Name: Kwantyfikacja koenzymu A w komórkach i tkankach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji koenzymu A w komórkach i tkankach przy użyciu chromatografii cieczowej. Technika ta umożliwia niezawodne pomiary metabolizmu komórkowego w badaniach biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie sponsorowanych badań prowadzonych przez CoA Therapeutics, Inc., spółkę zależną BridgeBio LLC, GM34496 grantów National Institutes of Health oraz American Libańsko-Syryjskie Organizacje Charytatywne.

Procedura na zwierzętach, o której mowa w tym protokole, została przeprowadzona zgodnie z protokołami 323 i 556 i specjalnie zatwierdzona przez St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowanie roztworów
UWAGA: Używaj ultraczystej wody do wszystkich roztworów i gdy jest to określone w procedurach.
<ol>
	<li>Przygotuj 1 mM wodorotlenku potasu (KOH) w wodzie.</li>
	<li>Przygotować 0,25 M KOH w wodzie.</li>
	<li>Przygotuj 1 M Trizma-HCl w wodzie i dostosuj do pH 8,0.</li>
	<li>Przygotować 100 mM monobromobimanu (mBBr) w acetonitrylu (Optima Grade). Roztwory podstawowe mBBr są stabilne w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy, pod warunkiem, że są przechowywane w ciemności, ponieważ ekspozycja na światło może fotolizować monobromobiman do bimane26.</li>
	<li>Przygotować bufor płuczący do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) kolumna: 50% metanol (Optima Grade) + 2% kwas octowy.</li>
	<li>Przygotować bufor elucyjny do kolumny SPE: 95% etanol (klasa HPLC) zawierający 50 mM mrówczanu amonu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wzorca CoA-bimane
<ol>
	<li>Kup wysokiej jakości wzorzec CoA z renomowanego źródła (np. Avanti Polar Lipids, Inc.).</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy CoA o wysokim stężeniu w 20 mM Tris, pH 8. Ilość CoA w wsadzie o wysokim stężeniu określa się lub potwierdza za pomocą absorbancji spektrofotometrycznej przy λ260 nm (Ɛ = 16 800 M-1∙cm-1). Dodaj 4-krotny molowy nadmiar mBBr; Wir na wysokim poziomie przez 10 s. Na przykład dla 10 mM CoA w buforze dodaj 40 mM mBBr. Mbbr dodaje się w nadmiarze, aby zapewnić, że cały CoA jest derywatyzowany.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w ciemności bez wstrząsania w celu uzyskania CoA z mBBr. mBBr reaguje z grupą tiolową CoA i jest zależny od pH i temperatury27. Dodanie mBBr przekształca CoA w rozpuszczalny w wodzie fluorescencyjny (lub absorbent ultrafioletowy) CoA-bimane (CoA-bimane; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Dodaj 100 μl kwasu octowego i wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Wirować przy 2 000 x g przez 15 minut, aby usunąć wszelkie środki strącające.</li>
	<li>Oczyścić supernatant za pomocą kolumny SPE w celu usunięcia nieprzereagowanego mBBr (opisanego poniżej). Filtracja i odwirowanie eluatu nie jest konieczne po oczyszczeniu kolumny SPE (sekcja 5.8).</li>
	<li>Zebrać eluat z kolumny SPE zawierającej CoA-bimane do wstępnie zważonej probówki, wysuszyć w gazowym azocie, zważyć i skonstruować wzorcową krzywą kalibracyjną ze znanymi ilościami CoA-bimane.
	<ol>
		<li>Sprawdzić wzorzec CoA-bimane pod względem czystości za pomocą HPLC (patrz poniżej) z detekcją absorbancji zarówno w λ260 (ugrupowanie adeninowe), jak i λ393 (ugrupowanie bimanowe) oraz zbieżnością obu pików w chromatogramie.</li>
		<li>Potwierdzić ilość wzorca CoA-bimane w wsadzie o wysokim stężeniu, używając λ260 nm (Ɛ = 16 800 M-1∙cm-1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarejestrować czas retencji HPLC w celu identyfikacji CoA-bimane w próbkach doświadczalnych przy użyciu wzorca CoA-bimane.</li>
	<li>Podwielokrotności surowca o wysokim stężeniu wzorca CoA-bimane należy przechowywać w sposób chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat. Unikaj wielokrotnego rozmrażania i ponownego zamrażania.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja i derywatyzacja CoA w hodowanych komórkach
<ol>
	<li>Zbierz przylegające komórki w hodowli, gdy zbliżasz się do późnych gęstości subkonfluencji. Na przykład ludzkie komórki HepG2 / C3A są hodowane do gęstości 6-8 x 106 lub komórki HEK 293T są hodowane do gęstości ~ 1,3 x 107 na 100 mm szalki.
	<ol>
		<li>Rutynowo używaj zduplikowanych lub potrójnych kultur do oznaczania CoA. Inkubować oddzielne szalki hodowlane równolegle z kulturami komórek próbki, aby określić liczbę komórek żywotnych. Obliczyć ilość CoA na 10 6-10 7 komórek po oczyszczeniu HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia. Szybko umyj komórki na naczyniu lodowatą solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki i odessać PBS z naczynia. Szybko umyj komórki lodowatą wodą, aby usunąć resztki PBS i szybko odessać wodę z naczynia. Unikaj naruszania przylegających komórek podczas dodawania PBS lub wody.</li>
	<li>Dodaj 1 ml lodowatej wody do naczynia hodowlanego. Zeskrob komórki do zimnej wody w naczyniu i przenieś zawiesinę komórek do szklanej probówki zawierającej 400 μl 0,25 M KOH i 1,5 ml wody.
	<ol>
		<li>Mieszaninę energicznie mieszać wirem na wysokich obrotach przez 10 s. Następnie szczelnie przykryć folią parafinową i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę bez wstrząsania w łaźni wodnej. Odczyn pH próbki powinien wynosić ≥ 12. Wysokie pH jest ważne dla hydrolizy tioestrów CoA i w razie potrzeby można je dostosować za pomocą dodatkowych porcji KOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać wyhodowane komórki rosnące w zawiesinie przez odwirowanie z małą prędkością: 136 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć raz lodowatym PBS, następnie krótko przemyć ponownie zimną wodą, a na koniec ponownie zawiesić w 2,5 ml zimnej wody plus 400 μl 0,25 M KOH. Wymieszać energicznie i inkubować w temperaturze 55 °C, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Dodać 160 μl 1 M Trizma-HCl i 10 μL 100 mM mBBr i mieszać wirowo na wysokich obrotach przez 10 s. To sprawia, że pH wynosi około 8, aby wspomóc reakcję mBBr z wolnym CoA. Przykryć próbki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemności, aby mBBr zareagował z tiolem CoA.</li>
	<li>Dodać 100 μl kwasu octowego i mieszać wirowo na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję</li>
	<li>Wirować przy 2 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia wytrąconych resztek komórek.</li>
	<li>Usuń i zachowaj supernatant w szklanej probówce w celu oczyszczenia kolumny SPE, która jest opisana poniżej.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja i derywatyzacja CoA w tkankach
<ol>
	<li>Rozciąć kawałki tkanek zwierzęcych o średnicy około 0,5 cm lub mniejszej i krótko osuszyć (1-2 s) na bibule chłonnej, a następnie błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia. CoA w tkankach jest hydrolizowany lub przekształcany w tioester, jeśli nie jest zamrażany błyskawicznie. Ten krok jest ważny, aby uzyskać maksymalną wydajność CoA w tkankach.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem analizy należy szybko zważyć zamrożone fragmenty tkanek (5–60 mg) i zanotować masę każdej próbki. To oznaczenie mokrej masy stosuje się do obliczenia zawartości CoA po oczyszczeniu metodą HPLC. Unikaj całkowitego rozmrożenia kawałków tkanki.</li>
	<li>Dodać 2 ml 1 mM KOH do szklanej probówki (np. jednorazowej 13 mm x 100 mm) przeznaczonej do wprowadzenia sondy i rozerwania tkanki za pomocą homogenizatora wirnik-stojan. Trzymaj probówkę na lodzie do czasu użycia. Ma to na celu zapewnienie, że próbki są homogenizowane w niskiej temperaturze, a CoA nie ulega zniszczeniu z powodu ciepła wytwarzanego podczas homogenizacji.</li>
	<li>Przenieść i homogenizować tkankę (30 – 40 mg) w szklanej probówce (zawierającej zimny 1 mM KOH) przez 30 s. Unikać całkowitego rozmrożenia tkanki.</li>
	<li>Dodać 500 μl 0,25 M KOH; wirować na wysokich obrotach przez 10 s i trzymać na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane. Spowoduje to podbicie próbki powyżej 12 w celu hydrolizy tioestrów CoA w celu uzyskania całkowitego CoA (wolne CoA + hydrolizowane tioestry CoA).</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 godziny w łaźni wodnej bez wstrząsania w celu podtrzymania hydrolizy.</li>
	<li>Dodać 150 μl 1 M Trizma-HCl i 10 μL 100 mM mBBr; wirować na wysokich obrotach przez 10 sekund. To sprawia, że pH wynosi około 8, aby wspierać reakcję mBBr z wolnym CoA.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemności, aby upewnić się, że cały CoA jest derywatyzowany za pomocą mBBr.</li>
	<li>Dodać 100 μl kwasu octowego i wirować na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Wirować przy 2,000 x g przez 15 minut, aby osadzać wytrącone resztki komórek.</li>
	<li>Usuń i zachowaj supernatant w szklanej probówce w celu oczyszczenia kolumny SPE (opisanej poniżej).</li>
</ol>
5. Oczyszczanie próbki za pomocą kolumny do ekstrakcji do fazy stałej (SPE)
<ol>
	<li>W temperaturze pokojowej zrównoważyć każdą jednorazową kolumnę z żelem krzemionkowym 2-(2-pirydylo)-etylowym (o pojemności 1 ml) z 1 ml buforu do mycia, aby upewnić się, że pirydylowa grupa funkcyjna jest protonowana i będzie działać jako wymieniacz anionowy. Żel z krzemionki 2-(2-pirydylo)-etylowej jest słabym wymieniaczem anionowym, który jest idealny dla CoA-bimane przy zasadowym pH. Żel krzemionkowy 2-(2-pirydylo)-etylowy ma pKa 6, a elucja odbywa się pH ≥ Rozdział 7.</li>
	<li>Dodać supernatant próbki (krok 4.11) do kolumny i zebrać eluat.</li>
	<li>Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml buforu do przemywania w celu usunięcia wszelkich niezatrzymanych gatunków.</li>
	<li>Przemyć kolumnę raz 1 ml wody.</li>
	<li>Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml buforu elucyjnego do oddzielnej szklanej probówki (12 mm x 75 mm) w celu zebrania CoA-bimane.</li>
	<li>Wysuszyć próbkę CoA-bimane w probówce pod gazowym azotem do sucha. Wysuszona próbka jest stabilna w temperaturze pokojowej do czasu dalszego wykorzystania. Zamknij i całkowicie przykryj tubę i przechowuj.</li>
	<li>Gdy próbka jest gotowa do analizy HPLC, należy ponownie zawiesić ją w 300 μl wody i energicznie mieszać wirem na wysokich obrotach przez 10 sekund.</li>
	<li>Przenieść zawieszoną próbkę do filtra probówkowego wirówkowego (octan celulozy 0,22 μm, wielkość 2 ml) i wirować przy 5 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich środków strącających.</li>
	<li>Przefiltrowaną próbkę przenieść do szklanej fiolki nadającej się do wstrzykiwania metodą HPLC.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie i pomiar CoA-bimane metodą HPLC
<ol>
	<li>Przygotuj. Bufor A: 50 mM KH2PO4, pH 4,6; Bufor B: acetonitryl (stopień optima).</li>
	<li>Włącz system HPLC. 
	UWAGA: System HPLC w naszym laboratorium to moduł separacji Waters e2695 wyposażony w detektor absorbancji 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) oraz detektor fluorescencji 2475 sterowany za pomocą oprogramowania Empower 3. System posiada również automatyczny wtryskiwacz próbek.</li>
	<li>Wstrzyknąć każdą próbkę (np. 20 μl) w celu rozdzielenia na kolumnę Gemini C18, 3 μm 100 A, 4,6 mm x 150 mm przy użyciu programu w tabeli 1 przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min. Temperatura kolumny wynosi 25 °C. Zmierzyć absorbancję detektora UV/światła widzialnego przy λ393 nm, a detekcję fluorescencyjną przy λex = 393 nm, λem = 470 nm. Czas retencji określa się, przeprowadzając wzorcową krzywą CoA-bimane przed każdym zestawem próbek.</li>
	<li>Zapisać obszar pod pikiem CoA-bimane dla każdej próbki i porównać z krzywą wzorcową w celu obliczenia pmol CoA-bimane wstrzykniętego do kolumny HPLC. Krzywa wzorca absorbancji CoA-bimane jest stosowana do próbek tkanek, a krzywa wzorca fluorescencji CoA-bimane jest używana do próbek kultur tkankowych.</li>
	<li>Ponieważ wartości CoA-bimane reprezentują całkowity CoA dla każdej próbki, znormalizuj do liczby żywotnych komórek dla próbek hodowlanych lub mg mokrej masy dla próbek tkanek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6). Alternatywnie należy obliczyć całkowite wartości CoA po normalizacji zawartości DNA lub białka dla każdej próbki. Zawartość DNA lub białka można oznaczyć oddzielnie za pomocą podwielokrotności próbki, które są usuwane podczas przygotowywania próbki przed dodaniem KOH.</li>
</ol>

<ol><li>Abiko, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbiko%2C+Y+%22Metabolic+Pathways%22">Metabolic Pathways</a>. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).</li>
<li>Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A%3A+Back+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li>
<li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li>
<li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pantothenate+kinase+gene+%28PANK2%29+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li>
<li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li>
<li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107(2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li>
<li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li>
<li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871(2012).</li>
<li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li>
<li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013(2015).</li>
<li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li>
<li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399(2018).</li>
<li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104(2017).</li>
<li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-4%27-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260(2017).</li>
<li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+Supplements%22%5BJournal%5D)">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li>
<li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li>
<li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li>
<li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li>
<li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isolation+procedure+for+short-%2C+medium-%2C+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li>
<li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li>
<li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanes+.17.+%28Haloalkyl%29-1%2C5-Diazabicyclo%5B3.3.0%5DOctadienediones+%28Halo-9%2C10-Dioxabimanes%29+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol%2C+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li>
<li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).</li>
<li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toyoda+A%2CChohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li>
<li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A%2C+dephospho-coenzyme+A%2C+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li>
<li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li>
</ol>

MWF, CS i SJ napisali artykuł, MWF i CS dostarczyli dane i liczby, COR zaprojektował eksperymenty i krytycznie zrecenzował manuskrypt. SJ i COR są wynalazcami w oczekującym zgłoszeniu patentowym (PCT/US17/39037) "Małocząsteczkowe modulatory kinaz pantotenianowych" posiadanym przez St. Jude Children's Research Hospital, który obejmuje związek PZ-2891, o którym mowa w tym artykule.

W tym miejscu demonstrujemy wiarygodną procedurę oznaczania ilościowego całkowitego CoA w komórkach i tkankach zwierzęcych krok po kroku z szerokim zakresem detekcji liniowej, która jest dostępna w wielu laboratoriach wyposażonych w HPLC z detektorem wyjściowym absorbancji lub fluorescencji. Alternatywnie, spektrometria mas jest powszechną techniką oceny CoA i tioestrów CoA, ale nie jest powszechnie dostępna ze względu na koszt oprzyrządowania i specjalistyczną wiedzę wymaganą do opracowania metodologii i interpretacji d...

Koenzym A (CoA) jest niezbędnym kofaktorem we wszystkich żywych organizmach i jest syntetyzowany z kwasu pantotenowego, zwanego również pantotenianem (sól kwasu pantotenowego) lub witaminą B5. CoA jest głównym wewnątrzkomórkowym nośnikiem kwasów organicznych, w tym kwasów krótkołańcuchowych, takich jak octan i bursztynian, kwasów rozgałęzionych, takich jak propionian i metylomalonian, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, takich jak palmitynian i oleinian, bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, takich jak wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ksenobiotyków, takich jak kwas walproinowy. Kwas organiczny tworzy enzymatyczne wiązanie tioestrowe z CoA, aby umożliwić jego wykorzystanie jako substratu w ponad 100 reakcjach w metabolizmie pośrednim1. Tioestry CoA są również regulatorami allosterycznymi i aktywatorami transkrypcji. Teraz docenia się2 że całkowita podaż CoA w komórkach jest regulowana3,4; w związku z tym dostępność CoA może być ograniczona, a niedobory CoA mogą być katastrofalne, czego przykładem są dziedziczne zaburzenia genetyczne, które wpływają na biosyntezę CoA5. Kinaza pantotenianowa katalizuje pierwszy etap biosyntezy CoA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1), a neurodegeneracja związana z kinazą pantotenianową, zwana PKAN, jest spowodowana mutacjami w genie PANK2 <klasa sup = "xref">6. Syntaza CoA, kodowana przez gen COASYN, katalizuje ostatnie dwa etapy biosyntezy CoA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1), a neurodegeneracja związana z białkiem COASY, zwana CoPAN, jest spowodowana mutacją w genie COASYN 7. Zarówno PKAN, jak i CoPAN są dziedzicznymi chorobami neurodegeneracyjnymi związanymi z akumulacją żelaza w mózgu i niedoborami CoA leżącymi u podstaw patologii chorobowych.
Poziomy komórkowe całkowitego CoA różnią się między tkankami8 i całkowite CoA mogą wzrastać lub zmniejszać się w różnych stanach fizjologicznych, patologicznych i farmakologicznych. Poziom CoA w wątrobie wzrasta podczas przechodzenia ze stanu podawanego na czczo 9, a poziom CoA w wątrobie jest nienormalnie wysoki u otyłych myszy z niedoborem leptyny10. Stężenie CoA w wątrobie zmniejsza się w odpowiedzi na przewlekłe spożycie etanolu11. Poziomy CoA w mózgu w mysim modelu z nokautem Pank2 są obniżone w okresie okołoporodowym, ale później, w stadium dorosłym, zawartość CoA w mózgu jest równoważna poziomom typu dzikiego, co wskazuje na adaptacyjną reakcję CoA podczas rozwoju12. Manipulowanie zawartością CoA w tkance za pomocą metod transgenezy lub dostarczania genów wpływa na funkcje metaboliczne i neuronalne13,14,15. Przedkliniczny rozwój potencjalnych terapii PKAN lub CoPAN obejmuje pomiary CoA komórek lub tkanek jako wskaźniki skuteczności16,17,18,19,20. Ocena wszystkich tych warunków i ich metabolicznych lub funkcjonalnych konsekwencji wymaga ilościowej metody pomiaru całkowitego CoA.
Dokładny, wiarygodny test do pomiaru CoA w próbkach biologicznych jest technicznym wyzwaniem w wielu laboratoriach. Niestety, nie ma dostępnych sond do oceny lub ilościowego oznaczania CoA lub tioestrów CoA w nienaruszonych komórkach, chociaż analogi naturalnych tioestrów CoA były szeroko stosowane jako sondy mechanistyczne w badaniach estrów CoA z wykorzystaniem enzymów21. Konwersja CoA, z ugrupowaniem wolnego sulfhydrylu (-SH), do tioestru CoA (lub odwrotnie) jest szybka w komórkach lub tkankach zwierzęcych podczas przenoszenia do innego środowiska i podczas lizy komórek. Liczne syntetazy acylo-CoA i tioesrazy acylo-CoA w komórkach pośredniczą w wzajemnych konwersjach w puli CoA, a dodatkowe enzymy, które wykorzystują tioestry CoA jako substraty, pozostają aktywne w próbkach biologicznych do czasu schłodzenia środkami chemicznymi lub fizycznymi. Odciążanie grup acylowych z CoA do karnityny przez acylotransferazy jest jednym z przykładów w sieci reakcji, które mogą zmienić rozkład tioestrów CoA / CoA. Znaczniki radioaktywne mogą być używane do pomiaru szybkości syntezy CoA w komórkach. Obecne metody pomiaru CoA i pochodnych CoA w próbkach biologicznych zostały poddane przeglądowi22 i obejmują sprzężone testy spektrofotometryczne enzymatyczne, wysokociśnieniową chromatografię cieczową i procedury oparte na spektrometrii mas. Jednak metody te często koncentrują się na konkretnych gatunkach molekularnych CoA i są ślepe na zmienność całkowitej puli CoA. Sprzężone testy enzymatyczne na ogół wymagają większych ilości materiału wejściowego ze względu na niską czułość wykrywania i mają ograniczony zakres liniowości.
Nasze laboratorium opracowało niezawodną procedurę oznaczania całkowitej zawartości CoA w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych. Strategia obejmuje hydrolizę wszystkich tioestrów CoA w celu uzyskania tylko wolnego CoA podczas przygotowywania próbki, a nie podejmowanie wysiłków w celu utrzymania i analizy całego spektrum gatunków CoA. Procedura jest kompilacją indywidualnych opublikowanych metod przygotowania próbki, derywatyzacji CoA, oczyszczania i identyfikacji po wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz kwantyfikacji derywatyzowanego CoA przez absorbancję lub detekcję fluorescencji23,24,25. Oznaczenia CoA uzyskane przy użyciu tej procedury umożliwiły nam zrozumienie regulacji CoA i opracowanie podejścia terapeutycznego do leczenia niedoborów CoA.

<table><tbody><tr><td>Żel krzemionkowy 2-(2-pirydylo)-etylowy Kolumna SPE</td><td>Millipore-Sigma</td><td>54127-U</td><td></td></tr><tr><td>koenzym A</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870700</td><td></td></tr><tr><td>Gemini C18 3 &mu; m 100 i Aring; Kolumna HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>monobromobiman</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Omni-Tip zakłócacz tkanek</td><td>Omni International</td><td>32750H</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 125 zmotoryzowany homogenizator stojana wirnika</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0530997</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X filtr probówkowy wirówkowy</td><td>CoStar</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Fisher</td><td>T395-1</td><td></td></tr><tr><td>Detektor fluorescencyjny Waters 2475</td><td>Wody</td><td>2475</td><td></td></tr><tr><td>Wody 2489 Detektor UV-Vis</td><td>Wody</td><td>2489</td><td></td></tr><tr><td>Wody E2695 Moduł separacyjny</td><td>Wody</td><td>e2695</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja koenzymu a w komórkach i tkankach

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Pojawiające się badania wykazały, że dostarczanie komórkowego koenzymu A (CoA) może stać się ograniczające, co ma szkodliwy wpływ na wzrost, metabolizm i przeżycie. Pomiar komórkowego CoA jest wyzwaniem ze względu na jego stosunkowo niską liczebność i dynamiczną konwersję wolnego CoA do tioestrów CoA, które z kolei uczestniczą w licznych reakcjach metabolicznych. Opisano metodę, która pozwala ominąć potencjalne pułapki podczas przygotowywania próbki, aby uzyskać test o szerokim liniowym zakresie wykrywania, który jest odpowiedni do stosowania w wielu laboratoriach biomedycznych.

Opracowano stosunkowo szybką i niezawodną metodę wykrywania całkowitego poziomu CoA w hodowlach komórkowych i tkankach, polegającą na pochodnowieniu grupy tiolowej CoA za pomocą mBBr w celu uzyskania czynnika fluorescencyjnego, a następnie oczyszczaniu pochodnej CoA-bimanu za pomocą HPLC w fazie odwróconej. W pierwszej kolejności tworzona jest krzywa standardowa, w której poszczególnie wstrzykuje się znane i zwiększające się ilości standardu CoA-bimanu, a następnie nanosi pole pod szczytami na chromatogramach CoA-bimanu ...

Ta metoda opisuje przygotowanie próbki z hodowanych komórek i tkanek zwierzęcych, ekstrakcję i derywatyzację koenzymu A w próbkach, a następnie wysokociśnieniową chromatografię cieczową w celu oczyszczenia i kwantyfikacji derywatyzowanego koenzymu A poprzez absorbancję lub detekcję fluorescencji.

Kwantyfikacja koenzymu A w komórkach i tkankach

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Koenzym A, zwany w skrócie CoA, jest ważnym kofaktorem w metabolizmie komórkowym. Pomiary ilościowe ujawniają zmiany, które zachodzą w stanach odżywczych i hormonalnych w modelach zwierzęcych. Metoda ta określa ilościowo całkowitą ilość komórkowego CoA, w tym pochodnych CoA i wolnego CoA, w prostej, niezawodnej metodzie.Kilka rodzajów neurodegeneracji z akumulacją żelaza w mózgu jest związanych z mutacjami w genach szlaku biosyntezy CoA. Metodę tę można zastosować do dowolnego systemu biologicznego, ponieważ wszystkie organizmy potrzebują CoA do przetrwania, wzrostu i funkcjonowania. Początkujący badacz może mieć trudności z pierwszymi krokami w przygotowaniu próbki, gdzie ważne jest, aby próbki były absolutnie zimne, a następnie szybko przeniesione do wodorotlenku potasu.Ogranicz liczbę próbek w partii przed przeniesieniem do wodorotlenku potasu i przećwicz transfer przed rozpoczęciem pracy z próbkami eksperymentalnymi. Wielu badaczy nie jest zaznajomionych z ekstrakcją do fazy stałej w przygotowaniu próbek biologicznych do późniejszej analizy biochemicznej. Na początek inkubuj równolegle trzy szalki hodowlane, dwie do analizy biochemicznej i jedną do określenia liczby żywotnych komórek.Gdy hodowla zbliża się do późnych gęstości subkonfluencji, na przykład ludzkie komórki HepG2 / C3A wyhodowane do gęstości od sześciu do ośmiu razy 10 do sześciu lub komórki HEK 293T wyhodowane do gęstości około 1,3 razy 10 do siedmiu na 100-milimetrową szalkę, zbierają przylegające komórki w kulturze. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatej wody do tego samego naczynia hodowlanego. Zeskrob komórki do zimnej wody w naczyniu i przenieś zawiesinę komórek do szklanej probówki zawierającej 400 mikrolitrów 0,25-molowego wodorotlenku potasu i 1,5 mililitra wody, aby podnieść pH powyżej 12.Energicznie wymieszaj zawiesinę, wirując na wysokich obrotach przez 10 sekund. Następnie szczelnie przykryj folią parafinową i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę bez wstrząsania w łaźni wodnej. Następnie dodać 160 mikrolitrów jednomolowego roztworu chlorowodorku Trizma i 10 mikrolitrów 100-milimolowego mBBr.Mieszaj, wirując na wysokich obrotach przez 10 sekund. To podnosi pH do około ośmiu, aby wspierać reakcję mBBr z wolnym CoA. Przykryj probówkę folią parafinową i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w ciemności, aby mBBr zareagował z tiolem CoA.Po dwóch godzinach dodaj 100 mikrolitrów kwasu octowego i mieszaj przez wirowanie przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję. W rurze tworzy się osad. Następnie odwirować z prędkością 2 000 g przez 15 minut.Aby usunąć wytrącone resztki komórek, przenieś i zachowaj supernatant w szklanej probówce w celu oczyszczenia kolumny ekstrakcyjnej do fazy stałej. Przed rozpoczęciem analizy dodać dwa mililitry jednomilimolowego wodorotlenku potasu do szklanej probówki przeznaczonej do wprowadzenia sondy i rozerwania tkanki za pomocą homogenizatora wirnik-stojan. Trzymaj probówkę na lodzie do czasu użycia.Szybko zważyć zamrożone kawałki tkanki i zanotować mokrą masę każdej próbki. Przenieś tkankę do szklanej rurki i homogenizuj tkankę przez 30 sekund. Unikaj całkowitego rozmrożenia tkanki.Dodaj 500 mikrolitrów 0,25-molowego wodorotlenku potasu. Wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund i utrzymuj na lodzie. Powoduje to, że pH próbki przekracza 12 w celu hydrolizy tioestrów CoA w celu uzyskania całkowitego CoA.Przykryj rurkę folią parafinową. Przygotowanie hodowanych komórek i przygotowanie tkanek są najbardziej krytycznymi etapami tej procedury. Ważne jest, aby szybko dodać wysoki poziom wodorotlenku potasu, aby zapobiec degradacji CoA.Próbki inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny w łaźni wodnej bez wstrząsania w celu wsparcia hydrolizy. Następnie dodaj 150 mikrolitrów jednomolowego chlorowodorku Trizma i 10 mikrolitrów 100-milimolowego mBBr, aby doprowadzić pH do około ośmiu w celu wsparcia reakcji mBBr z wolnym CoA. Wir na haju przez 10 sekund.Przykryj probówkę folią parafinową i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w ciemności, aby upewnić się, że cały CoA jest derywatyzowany za pomocą mBBr. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kwasu octowego i wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję. Wirować przy 2 000 g przez 15 minut w celu osadzenia wytrąconych szczątków komórkowych i przenieść supernatant do szklanej probówki w celu oczyszczenia kolumny ekstrakcyjnej do fazy stałej.W temperaturze pokojowej zrównoważyć każdą jednomililitrową jednorazową kolumnę żelu krzemionkowego 2-2-pirydylo-etylowego z jednym mililitrem buforu do przemywania w celu zapewnienia, że pirydylowa grupa funkcyjna jest protonowana i będzie działać jako wymieniacz anionowy. Następnie odpipetować próbkę supernatantu na kolumnę i zebrać eluat. Przemyć kolumnę dwukrotnie jednym mililitrem buforu do przemywania i raz jednym mililitrem wody w celu usunięcia wszelkich niezatrzymanych gatunków.Następnie, do osobnej szklanej probówki, przemyć kolumnę dwukrotnie jednym mililitrem buforu elucyjnego, aby zebrać CoA-bimane. Wysuszyć próbkę CoA-bimane w probówce pod wpływem azotu. Zamknij, całkowicie przykryj probówkę i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Gdy próbka będzie gotowa do analizy HPLC, ponownie zawieś ją w 300 mikrolitrach wody i energicznie mieszaj, wirując na wysokich obrotach przez 10 sekund. Przenieść zawieszoną próbkę do filtra probówkowego wirówki i odwirować przy 5 000 g przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich środków strącających. Następnie przefiltrowaną próbkę przenieść do szklanej fiolki nadającej się do wstrzykiwań HPLC.W tym badaniu reprezentatywny profil HPLC pokazuje czas retencji wzorca CoA-bimane na kolumnie HPLC C18. Rosnące ilości wzorca CoA-bimane wstrzykiwano indywidualnie, a obszary pod pikami na chromatogramach CoA-bimane wykreślono jako funkcję wejściowego CoA-bimane. Krzywa standardowa odzwierciedlała wielkość absorbancji CoA-bimane przy długości fali 393 nanometrów.Fluorescencja CoA-bimane została również odzwierciedlona przy długości fali wzbudzenia 393 nanometrów i długości fali emisyjnej 470 nanometrów. Późniejsza separacja HPLC i typowe profile wykrywania wątroby myszy lub komórek C3A hodowanych przez człowieka są tutaj oznaczone czerwonymi pikami, z czasem retencji od 11 do 12 minut przy użyciu programu elucji. Jeśli reakcja z mBBr nie daje wykrywalnych wyników, może być konieczne dostosowanie ilości Trizma-HCl w celu obniżenia pH do około ośmiu.Możliwe jest wykrycie dodatkowych cząsteczek komórkowych, które zawierają ugrupowania sulfhydrylowe lub tioestrowe jako pochodne bimanu. Na przykład glutation-bimane można wykryć metodą HPLC. Technika ta pozwoli innym badaczom zbadać potencjalną rolę dysfunkcji CoA związanej z nierównowagą metaboliczną, takich jak zwierzęce modele cukrzycy typu 2.Badacze powinni stosować środki ochrony osobistej podczas pracy z rozpuszczalnikami organicznymi używanymi do ekstrakcji do fazy stałej.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę kwantyfikacji CO2 uwalnianego podczas utleniania substratu przy użyciu 14substratów znakowanych radioizotopem C. Uwolnione 14CO2 jest uwięzione w roztworze alkalicznym i oznaczane ilościowo za pomocą licznika scyntylacyjnego. Utlenianie różnych substratów różni się w zależności od tkanki i odzwierciedla stan patofizjologiczny tkanki.

Test utleniania substratu w hodowanych komórkach: Test in vitro do ilościowego określania utleniania substratu w komórkach poprzez pomiar sygnałów radioaktywnych z uwięzionego CO2

Ten film demonstruje technikę in vitro do oceny biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności. Technika ta łączy symulację trawienia człowieka wraz z wychwytem żelaza przez zróżnicowane komórki Caco-2. Wewnątrzkomórkowe tworzenie ferrytyny działa jako marker komórkowego wychwytu żelaza.

Test biologiczny komórek Caco-2: metoda in vitro do pomiaru biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności

Zmienione wewnątrzkomórkowe poziomy hemu są związane z powszechnymi chorobami, takimi jak rak. W związku z tym istnieje potrzeba pomiaru poziomu biosyntezy hemu w różnych komórkach. Celem tego protokołu jest zapewnienie szybkiej i czułej metody pomiaru i porównywania poziomów syntezy hemu w różnych komórkach.

Pomiar poziomu syntezy hemu w komórkach ssaków

Tutaj pokazujemy, że izolowane ludzkie płytki krwi mogą być używane jako dostępny model ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na inhibitor kompleksu I rotenon. Podejście to wykorzystuje śledzenie izotopowe i względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i może być stosowane w różnych projektach badawczych.

Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Test biologiczny komórek Caco-2 na biodostępność żelaza (Fe) stanowi opłacalne i wszechstronne podejście do oceny biodostępności Fe z żywności, produktów spożywczych, suplementów, posiłków, a nawet schematów dietetycznych. Dokładnie zwalidowany w badaniach na ludziach, reprezentuje stan wiedzy w zakresie badań nad biodostępnością Fe.

Test biologiczny komórek Caco-2 do pomiaru biodostępności żelaza w żywności

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.

Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

Poznaj metodę kwantyfikacji koenzymu A w komórkach i tkankach przy użyciu chromatografii cieczowej. Technika ta umożliwia niezawodne pomiary metabolizmu komórkowego w badaniach biochemicznych.

Kwantyfikacja koenzymu A w komórkach i tkankach

Przeglądaj więcej filmów