkę z komórkami DH5α z zamrażarki w temperaturze -80 °C i natychmiast przenieść ją na lód na 20 minut.</li>
	<li>Po tym czasie weź 55 μl komórek DH5α i dodaj 4 μl reakcji ligacji i wymieszaj, przesuwając probówkę i przechowuj na lodzie przez 45 minut.</li>
	<li>Umieścić probówkę w łaźni wodnej uprzednio ogrzanej w temperaturze 42 °C dokładnie przez 48 s i natychmiast umieścić probówki z powrotem na lodzie na kolejne 3 minuty.</li>
	<li>Dodać 600 μl pożywki Luria Bulion (LB) uprzednio podgrzanej w temperaturze 37,5 °C i inkubować z wytrząsaniem przez 1 godzinę przy 200 obr./min.</li>
	<li>Przenieś 200 μl na płytkę agarową zawierającą ampicylinę 100 μg/ml i delikatnie rozprowadź po powierzchni z płynem, który jest w większości wchłonięty.</li>
	<li>Inkubuj płytki przez noc, aby zobaczyć kolonie następnego ranka. Plazmid biorcy na płytce wkładki powinien mieć znacznie więcej kolonii niż sama płytka plazmidu biorcy.</li>
</ol>
6. Izolacja gotowego plazmidu
<ol>
	<li>Wybierz 3-10 pojedynczych kolonii bakteryjnych i przenieś do 1 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i inkubuj przez 6 godzin.</li>
	<li>Pobrać 200 μl zawiesiny bakteryjnej i przenieść do 5 ml pożywki LB zawierającej takie samo stężenie ampicyliny jak w kroku 6.1 i inkubować przez noc w temperaturze 37,5 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Korzystając z zestawu do oczyszczania DNA miniprep, wykonaj oczyszczanie DNA miniprep przy użyciu 5 ml LB wyhodowanego przez noc, postępując zgodnie z instrukcjami producenta14.</li>
	<li>Aby zidentyfikować udane ligacje, należy skonfigurować reakcje PCR w taki sam sposób, jak w sekcji 2, używając DNA uzyskanego z kroku 6.3 jako matrycy z tymi samymi starterami, co w sekcji 2 podczas pierwszego PCR. Dodatnie klony będą wytwarzać produkty PCR o odpowiednim rozmiarze.</li>
	<li>Po dużym oczyszczeniu DNA z dodatnich klonów, należy przeprowadzić diagnostyczne trawienie restrykcyjne 500 ng oczyszczonego DNA z enzymami użytymi na etapie klonowania i uruchomić strawione produkty na 1% żelu agarozowym. Powinny istnieć dwa pasma: jeden rozmiar wektora, a drugi rozmiar nowej wstawki.</li>
	<li>Sprawdź sekwencję konstrukcji, sekwencjonując przy użyciu następujących starterów: Naprzód 5'- aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3' i odwrotne 5'-gcatttttcactgcattctagtt-3'. 
	UWAGA: Gdy DNA jest replikowane za pomocą PCR, zawsze istnieje możliwość wystąpienia błędów podczas amplifikacji, nawet przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności, dlatego bardzo ważne jest sekwencjonowanie końcowych konstruktów.</li>
</ol>
7. Transfekcja i ekspresja białka
<ol>
	<li>Na uprzednio pokrytej poli-L-lizyną białej 96-dołkowej płytce wykonaj wysiew komórek na dzień przed transfekcją w ilości 2,5 x 104 komórek na dołek przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle's firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U / ml penicyliny G i 100 μg / ml streptomycyny.</li>
	<li>Używaj tylko 60 dołków wewnętrznych, aby zminimalizować możliwość wystąpienia gradientów termicznych na płycie i efektów krawędziowych spowodowanych parowaniem. Dodać 200 μl sterylnej wody destylowanej do 36 studzienek zewnętrznych i 150 μl do przestrzeni między studzienkami i inkubować przez noc w temperaturze 37,5 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego ranka wykonaj transfekcję przy użyciu 100 ng całkowitego DNA (po 50 ng każdy konstrukt).</li>
	<li>Ustaw cztery różne kombinacje plazmidów (receptor: β-arrestin) zgodnie z Rysunek 2b.</li>
	<li>Dla każdej kombinacji plazmidów należy użyć 20 μl zmodyfikowanego minimum niezbędnego podłoża Eagle'a buforowanego HEPES przy użyciu 0,3 μl odczynnika do transfekcji lipidowej na studzienkę.</li>
	<li>Dodać 20 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji lipidowej i DNA do każdej studzienki i mieszać płytkę w kółko przez 10 sekund.</li>
	<li>Zmienić świeżą pożywkę po 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37,5 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37,5 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
8. Monitorowanie interakcji receptor-β-arrestin1/2 w komórkach HEK293
<ol>
	<li>Odessać pożywkę i dodać 100 μl zmodyfikowanej pożywki Eagle's Minimum Essential Medium buforowanej HEPES do każdej studzienki i pozostawić płytkę ustabilizowaną w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotuj substrat furimazyny, łącząc 1 objętość 100x substratu z 19 objętościami buforu rozcieńczającego LCS (20-krotne rozcieńczenie)11, tworząc 5-krotny zapas do zmieszania z pożywką do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodaj 25 μl 5x furimazyny do każdej studzienki i delikatnie mieszaj w kółko przez 10 sekund.</li>
	<li>Mierz luminescencję przez 10 minut, aby ustabilizować sygnał przy RT. 
	UWAGA: Wykorzystanie tego sygnału bazowego do normalizacji odpowiedzi każdej studzienki pomoże zmniejszyć zmienność spowodowaną różnicami w liczbie komórek posianych w każdym dołku, a także różnicami w wydajności transfekcji itp. Po obliczeniu należy uśrednić znormalizowaną odpowiedź z dołków replikacyjnych dla danego leczenia farmakologicznego.</li>
	<li>Przygotuj 13,5-krotny roztwór liganda w zmodyfikowanym Eagle's Minimum Essential Media buforowanym HEPES.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów w temperaturze pokojowej z 10 μl 13,5-krotnego dodania liganda, należy dodać związki za pomocą wtryskiwaczy lub pipety wielokanałowej i wymieszać płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej (20 s przy 200 obr./min).</li>
	<li>W przypadku eksperymentów w temperaturze 37,5 °C z 10 μl 13,5-krotnego dodatku liganda, należy użyć wtryskiwaczy do dozowania związków i mieszania za pomocą wytrząsarki orbitalnej instrumentu. W przypadku niestosowania wtryskiwaczy należy zdjąć płytkę z luminometru, dodać ligandy i wymieszać płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej (20 s przy 200 obr./min). 
	UWAGA: Użyj wtryskiwaczy i wytrząsarki w przyrządzie detekcyjnym, aby zminimalizować wahania temperatury związane z wyjmowaniem płytki z luminometru. Do tego testu można użyć standardowych luminometrów laboratoryjnych. Użyj czasu całkowania 0,25–2 s.</li>
</ol>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pharmacology+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li>
<li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li>
<li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li>
<li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+%CE%B2-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li>
<li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li>
<li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+signalling%3A+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li>
<li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+signatures+in+%CE%B2-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nanobit+Protein+Protein+Interaction+System+Protocol%22">Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22HiYield+Gel%2FPCR+Fragments+Extraction+Kit%22">HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit</a>. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).</li>
<li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ligation+Calculator%22">Ligation Calculator</a>. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cosmo+Genetech%22">Cosmo Genetech</a>. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS=
 (2019).</li>
<li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+incretins%3A+GLP-1+and+GIP%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li>
<li>ProMega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoGLO+Endurazine+and+Vivazine+Live+Cell+Substrates+Technical+Manual%22">NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Korzystając z przedstawionej tutaj metody, interakcje między dowolnym GPCR a β-arrestin1/2 można monitorować w żywych systemach w czasie rzeczywistym za pomocą tego testu komplementacji strukturalnej GPCR-β-arrestin. W związku z tym udało nam się zaobserwować różnicową rekrutację β-aresztyny między dwiema izoformami β-aresztyny przez GLP-1r (prototyp GPCR klasy B A), zaobserwowaliśmy również dysocjację kompleksu receptor-β-arrestin kilka minut po osiągnięciu maksymalnego sygnału luminescencyjnego.
<p class="jove_cont...

GPCRs stanowią cel prawie 35% obecnych leków na rynku1,2 a jasne zrozumienie ich farmakologii jest kluczowe w rozwoju nowych leków terapeutycznych3. Jednym z kluczowych aspektów odkrywania leków GPCR, szczególnie podczas opracowywania tendencyjnych agonistów, jest charakterystyka nowych ligandów w kierunku interakcji receptor-β-arrestin4 i β-arrestin interakcji z innymi białkami cytozolowymi, takimi jak clathrin5.
Udokumentowano, że sygnalizacja zależna od β-arrestin odgrywa kluczową rolę w zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba afektywna dwubiegunowa, duża depresja i schizofrenia6 a także poważne skutki uboczne niektórych leków, takich jak morfina7.
Obecne metody używane do monitorowania tych interakcji zazwyczaj nie reprezentują rzeczywistych endogennych poziomów badanych białek, w niektórych przypadkach wykazują słaby sygnał, fotowybielanie i w zależności od GPCR konfiguracja może być technicznie trudna8. Ten nowatorski test komplementacji strukturalnej wykorzystuje wektory promotorowe o niskiej ekspresji w celu naśladowania endogennych poziomów fizjologicznych i zapewnia wysoką czułość w porównaniu z obecnymi metodami9. Korzystając z tego podejścia, możliwe było łatwe scharakteryzowanie interakcji receptora galaniny-β-aresztyny1/2, a także β-aresztyny2-klatryny10. Metodologia ta może być szeroko stosowana do każdego GPCR o szczególnym znaczeniu, w którym β-aresztiny odgrywają kluczową funkcję fizjologiczną lub ich sygnalizacja jest istotna w niektórych chorobach.

<table><tbody><tr><td>Antybiotyki penicylina streptomycyna</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td> Inkubator bakteryjny <td>penicyliny/streptomycyny</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>(kurtka powietrzna), podstawowa</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pożywka do transfekcji kultur komórkowych</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Optimem 1X pożywka</td></tr> <tr>do hodowli komórkowych<td>Inkubator CO2</td><td>NUAIRE</td><td>NU5720</td><td>Inkubator CO2 z bezpośrednim ogrzewaniem</td></tr><tr><td>Cyfrowa łaźnia wodna</td><td>Lab Tech</td><td>LWB-122D</td><td>Cyfrowa kąpiel wodna lab tech</td></tr><tr><td>Odczyt dowodu polimerazy DNA</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td><td>PfU</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA</td><td>polimerazy DNA Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepLaboPass Plazmidowa</td></tr><tr><td>polimeraza Taq</td><td>Enzynomics</td><td>P750</td><td>nTaq Polimeraza DNA</td></tr><tr><td>Ograniczenie enzymu BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>Bufor restrykcyjny</td> enzymu <td>New England Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X Buffer</td></tr><tr><td>Ograniczenie enzymu EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>Ograniczenie enzymu NheI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R01315</td><td>NheI</td></tr><tr><td>Ograniczenie enzymów XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco Canada</td><td>12483020</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Żel/PCR DNA MiniKit</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td></tr><tr><td>Ligaza</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 Ligaza DNA</td></tr><tr>Mikroskop<td>świetlny</td><td>Olympus</td><td>CKX53SF</td><td>Mikroskop CKX53 Odczynnik</td></tr> do <tr><td>transfekcji lipidów</td><td>Olympus Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Biotek/Fisher Scientific</td><td>12504386</td><td>Synergy 2 Wielomodowe czytniki mikropłytek</td></tr><tr><td>System NanoBiT Promega</td><td></td><td>N2014</td><td>System startowy NanoBiT PPI MCS</td></tr><tr><td>Podłoże nanolucyferazy</td><td>Promega</td><td>N2012</td><td>Nano-Glo System testowy żywych komórek</td></tr><tr><td>PCR Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>Master cycler Nexus SX1</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Roztwór poli-L-lizyny</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trysyna EDTA 10X</td></tr><tr><td>Hodowla białych komórek 96-dołkowe płytki</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>Płytka testowa 96-dołkowa</td></tr></tbody></table>

monitorowanie interakcji gpcr-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interakcje między receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) a β-aresztinami są istotnymi procesami o bardzo ważnych implikacjach fizjologicznych. Obecnie charakterystyka nowych leków pod kątem ich interakcji z β-aresztinami i innymi białkami cytozolowymi jest niezwykle cenna w dziedzinie odkrywania leków GPCR, szczególnie podczas badań agonizmu tendencyjnego GPCR. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie nowatorskiego testu komplementacji strukturalnej do dokładnego monitorowania interakcji receptor-β-aresztin w żywych systemach w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest prosta, dokładna i może być łatwo rozszerzona na dowolny interesujący GPCR, a także ma tę zaletę, że pokonuje niespecyficzne interakcje ze względu na obecność promotora o niskiej ekspresji obecnego w każdym systemie wektorowym. Ten test komplementacji strukturalnej zapewnia kluczowe cechy, które umożliwiają dokładne i precyzyjne monitorowanie interakcji receptor-β-aresztyna, dzięki czemu nadaje się do badania tendencyjnego agonizmu dowolnego układu GPCR, a także kodów "fosforylacji" c-końca GPCR napisanych przez różne kinazy GPCR (GRK) i potranslacyjne modyfikacje aresztin, które stabilizują lub destabilizują kompleks receptor-β-aresztyna.

Zastosowano przedstawioną tutaj procedurę w celu monitorowania oddziaływań pomiędzy prototypowym GPCR a dwiema izoformami β-arrestyny. Konstrukcje receptora peptidu podobnego do glukagonu (GLP-1r) przygotowano przy użyciu starterów zawierających miejsca restrykcyjne dla enzymów NheI i EcoRI, a następnie sklonowano do wektorów pBiT1.1-C [TK/LgBiT] oraz pBiT2.1-C [TK/SmBiT]; w przypadku β-arrestyn wykorzystano dwa dodatkowe wektory, pBiT1.1-N [TK/LgBiT] oraz pBiT2.1-N [TK/SmBiT], stosując miejsca restrykcyjne BgIII i EcoRI...

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Protokół ten ma duży wpływ na odkrywanie i opracowywanie leków, zwłaszcza na opracowywanie nowych, pierwszych w swojej klasie leków o minimalnych skutkach ubocznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do dowolnego systemu GPCR i wykorzystać do uzyskania dokładnych informacji na temat farmakologii receptorów w żywych systemach w czasie rzeczywistym. Implikacje tej techniki są ściśle związane z nowymi terapiami, szczególnie tam, gdzie istotne są beta-aresztiny.Należą do nich receptory opiodowe w bólu i receptory dopaminy w schizofrenii. Metoda ta może być przydatna w wielu medycznych obszarach badań naukowych, od neurologii po choroby krążeniowo-oddechowe. Demonstracja naszej metody metodą PCR jest ważna, ponieważ pozwala na szczegółową prezentację krytycznych etapów w protokole, co nie byłoby możliwe przy konwencjonalnej publikacji.Zacznij od zaprojektowania starterów, aby wprowadzić interesujące geny do wektorów pBiT. Ze względu na kodon stop w ramce, który dzieli miejsce wielokrotnego klonowania, wybierz co najmniej jedno z trzech miejsc jako jedno z dwóch unikalnych enzymów restrykcyjnych potrzebnych do klonowania kierunkowego. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się z sekwencjami nukleotydowymi w celu zakodowania reszt łącznikowych i włączenia ich do starterów.W przypadku pBiT1.1-C i pBiT2.1-C upewnij się, że starter do przodu zawiera kodon ATG i silną sekwencję konsensusu Kozaka. W przypadku pBiT1.1-N i pBiT2.1-N upewnij się, że starter odwrotny zawiera kodon stop. Użyj zaprojektowanych starterów, aby amplifikować wstawione DNA interesującego genu.Połącz odczynniki PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, upewniając się, że używasz polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zminimalizować mutacje. Zaprogramuj termocykler i rozpocznij reakcję. Po zakończeniu PCR należy roztrawić produkt w reakcji trawienia o pojemności 50 mikrolitrów.W 1,5-mililitrowej probówce wymieszaj 12 mikrolitrów wody destylowanej, pięć mikrolitrów odpowiedniego 10-krotnego buforu do wytrawiania restrykcyjnego i 30 mikrolitrów produktu PCR. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra każdego enzymu restrykcyjnego. Odwirować mieszaninę reakcyjną.I inkubować przez noc w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza. Przygotuj drugą reakcję w celu strawienia plazmidu biorcy. W 1,5-mililitrowej probówce wymieszaj 23 mikrolitry wody, pięć mikrolitrów odpowiedniego 10-krotnego buforu do trawienia restrykcyjnego, 15 mikrolitrów plazmidu biorcy i 1,5 mikrolitra każdego enzymu restrykcyjnego.Krótko wymieszaj probówkę. I inkubować przez noc w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza. Następnego dnia po sklonowaniu i transformacji należy wybrać od trzech do 10 pojedynczych kolonii bakteryjnych i przenieść je do jednego mililitra pożywki LB z ampicyliną.Inkubuj komórki przez sześć godzin. A następnie przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do pięciu mililitrów świeżej pożywki LB z ampicyliną. Inkubuj kulturę w temperaturze 37,5 stopnia Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez noc.Następnego dnia wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA mini-prep. Przesiewać oczyszczony plazmid pod kątem pomyślnej ligacji za pomocą PCR. Na dzień przed transfekcją wysiewaj komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną, używając zmodyfikowanego podłoża Eagle's firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostek na mililitr penicyliny G i 100 mikrolitrów na mililitr streptomycyny.Do 60 dołków wewnętrznych należy dodawać tylko ogniwa, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia gradientów termicznych na płycie i efektów krawędziowych spowodowanych parowaniem. Dodaj 200 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej do 36 zewnętrznych studzienek i 150 mikrolitrów do przestrzeni między studzienkami. Następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnego dnia wykonaj transfekcję, używając łącznie 100 nanogramów DNA. Ustaw cztery różne kombinacje plazmidów zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Używając 20 mikrolitrów zmodyfikowanej minimalnej niezbędnej pożywki Eagle buforowanej HEPES i 0,3 mikrolitra odczynnika do transfekcji lipidowej na studzienkę.Dodaj 20 mikrolitrów odczynnika do transfekcji lipidowej i mieszaniny DNA do każdej studzienki i mieszaj płytkę w kółko przez 10 sekund. Inkubuj płytkę w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin. Odśwież nośnik.I inkubować przez kolejne 24 godziny. Po inkubacji odessać pożywkę i dodać 100 mikrolitrów minimalnej niezbędnej pożywki zmodyfikowanej Eagle buforowanej HEPES do każdej studzienki. Pozwól płytce ustabilizować się w temperaturze pokojowej przez 10 minut.W międzyczasie przygotuj substrat furimazyny, łącząc jedną objętość substratu 100X z 19 objętościami buforu rozcieńczającego LCS, tworząc 5-krotny zapas do zmieszania z pożywką do hodowli komórkowych. Gdy komórki będą gotowe, dodaj 25 mikrolitrów bulionu do każdego dołka i delikatnie mieszaj płytkę przez 10 sekund. Następnie mierz luminescencję przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu stabilizacji sygnału.W przypadku eksperymentów z dodawaniem ligandów należy przygotować 13,5-krotny roztwór liganda w zmodyfikowanym roztworze Eagle'a buforowanym za pomocą HEPES i dodać 10 mikrolitrów na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do badania interakcji między prototypowym GPCR a dwiema izoformami beta-aresztyny.Przebadano cztery różne kombinacje plazmidów, a do dalszych eksperymentów wybrano tę o najwyższym sygnale luminescencyjnym. Wartości EC50 dla każdej izoformy beta-aresztyny określono za pomocą krzywych dawka-odpowiedź, które uzyskano na podstawie maksymalnej odpowiedzi każdego stężenia z badań kinetycznych. Bardzo ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę podczas projektowania starterów PCR.Opracowanie odpowiednich konstruktów ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tych testów. Postępując zgodnie z tą metodologią, będziesz w stanie monitorować interakcje receptor-beta-aresztyna, a także interakcje receptorów z innymi białkami cytozolowymi. Metodologia ta pomoże odpowiedzieć na fundamentalne pytania w dziedzinie farmakologii GPCR poprzez badanie, w jaki sposób oddziaływania GPCR-beta-aresztyna mogą być modulowane przez modyfikacje w strukturze liganda.

monitoring-gpcr-arrestin12-interactions-real-time-living-systems-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez podrodzinę receptorów S1P (S1PRs). W tym miejscu opisano potok w celu wyjaśnienia struktur i funkcji S1PR.

Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Poznaj metodę monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Technika ta przyspiesza odkrywanie leków pierwszej klasy z minimalnymi efektami ubocznymi.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Przeglądaj więcej filmów