Kwantyfikacja koenzymu A w komórkach i tkankach
27 września 2019
Ta metoda opisuje przygotowanie próbki z hodowanych komórek i tkanek zwierzęcych, ekstrakcję i derywatyzację koenzymu A w próbkach, a następnie wysokociśnieniową chromatografię cieczową w celu oczyszczenia i kwantyfikacji derywatyzowanego koenzymu A poprzez absorbancję lub detekcję fluorescencji.
Koenzym A, zwany w skrócie CoA, jest ważnym kofaktorem w metabolizmie komórkowym. Pomiary ilościowe ujawniają zmiany, które zachodzą w stanach odżywczych i hormonalnych w modelach zwierzęcych. Metoda ta określa ilościowo całkowitą ilość komórkowego CoA, w tym pochodnych CoA i wolnego CoA, w prostej, niezawodnej metodzie.
Kilka rodzajów neurodegeneracji z akumulacją żelaza w mózgu jest związanych z mutacjami w genach szlaku biosyntezy CoA. Metodę tę można zastosować do dowolnego systemu biologicznego, ponieważ wszystkie organizmy potrzebują CoA do przetrwania, wzrostu i funkcjonowania. Początkujący badacz może mieć trudności z pierwszymi krokami w przygotowaniu próbki, gdzie ważne jest, aby próbki były absolutnie zimne, a następnie szybko przeniesione do wodorotlenku potasu.
Ogranicz liczbę próbek w partii przed przeniesieniem do wodorotlenku potasu i przećwicz transfer przed rozpoczęciem pracy z próbkami eksperymentalnymi. Wielu badaczy nie jest zaznajomionych z ekstrakcją do fazy stałej w przygotowaniu próbek biologicznych do późniejszej analizy biochemicznej. Na początek inkubuj równolegle trzy szalki hodowlane, dwie do analizy biochemicznej i jedną do określenia liczby żywotnych komórek.
Gdy hodowla zbliża się do późnych gęstości subkonfluencji, na przykład ludzkie komórki HepG2 / C3A wyhodowane do gęstości od sześciu do ośmiu razy 10 do sześciu lub komórki HEK 293T wyhodowane do gęstości około 1,3 razy 10 do siedmiu na 100-milimetrową szalkę, zbierają przylegające komórki w kulturze. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatej wody do tego samego naczynia hodowlanego. Zeskrob komórki do zimnej wody w naczyniu i przenieś zawiesinę komórek do szklanej probówki zawierającej 400 mikrolitrów 0,25-molowego wodorotlenku potasu i 1,5 mililitra wody, aby podnieść pH powyżej 12.
Energicznie wymieszaj zawiesinę, wirując na wysokich obrotach przez 10 sekund. Następnie szczelnie przykryj folią parafinową i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę bez wstrząsania w łaźni wodnej. Następnie dodać 160 mikrolitrów jednomolowego roztworu chlorowodorku Trizma i 10 mikrolitrów 100-milimolowego mBBr.
Mieszaj, wirując na wysokich obrotach przez 10 sekund. To podnosi pH do około ośmiu, aby wspierać reakcję mBBr z wolnym CoA. Przykryj probówkę folią parafinową i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w ciemności, aby mBBr zareagował z tiolem CoA.
Po dwóch godzinach dodaj 100 mikrolitrów kwasu octowego i mieszaj przez wirowanie przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję. W rurze tworzy się osad. Następnie odwirować z prędkością 2 000 g przez 15 minut.
Aby usunąć wytrącone resztki komórek, przenieś i zachowaj supernatant w szklanej probówce w celu oczyszczenia kolumny ekstrakcyjnej do fazy stałej. Przed rozpoczęciem analizy dodać dwa mililitry jednomilimolowego wodorotlenku potasu do szklanej probówki przeznaczonej do wprowadzenia sondy i rozerwania tkanki za pomocą homogenizatora wirnik-stojan. Trzymaj probówkę na lodzie do czasu użycia.
Szybko zważyć zamrożone kawałki tkanki i zanotować mokrą masę każdej próbki. Przenieś tkankę do szklanej rurki i homogenizuj tkankę przez 30 sekund. Unikaj całkowitego rozmrożenia tkanki.
Dodaj 500 mikrolitrów 0,25-molowego wodorotlenku potasu. Wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund i utrzymuj na lodzie. Powoduje to, że pH próbki przekracza 12 w celu hydrolizy tioestrów CoA w celu uzyskania całkowitego CoA.
Przykryj rurkę folią parafinową. Przygotowanie hodowanych komórek i przygotowanie tkanek są najbardziej krytycznymi etapami tej procedury. Ważne jest, aby szybko dodać wysoki poziom wodorotlenku potasu, aby zapobiec degradacji CoA.
Próbki inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny w łaźni wodnej bez wstrząsania w celu wsparcia hydrolizy. Następnie dodaj 150 mikrolitrów jednomolowego chlorowodorku Trizma i 10 mikrolitrów 100-milimolowego mBBr, aby doprowadzić pH do około ośmiu w celu wsparcia reakcji mBBr z wolnym CoA. Wir na haju przez 10 sekund.
Przykryj probówkę folią parafinową i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w ciemności, aby upewnić się, że cały CoA jest derywatyzowany za pomocą mBBr. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kwasu octowego i wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję. Wirować przy 2 000 g przez 15 minut w celu osadzenia wytrąconych szczątków komórkowych i przenieść supernatant do szklanej probówki w celu oczyszczenia kolumny ekstrakcyjnej do fazy stałej.
W temperaturze pokojowej zrównoważyć każdą jednomililitrową jednorazową kolumnę żelu krzemionkowego 2-2-pirydylo-etylowego z jednym mililitrem buforu do przemywania w celu zapewnienia, że pirydylowa grupa funkcyjna jest protonowana i będzie działać jako wymieniacz anionowy. Następnie odpipetować próbkę supernatantu na kolumnę i zebrać eluat. Przemyć kolumnę dwukrotnie jednym mililitrem buforu do przemywania i raz jednym mililitrem wody w celu usunięcia wszelkich niezatrzymanych gatunków.
Następnie, do osobnej szklanej probówki, przemyć kolumnę dwukrotnie jednym mililitrem buforu elucyjnego, aby zebrać CoA-bimane. Wysuszyć próbkę CoA-bimane w probówce pod wpływem azotu. Zamknij, całkowicie przykryj probówkę i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Gdy próbka będzie gotowa do analizy HPLC, ponownie zawieś ją w 300 mikrolitrach wody i energicznie mieszaj, wirując na wysokich obrotach przez 10 sekund. Przenieść zawieszoną próbkę do filtra probówkowego wirówki i odwirować przy 5 000 g przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich środków strącających. Następnie przefiltrowaną próbkę przenieść do szklanej fiolki nadającej się do wstrzykiwań HPLC.
W tym badaniu reprezentatywny profil HPLC pokazuje czas retencji wzorca CoA-bimane na kolumnie HPLC C18. Rosnące ilości wzorca CoA-bimane wstrzykiwano indywidualnie, a obszary pod pikami na chromatogramach CoA-bimane wykreślono jako funkcję wejściowego CoA-bimane. Krzywa standardowa odzwierciedlała wielkość absorbancji CoA-bimane przy długości fali 393 nanometrów.
Fluorescencja CoA-bimane została również odzwierciedlona przy długości fali wzbudzenia 393 nanometrów i długości fali emisyjnej 470 nanometrów. Późniejsza separacja HPLC i typowe profile wykrywania wątroby myszy lub komórek C3A hodowanych przez człowieka są tutaj oznaczone czerwonymi pikami, z czasem retencji od 11 do 12 minut przy użyciu programu elucji. Jeśli reakcja z mBBr nie daje wykrywalnych wyników, może być konieczne dostosowanie ilości Trizma-HCl w celu obniżenia pH do około ośmiu.
Możliwe jest wykrycie dodatkowych cząsteczek komórkowych, które zawierają ugrupowania sulfhydrylowe lub tioestrowe jako pochodne bimanu. Na przykład glutation-bimane można wykryć metodą HPLC. Technika ta pozwoli innym badaczom zbadać potencjalną rolę dysfunkcji CoA związanej z nierównowagą metaboliczną, takich jak zwierzęce modele cukrzycy typu 2.
Badacze powinni stosować środki ochrony osobistej podczas pracy z rozpuszczalnikami organicznymi używanymi do ekstrakcji do fazy stałej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ta metoda opisuje oznaczanie ilościowe koenzymu A (CoA) w próbkach biologicznych, w tym w hodowlach komórkowych i tkankach zwierzęcych. Obejmuje ona przygotowanie próbek, ekstrakcję oraz zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej w celu detekcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Metabolizm
Wstęp
- Koenzym A jest kluczowy dla metabolizmu komórkowego.
- Zmiany poziomu CoA są powiązane ze stanami żywieniowymi i hormonalnymi.
- Neurodegeneracja z akumulacją żelaza w mózgu jest związana z mutacjami w szlaku biosyntezy CoA.
- CoA jest niezbędny dla wszystkich organizmów.
Cel badania
- Aby określić ilość całkowitego komórkowego CoA, w tym jego pochodnych oraz wolnego CoA.
- Aby dostarczyć niezawodną metodę pomiaru poziomów CoA.
- Aby pomóc badaczom w technikach przygotowania próbek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek z hodowlanych komórek i tkanek zwierzęcych.
- Ekstrakcja i derywatyzacja koenzymu A.
- Wysokosprawna chromatografia cieczowa w celu oczyszczania.
- Detekcja poprzez pomiar absorbancji lub fluorescencji.
Główne wyniki
- Niezawodna kwantyfikacja CoA w różnych systemach biologicznych.
- Metoda stosowalna dla każdego organizmu wymagającego CoA.
- Wgląd w zmiany metaboliczne związane z poziomem CoA.
- Wytyczne dotyczące zachowania integralności próbek podczas przygotowania.
Wnioski
- Ta metoda upraszcza ilościowe oznaczenie CoA.
- Jest ona cenna w badaniach nad metabolizmem i neurodegeneracją.
- Utrzymanie niskich temperatur podczas przygotowywania próbek jest krytyczne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczanie koenzymu A (CoA) w komórkach i tkankach rozwiązuje krytyczny problem w analizie szlaków metabolicznych oraz walidacji modeli chorób. Niezawodna kwantyfikacja CoA umożliwiaB redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć oraz zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad chorobami metabolicznymi i neurodegeneracyjnymi. Zdolność ta jest niezbędna do selekcji projektów w portfolio oraz zapewnienia ciągłości translacyjnej w rurociągach badawczo-rozwojowych biofarmanaceutyków.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie spójności szlaków metabolicznych oraz funkcjonalną walidację celów terapeutycznych.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez kwantyfikację CoA w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w powiązywaniu dynamiki CoA z fenotypami istotnymi dla danej choroby.
Przesiew oraz opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane próbki biologiczne do dalszej analizy ilościowej.
- Standaryzuje warunki analizy w celu zapewnienia powtarzalności pomiaru CoA pomiędzy partiami.
- Dostarcza wyników ilościowych odpowiednich do przesiewowego badania modulatorów metabolicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla chorób, w tym z neurodegeneracją i zaburzeniami metabolicznymi.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od odkryć na poziomie komórkowym do walidacji w modelach zwierzęcych.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe oznaczenie biomarkerów metabolicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda ilościowego oznaczania CoA integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i rozwój translacyjnych biomarkerów.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia ilościowe odczyty do badania szlaków metabolicznych i testowania hipotez.
- Przesiewanie: Oferuje powtarzalne, zstandaryzowane wyniki do oceny związków w testach metabolicznych.
- Analityka: Dostarcza wiarygodne pomiary oparte na metodzie HPLC do porównywania różnych warunków i analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączy modele komórkowe i zwierzęce w celu uzgodnienia biomarkerów w badaniach nad chorobami.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia szeroko stosowalny schemat postępowania do ilościowego oznaczania CoA w różnorodnych systemach biologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność analiz CoA.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej analizy biomarkerów metabolicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację i rozwój programów badań nad chorobami metabolicznymi i neurodegeneracyjnymi.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest biegłość w przygotowaniu próbek oraz w analitycznych technikach opartych na metodzie HPLC.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury do ekstrakcji do fazy stałej oraz detekcji fluorescencyjnej lub absorbancyjnej.
- Niezbędna jest ścisła standaryzacja międzyzespołowa w zakresie obchodzenia się z próbkami i przeprowadzania analizy.
- Metoda jest dostosowana zarówno do hodowli komórkowych, jak i próbek tkanek, przy zachowaniu szczególnej uwagi na szybkie przetwarzanie i kontrolę temperatury.
- Zachowanie integralności próbek oraz kontrola pH są krytyczne dla zapobiegania degradacji CoA i zapewnienia wiarygodności analizy.
Najczęściej zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Extraction and Derivatization of CoA (Coenzyme A) in Cultured Cells
3:32
Extraction & Derivatization of CoA in Tissues
5:31
Sample Clean-up with Solid Phase Extraction Column
6:47
Results: HPLC Profiles and CoA-bimane Standard Curves
7:45
Conclusion
