Name: Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj model mysiego zwłóknienia jelit wywołanego zakażeniem Salmonellą Typhimurium, który naśladuje chorobę Leśniowskiego-Crohna. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów fibrozy i potencjalnych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ingrid Barta za usługi histologiczne.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.
1. Przygotowanie kultur Salmonella Typhimurium ΔAroA do doustnego podawania myszy.
<ol>
	<li>Z zamrożonego bulionu glicerolu S. Typhimurium ΔAroA przygotować płytkę smugową przy użyciu agaru LB zawierającego 100 μg/ml streptomycyny ze sterylną pętlą zaszczepiającą. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Płytki smugowe można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na dzień przed zakażeniem należy przygotować antybiotyk, rozpuszczając 0,5 g streptomycyny w 2,5 ml wody. Po wysterylizowaniu roztworu streptomycyny metodą filtracyjną, należy doustnie pobrać zgłębnik myszy za pomocą igły do zgłębnika 22G z końcówką gruszki i strzykawki o pojemności 1 ml ze 100 μl roztworu streptomycyny (20 mg streptomycyny / dawkę). Za pomocą pętli zaszczepiającej zaszczepić 3 ml bulionu LB (50 μg/ml streptomycyny) w probówce hodowlanej z pojedynczą kolonią. Inkubować kulturę Salmonelli w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>W dniu zakażenia należy przygotować ostateczną dawkę zakażenia, wykonując 2 kolejne rozcieńczenia 1/10 nocnych kultur Salmonelli w sterylnym PBS. Otrzymałoby to inokulum o objętości 100 μl zawierające około 3 x 106 jtk.</li>
	<li>Za pomocą igły do zgłębnika 22G i strzykawki o pojemności 1 ml należy wstrzyknąć do każdej myszy 100 μl przygotowanego preparatu Salmonella. 
	UWAGA: Przygotuj kultury Salmonelli przy użyciu technik aseptycznych. Końcowe stężenie zaszczepiania Salmonelli można zweryfikować przez posiew seryjnych rozcieńczeń na agarze LB ze streptomycyną. Szczep S. Typhimurium ΔAroA można uzyskać, kontaktując się z profesorem McNagny (kelly@brc.ubc.ca).</li>
</ol>
2. Ocena obciążenia tkankami Salmonellą
<ol>
	<li>Przygotuj 2 ml mikroprobówek z okrągłym dnem z 1 ml sterylnego PBS i autoklawizowanym koralikiem ze stali nierdzewnej. Wstępnie zważ probówki przed pobraniem tkanki.</li>
	<li>Wyciąć tkanki jelita ślepego i śledziony od myszy poddanych eutanazji przez ekspozycję na dwutlenek węgla. Zbierz tkankę od poszczególnych zwierząt w oddzielnych probówkach. Zważ probówki, aby określić masę tkanki.</li>
	<li>Homogenizować za pomocą aparatu do mielenia mieszającego przez 15 minut przy 30 Hz. Przenieść 900 μl PBS na studzienkę do 96-dołkowego megabloku o pojemności 2 ml. Odpipetować 100 μl homogenatów tkankowych do pierwszego dołka, dobrze wymieszać i przeprowadzić seryjne rozcieńczenia, dodając 100 μl do kolejnych studzienek, aż do uzyskania rozcieńczenia 10-6. Umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia w trzech porcjach na agarze LB zawierającym 100 μg/ml streptomcyiny.</li>
	<li>Policz i pomnóż średnią jtk przez współczynnik 100, ponieważ 10 μl próbki 1000 μl zostało platerowane i odpowiedni współczynnik rozcieńczenia. Podziel całkowitą masę tkanki przez masę tkanki, aby określić jtk na gram tkanki. 
	UWAGA: Podczas przetwarzania tkanek wszystkie próbki należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Używaj końcówek do pipet z szerokim otworem podczas wykonywania seryjnych rozcieńczeń homogenatami tkankowymi. Przygotuj wcześniej 96-dołkowy megablok zawierający PBS.</li>
</ol>
3. Barwienie czerwienią Picrosirius i kwantyfikacja kolagenu.
<ol>
	<li>Utrwal tkanki jelita ślepego przez noc w 10% buforowanej formalinie i przygotuj się do zatapiania w parafinie. Wytnij sekcje 5 μm dla barwienia Picrosirius Red, jak opisano wcześniej25.</li>
	<li>Uchwyć złożone obrazy całych przekrojów kątowych pod mikroskopem w jasnym polu.</li>
	<li>Otwórz Fidżi (ImageJ) i przeciągnij i upuść plik obrazu .tif na pasek narzędzi.</li>
	<li>Na pasku menu wybierz opcję Image > Type > RGB Stack (Typ obrazu stosu RGB), aby podzielić obraz na kanały czerwony, zielony i niebieski. Przesuń poziomy pasek u dołu panelu, aby ustawić kanał na zielony</li>.
	<li>Otwórz narzędzie Image > Dostosuj > próg. Dostosuj minimalne i maksymalne limity, aby wyeliminować wszelkie sygnały tła. Po ustawieniu żądanego progu zamknij narzędzie progu i przejdź do opcji Analizuj > ustaw pomiary. Zaznacz pola Powierzchnia, Ułamek powierzchni, Ograniczenie do progu i Wyświetl etykietę.</li>
	<li>Bramkuj sekcję tkanki za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego lub zaznaczania wielokątów i zmierz dodatni obszar % dla kolagenu, klikając Analizuj > Zmierz.</li>
	<li>Normalizuj obszar bezwzględny dodatni dla barwienia kolagenu do obszaru tkanki. 
	UWAGA: Fidżi (ImageJ) to program typu open source, który można pobrać pod adresem https://fiji.sc. Obrazy o tych samych warunkach przechwytywania (tj. jasności i ostrości) muszą mieć identyczne limity progowe dla dokładnej kwantyfikacji. Jeśli w wybranej tkance występuje jakiekolwiek zabarwienie tła, zmierz powierzchnię bezwzględną i odejmij ją od obszaru dodatniego dla kolagenu z całej tkanki.</li>
</ol>

<ol><li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis.</a> New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).</li>
<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Crohn's disease.</a> The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+inflammatory+bowel+disease+pathogenesis%3A+linking+host+genetics+and+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome.</a> Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).</li>
<li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
<li>Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+immunopathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).</li>
<li>Ogura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frameshift+mutation+in+NOD2+associated+with+susceptibility+to+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.</a> Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).</li>
<li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li>
<li>Rivas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+resequencing+of+GWAS+loci+identifies+independent+rare+variants+associated+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.</a> Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).</li>
<li>Rioux, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+new+susceptibility+loci+for+Crohn+disease+and+implicates+autophagy+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis.</a> Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).</li>
<li>Uhlig, H. H., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+intestinal+inflammation+as+tools+to+understand+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).</li>
<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li>
<li>Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+enteric+Salmonella+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of enteric Salmonella infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Barthel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Enteric+Salmonella+Infection+in+Mice+Leads+to+Severe+and+Persistent+Intestinal+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic-dependent+Salmonella+typhimurium+are+non-virulent+and+effective+as+live+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li>
<li>Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+Salmonella+virulence+and+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).</li>
<li>Valdez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+drives+an+accelerated+inflammatory+response+during+Salmonella-induced+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).</li>
<li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORalpha+and+group+3+innate+lymphoid+cells+drive+fibrosis+in+a+mouse+model+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease.</a> Science Immunology. 1 (3), eaaf8864(2016).</li>
<li>Burke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrogenesis+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Fibrogenesis in Crohn's disease.</a> American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).</li>
<li>Hogan, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+and+regeneration+of+the+respiratory+system%3A+complexity%2C+plasticity%2C+and+mechanisms+of+lung+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).</li>
<li>Fiocchi, C., Lund, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Themes+in+fibrosis+and+gastrointestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).</li>
<li>Rieder, F., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis+in+IBD%E2%80%94a+dynamic%2C+multifactorial+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).</li>
<li>Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+for+adult+Crohn%27s+disease%3A+what+is+the+actual+risk%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Surgery for adult Crohn's disease: what is the actual risk?</a> Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).</li>
<li>Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picrosirius+staining+plus+polarization+microscopy%2C+a+specific+method+for+collagen+detection+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections.</a> Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).</li>
<li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+Preserves+Gut+Epithelial+Integrity+and+Promotes+Disease+Remission+during+Chronic+Salmonella+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection.</a> Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).</li>
<li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IL-13+triggers+TGF-beta1-dependent+tissue+fibrosis+in+chronic+2%2C4%2C6-trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).</li>
<li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-13+signaling+via+IL-13R+alpha2+induces+major+downstream+fibrogenic+factors+mediating+fibrosis+in+chronic+TNBS+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis.</a> Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis+is+reduced+by+early+elimination+of+inflammation+in+a+mouse+model+of+IBD%3A+impact+of+a+%26%2334%3BTop-Down%26%2334%3B+approach+to+intestinal+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a &#34;Top-Down&#34; approach to intestinal fibrosis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).</li>
<li>Darfeuille-Michaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+adherent-invasive+Escherichia+coli+associated+with+ileal+mucosa+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).</li>
<li>Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+infection+with+Crohn%27s+disease-associated+adherent-invasive+Escherichia+coli+leads+to+chronic+inflammation+and+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Persistent infection with Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis.</a> Nature Communications. 4, 1957(2013).</li>
<li>Imai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin-mediated+activation+of+IL-33-ST2+signaling+by+a+pathobiont+promotes+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis.</a> Mucosal Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych finansowych konfliktów interesów.

Nasza wiedza na temat patogenezy IBD została znacznie poszerzona dzięki mysim modelom zapalenia jelit. Chociaż takie indywidualne modele nie oddają wszystkich cech złożonej i wieloczynnikowej choroby człowieka, są przydatne w identyfikacji kluczowych cech progresji choroby. Zwężenia zwłóknieniowe związane z IBD pozostają główną niezaspokojoną potrzebą kliniczną, ponieważ obecne metody leczenia są nieskuteczne w odwracaniu rozwoju choroby. Co więcej, zwłóknienie jelit jest trudne do zbadania w warunkach laboratoryjnych ze...

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) to dwie główne formy IBD i są charakteryzowane jako przewlekłe i nawracające choroby zapalne przewodu pokarmowego 1,2. Zaburzenia te mają duży wpływ na jakość życia pacjentów. Objawy IBD obejmują ból brzucha, biegunkę, nudności, utratę masy ciała, gorączkę i zmęczenie3. Ostatnie badania zidentyfikowały czynniki genetyczne i środowiskowe, które przyczyniają się do patogenezy choroby; Uważa się, że takie czynniki ryzyka przyczyniają się do przerwania bariery nabłonkowej, co skutkuje translokacją lub nadpróbkowaniem antygenów luminalnych4. W konsekwencji inicjuje to nieprawidłową reakcję zapalną na florę komensalną, w której pośredniczą jelitowe komórki odpornościowe4. Cechy powikłań związanych z IBD mogą rozciągać się na miejsca poza przewodem pokarmowym, wpływając na różne narządy, w tym stawy, skórę i wątrobę1,2. Cechy charakterystyczne WZJG obejmują ciężkie i rozlane zapalenie zwykle zlokalizowane w okrężnicy1. Patologia choroby wpływa na błonę śluzową i podśluzówkę jelita, powodując powierzchowne owrzodzenia błony śluzowej1. W przeciwieństwie do tego, CD może wpływać na dowolną część przewodu pokarmowego, chociaż dowody choroby są powszechnie znajdowane w okrężnicy i dystalnym odcinku jelita krętego2. Co więcej, stan zapalny w CD jest przezścienny, dotyczy wszystkich warstw ściany jelita2.
Kilka zidentyfikowanych genów podatności na IBD wskazywałoby, że dysregulacja bariery nabłonkowej lub odporności jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do postępu choroby5. Stwierdzono, że mutacje w domenie oligomeryzacji nukleotydów 2 (NOD2) wyrażane przez monocyty są związane ze zwiększoną podatnością na CD; Podkreśla to związek między zmienionym wrodzonym wykrywaniem immunologicznym składników bakteryjnych a chorobą<klasa SUP="xref">6. Nowsze badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) ujawniły dodatkowe szlaki potencjalnie zaangażowane w patogenezę IBD, w tym wariacje genetyczne w: STAT1, NKX2-3, IL2RA, szlakach zależnych od IL23R związanych z odpornością adaptacyjną, MUC1, MUC19 i PTGER4 w utrzymaniu bariery jelitowej oraz autofagii za pośrednictwem ATG16L7,8,9. Chociaż te populacyjne badania genetyczne poszerzyły naszą wiedzę na temat IBD, same allele podatności są prawdopodobnie niewystarczające do zainicjowania i podtrzymania choroby przewlekłej3. Inne czynniki niegenetyczne, w tym zmiany w składzie mikrobiomu jelitowego i zmniejszenie różnorodności, są związane z zapaleniem jelit. Nie jest jednak jasne, czy dysbioza jelitowa poprzedza, czy jest konsekwencją rozregulowanych odpowiedzi immunologicznych3. Chociaż etiologia IBD pozostaje niejasna, nasza wiedza na temat patogenezy choroby została poszerzona dzięki eksperymentalnym mysim modelom zapalenia jelit10,11. Modele te same w sobie nie reprezentują w pełni złożoności ludzkiej choroby, ale są cenne dla wyjaśnienia szlaków patofizjologicznych, które mogą być istotne dla IBD oraz dla walidacji wstępnych strategii terapeutycznych10,11. Takie modele myszy zazwyczaj opierają się na inicjacji stanu zapalnego przez indukcję chemiczną lub infekcję, transfer komórek odpornościowych lub manipulację genetyczną. Co więcej, strategie te często wiążą się z zaburzeniami integralności nabłonka lub modulacją odporności wrodzonej lub nabytej.
Serowiry Salmonella enterica to patogeny jelitowe, które mogą zarażać ludzi i myszy. Po spożyciu Salmonella może skolonizować jelita poprzez bezpośrednią inwazję nabłonka, komórek M lub komórek prezentujących antygen12. Myszy zakażone doustnie S. Typhimurium powodują kolonizację głównie miejsc ogólnoustrojowych, takich jak śledziona i węzły chłonne krezkowe, ze stosunkowo niską liczebnością w przewodzie pokarmowym12. Jednak wstępne leczenie myszy streptomycyną zwiększa skuteczność kolonizacji jelit przez Salmonellę poprzez zmniejszenie ochronnego działania gospodarza normalnej mikroflory13. Patologiczne cechy tego modelu obejmują przerwanie lub owrzodzenie bariery nabłonkowej, rekrutację granulocytów i ciężki obrzęk13. Alternatywnie, zakażenie mutantem S. Typhimurium ΔAroA klasy szczepionki prowadzi do przewlekłej kolonizacji jelita ślepego i okrężnicy, która utrzymuje się do 40 dnia po zakażeniu14. Szczep S. Typhimurium ΔAroA ma defekt w biosyntezie aminokwasów aromatycznych; To sprawia, że zmutowany szczep staje się awirulentem i może być wykorzystany jako wysoce skuteczna szczepionka15. Infekcja jamy ustnej u myszy prowadzi do odpowiedzi zapalnej związanej z cytokinami Th1 i Th17, rozległej przebudowy tkanek i odkładania kolagenu. Patologia tkanek jest związana z podwyższonym poziomem czynnika pro-fibrotycznego, takiego jak TGF-β1, CTGF i IGF14. Bliznowacenie zwłóknieniowe transmuralne zgłoszone w tym modelu przypomina zwężenia często obserwowane w IBD. Indukcja zwłóknienia przez Salmonellę wymaga zjadliwości kodowanej przez wyspy patogeniczności Salmonelli (SPI)-1 i 2 12. Co ważne, ten model infekcji S. Tymphimurium ΔAroA jest użytecznym systemem do badania odpowiedzi zwłóknieniowych u zmutowanych myszy utrzymywanych na tle C57/Bl6. Szczep C57/Bl6 jest niezwykle wrażliwy na zakażenie S. Typhiumurim SL1344 z powodu mutacji powodującej utratę funkcji w genie kodującym naturalne białko makrofagów związane z opornością (NRAMP)-116,17. Odkryliśmy, że wrodzone komórki limfoidalne zależne od IL-17A i RORα są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do patogenezy w tym modelu18.
Głównym powikłaniem CD jest rozregulowane i nadmierne odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), w tym kolagenu2,19. Chociaż przewód pokarmowy ma stosunkowo dużą zdolność do regeneracji, zwłóknienie bliznowacenia może powstać z powodu nierozwiązanych reakcji gojenia się ran, które są związane z przewlekłym i ciężkim stanem zapalnym20,21. W przypadku CD powoduje to szkodliwy wpływ na architekturę tkanki, prowadząc do znacznego upośledzenia narządów21,22. Przezścienny charakter stanu zapalnego obserwowanego w CD ostatecznie poprzedza pogrubienie ściany jelita związane z objawowym zwężeniem lub powstawaniem zwężeń21. Około jedna trzecia pacjentów z CD wymaga resekcji jelita z powodu tego powikłania22. Nie ma skutecznych terapii przeciwzwłóknieniowych w IBD, biorąc pod uwagę, że stosowanie leków immunosupresyjnych, takich jak azatiopryna lub leki biologiczne anty-TNFα, nie ma wpływu lub tylko nieznacznie zmniejsza zapotrzebowanie na interwencje chirurgiczne19,23. Podczas gdy zwłóknienie jest uważane za konsekwencję przewlekłego stanu zapalnego, komórki pochodzenia mezenchymalnego, takie jak fibroblasty i perycyty, są uważane za główne komórkowe źródła ECM w bliznowaceniu zwłóknieniowym21,24. Przewlekłe zakażenie S. Typhimurium ΔAroA to solidny mysi model zwłóknienia jelit, który może dostarczyć informacji na temat patogenezy cech podobnych do CD.

<table><tbody><tr><td>2 ml okrągłe dno sejf z zamkiem</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z dużym otworem</td><td>Fisher</td><td>2707134</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Płytki megablokowe</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>Igły do zgłębników</td><td>FST</td><td>18061-22</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Młynek miksujący</td><td>Retsch</td><td>MM</td><td></td></tr></tbody></table>

przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem salmonellą

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Zwłóknienie tkanek charakteryzujące się patologiczną akumulacją macierzy zewnątrzkomórkowej, takiej jak kolagen, jest wynikiem uporczywego stanu zapalnego i rozregulowanej naprawy. W nieswoistym zapaleniu jelit (IBD) zwłóknienie prowadzi do nawracających zwężeń, dla których nie ma skutecznej terapii innej niż resekcja chirurgiczna. Ze względu na jego późny początek, procesy napędzające zwłóknienie są mniej zbadane i w dużej mierze nieznane. Dlatego powikłania zwłóknieniowe stanowią poważne wyzwanie w IBD. W tym protokole opisano solidny model zwłóknienia jelit in vivo, w którym wstępne leczenie streptomycyną myszy C57Bl / 6, a następnie zgłębnik doustny mutantem Salmonella Typhimurium ΔAroA klasy szczepionkowej prowadzi do trwałej kolonizacji patogenu i zwłóknienia jelita ślepego. Wyjaśniono metodologie przygotowania S. Typhimurium ΔAroA do inokulacji, ilościowego określania ładunków patogenów w jelicie ślepym i śledzionie oraz oceny odkładania się kolagenu w tkankach jelitowych. Ten eksperymentalny model choroby jest przydatny do badania czynników gospodarza, które albo nasilają, albo nasilają zwłóknienie jelit podobne do CD.

Leczenie streptomycyną, a następnie infekcja doustna szczepem S. Typhimurium ΔAroA prowadzi do silnego stanu zapalnego jelit i włóknienia, szczególnie w kątnicy (Rysunek 1). U zainfekowanych zwierząt można odzyskać typowe obciążenia patogenami rzędu 108 do 109 CFU na 1 g kątnicy oraz 104 CFU na 1 g śledziony (Rysunek 2). Ocena włóknienia w przekrojach kątnicy barwionych czerwienią picrosirius wskazuje na szczyt włóknieni...

Ten protokół opisuje mysi model zwłóknienia jelit wywołanego przez Salmonellę, który przypomina kluczowe patologiczne cechy choroby Leśniowskiego-Crohna, w tym przezścienne zapalenie i zwłóknienie. Metoda ta może być stosowana do oceny czynników gospodarza, które zmieniają wyniki zwłóknienia przy użyciu zmutowanych myszy utrzymywanych na tle genetycznym C57Bl/6.

Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Zwłóknienie tkanek jest podstawowym sposobem, w jaki narządy zawodzą z czasem, w odpowiedzi na przewlekły stan zapalny lub starzenie się. I rzeczywiście, twierdzę, że jeśli nie umrzesz z powodu czynnika zakaźnego lub raka, prawdopodobnie umrzesz z powodu zwłóknienia narządów wraz z wiekiem. Niestety, nie ma zbyt wielu świetnych modeli myszy, które naśladowałyby zwłóknienie tkanek ludzkich.Opracowaliśmy mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna, choroby ludzkiej, która powoduje zwłóknienie jelit i jest w dużej mierze nieuleczalna. W rzeczywistości jedynym sposobem, w jaki można go leczyć, jest chirurgiczne usunięcie tkanki zwłóknienia i ponowne podwiązanie jelita. Zaletą naszego modelu jest to, że jest on w pełni penetrujący we wszystkich szczepach myszy i bardzo ściśle naśladuje ludzką chorobę Leśniowskiego-Crohna, a zwłóknienie utrzymuje się przez ponad miesiąc, co jest naprawdę solidnym modelem.Najtrudniejszą częścią tej procedury jest obchodzenie się z myszami, a zwłaszcza z łąbkiem jamy ustnej, ponieważ wymaga to dużej praktyki, specjalnej certyfikacji. Wykonując tę procedurę po raz pierwszy, należy mieć świadomość, że praca z Salmonellą wymaga odpowiednich środków ostrożności i

chronic-salmonella-infection-induced-intestinal-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Utworzenie chronicznego modelu mysiego z infekcją bakteryjną z trwałą kolonizacją jelit przez Salmonella typhimurium przez 27 tygodni.

Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Źródło: Lo, B. C. i in. Przewlekła infekcja salmonellą wywołana włóknieniem jelit. J. Vis. Exp. (2019)Film demonstruje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego w mysiim modelu przewlekłej infekcji streptomycynowooporną Salmonella typhimurium. Po eutanazji i sterylnej sekcji pobierane są tkanki cekalne i śledzionowe, ujednolicane stalowymi kulkami w celu uwalniania bakterii i seryjne rozcieńczane. Rozcieńczenia nakładane są na selektywnym agarze, a widoczne kolonie są liczone w celu...

Ilościowa ilościowa ilość obciążenia bakteryjnego tkanki w modelu myszy przewlekłej infekcji jelit

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Zakłócenie przepływu żółci powoduje ciężkie zapalne cholestatyczne uszkodzenie wątroby z charakterystyczną, zależną od czasu sekwencją zmian morfologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół chirurgicznego podwiązania przewodu żółciowego wspólnego u myszy, który pozwala na wywołanie silnej odpowiedzi zwłóknieniowej po 21 do 28 dniach.

Podwiązanie dróg żółciowych u myszy: indukcja zapalnego uszkodzenia wątroby i zwłóknienia przez chalestazę obturacyjną

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Obecny protokół opisuje rozwój podobnego do choroby Leśniowskiego-Crohna modelu zapalenia jelita grubego u gryzoni. Zapalenie przezścienne prowadzi do zwężenia w miejscu wkroplenia TNBS, a powiększenie mechaniczne obserwuje się w segmencie bliższym zwężeniu. Zmiany te pozwalają na badanie naprężeń mechanicznych w zapaleniu jelita grubego.

Model gryzoni indukowany przez TNBS do badania patogennej roli stresu mechanicznego w chorobie Leśniowskiego-Crohna

Ten protokół opisuje indukcję monobakteryjnej sepsy Gram-ujemnej w systemie mysim. Model jest przydatny w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza podczas sepsy.

Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Protokół ten pokazuje, jak model myszy zawierający domenę homologii 2 zawierający domenę 5'-inozytol fosfatazy (SHIP) niedoborowy dla zapalenia i włóknienia kości typu Leśniowskiego-Crohna (CD) podobnego do choroby Leśniowskiej (CD) może być wykorzystywany do testowania nowych terapii dla CD.

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

Poznaj model mysiego zwłóknienia jelit wywołanego zakażeniem Salmonellą Typhimurium, który naśladuje chorobę Leśniowskiego-Crohna. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów fibrozy i potencjalnych celów terapeutycznych.

Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

Przeglądaj więcej filmów