Name: Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę biotuszowania pdECM do drukowania 3D konstruktów tkanki trzustkowej z izolowanymi wyspami. Technika zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej, poprawiając przeżywalność komórek i funkcjonalność dla terapii cukrzycy typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez program rozwoju technologii biologicznych i medycznych Narodowej Fundacji Badawczej (NRF), finansowany przez rząd koreański (MSIT) (2017M3A9C6032067) oraz "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) nadzorowany przez IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

Tkanki trzustki świni zostały pobrane z lokalnej rzeźni. Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Asan Medical Center w Seulu w Korei.
1. Decelularyzacja tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory do decelularyzacji. 
	UWAGA: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) stosowana we wszystkich preparatach roztworów jest rozcieńczana przez dodanie wody destylowanej do 10x PBS.
	<ol>
		<li>W przypadku 1% roztworu Triton-X 100 rozpuścić 100 ml 100% roztworu Triton-X 100 w 900 ml 1x PBS za pomocą mieszadła magnetycznego z mieszadłem z prędkością 150 obr./min przez 6 godzin. Przygotować 400 ml 1% roztworu Triton-X 100 z 40 ml 10% roztworu Triton-X 100 i 360 ml 1x PBS przygotowanego tuż przed użyciem. 
		UWAGA: 10% roztwór Triton-X 100 można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
		<li>W przypadku 0,1% roztworu kwasu nadoctowego rozcieńczyć 8,5 ml 4,7% kwasu nadoctowego w 22,8 ml 70% etanolu w 368,7 ml wody destylowanej tuż przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń tkanki obwodowe trzustki i pokrój tkankę przed decelularyzacją.
	<ol>
		<li>Umyj wyciętą trzustkę świni pod bieżącą wodą z kranu i usuń tkanki obwodowe za pomocą wysterylizowanych nożyczek.</li>
		<li>Przenieś trzustkę do plastikowej torby z kleszczami i zamrażaj w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, aby skutecznie przeciąć trzustkę do następnego etapu.</li>
		<li>Zamrożoną trzustkę pokrój na kawałki o grubości 1 mm za pomocą tarki.</li>
		<li>Przenieść 50 g pokrojonej chusteczki do plastikowego pojemnika o pojemności 500 ml. 
		UWAGA: W tym przypadku zaleca się plastikowy pojemnik z pokrywką, aby chronić tkanki przed zanieczyszczeniem i zapobiec parowaniu roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie odczynnikami. 
	UWAGA: Cały proces decelularyzacji należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C na cyfrowej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min. Na wszystkich etapach decelularyzacji wymagane jest fizyczne oderwanie za pomocą kleszczy, aby zapobiec sklejaniu się plastrów trzustki. Mycie pojemnika wodą destylowaną jest konieczne, aby całkowicie usunąć resztki odczynników z pojemnika.
	<ol>
		<li>Przed jakimkolwiek odczynnikiem należy przemyć 50 g pokrojonej trzustki w 300 ml wody destylowanej za pomocą shakera.</li>
		<li>Mieszać tkankę w sposób ciągły z prędkością 150 obr./min, aż mętna woda zniknie (po około 12 godzinach). Wodę destylowaną należy wymieniać co 2 godziny 
		UWAGA: Zaleca się wymianę wody destylowanej co godzinę, aby zapewnić skuteczność szybszego usuwania mętnej wody.</li>
		<li>Wylać wodę i potraktować 50 g tkanek 400 ml 1% Triton-X 100 w 1 roztworze PBS przez 84 godziny. Odświeżać roztwór co 12 godzin 
		UWAGA: W tym momencie ilość tkanki zmniejszy się, ponieważ składniki komórkowe zaczną być usuwane.</li>
		<li>Stosuj 400 ml izopropanolu (IPA) przez 2 godziny, aby usunąć pozostały tłuszcz z trzustki. 
		UWAGA: To normalne, że tkanka staje się twarda z powodu usuwania tłuszczu w tym procesie.</li>
		<li>Po 2 godzinach wyjmij IPA i przemyj chusteczkę 400 ml 1x PBS przez 24 godziny. Odświeżaj 1x PBS co 12 godzin.</li>
		<li>Aby wysterylizować pozbawioną komórek tkankę, wyrzuć poprzedni roztwór i potraktuj 400 ml 0,1% kwasu nadoctowego w 4% etanolu przez 2 godziny.</li>
		<li>Aby usunąć resztki detergentu, przemyj chusteczkę 400 ml 1x PBS przez 6 godzin. Odświeżaj roztwór co 2 godziny.</li>
		<li>Zbierz pozbawione komórek tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z kleszczami.</li>
		<li>Zamrażać próbkę w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę. Przykryć stożkową probówkę niestrzępiącą się chusteczką zamiast pokrywką i przymocować gumką w celu efektywnej liofilizacji.</li>
		<li>Liofilizować pozbawioną komórek tkankę w temperaturze -50 °C przez 4 d. 
		UWAGA: W kroku 1.3 1 g tkanki niepozbawionej komórek należy również liofilizować w tych samych warunkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena tkanek pozbawionych komórek
UWAGA: Aby ocenić resztkową ilość dsDNA, glikozaminoglikanów (GAG) i kolagenu w tkance pozbawionej komórek w porównaniu z tkanką natywną, do jednej partii oceny wymagane jest co najmniej 1 g każdej z tkanek niebezkomórkowych (tkanka natywna) i tkanka bezkomórkowa. Ilość dsDNA, GAG i kolagenu można obliczyć na podstawie suchej masy tkanki.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory do testów biochemicznych.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór papainy do trawienia próbki. 
		UWAGA: Ilość buforu, który należy wykonać, można dostosować w zależności od liczby próbek.
		<ol>
			<li>Rozpuść 119 mg 0,1 M fosforanu sodu (jednozasadowego), 18,6 mg 0,5 mM Na2-EDTA i 8,8 mg 5 mM cysteiny-HCl w 10 ml autoklawowanej wody.</li>
			<li>Doprowadzić pH roztworu do 6,5, dodając 10 M roztworu NaOH.</li>
			<li>Dodać 125 μl 10 mg/ml roztworu podstawowego papainy do powyższego roztworu i odwirować, pozwalając każdemu pierwiastkowi równomiernie się wymieszać.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwory do testu błękitu dimetylometylenowego (DMMB).
		<ol>
			<li>Aby uzyskać barwnik DMMB, rozpuść 8 mg podwójnej soli chlorku 1,9-dimetylometylenu, 1,52 g glicyny i 1,185 g NaCl w 500 ml autoklawowanej wody. Dostosuj pH do 3, dodając 0,5 M roztworu HCl, jednocześnie mierząc zmianę pH za pomocą pH-metru stacjonarnego. Następnie przefiltruj to przez butelkowy filtr próżniowy o pojemności 500 ml.</li>
			<li>Przygotować 15 μl roztworu siarczanu chondroityny A o stężeniu 10 mg/ml dla wzorca.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj roztwory do testu hydroksyproliny.
		<ol>
			<li>W celu uzyskania roztworu roboczego chloraminy rozpuścić 2,4 g octanu sodu, 1 g kwasu cytrynowego i 0,68 g wodorotlenku sodu w 24 ml wody destylowanej i dodać 240 μl lodowatego kwasu octowego, 10 μl toluenu i 6 ml IPA. 
			UWAGA: Rozpuść wszystkie proszki w roztworze za pomocą mieszalnika wirowego. Roztwór roboczy chloraminy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.</li>
			<li>W przypadku roztworu chloraminy T rozpuścić 0,35 g chloraminy T w 20 ml roztworu roboczego chloraminy i dodać 2,5 ml IPA. Wir, aby wymieszać wszystkie składniki. 
			UWAGA: Przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
			<li>W przypadku roztworu P-DAB umieść 3,75 g P-DAB w 6,5 ml kwasu nadchlorowego i 15 ml IPA; zawiń w folię aluminiową. 
			UWAGA: Przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu papainy do 10 mg liofilizowanej tkanki w 1,5 ml probówki do mikrowirówki i przemieszaj probówkę, aby lepiej strawić próbkę.</li>
	<li>Umieścić probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w gumowym stojaku i roztrawić próbki w zlewce o pojemności 500 ml zawierającej 300 ml wody o temperaturze 60 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Wirować przy 9 500 x g przez 20 minut, zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.</li>
	<li>Określ ilościowo resztkowe DNA i główne białka w tkankach pozbawionych komórek.
	<ol>
		<li>Załadować 1 μl strawionej próbki do spektrometru i zmierzyć ilość dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Eksperymentator powinien związać włosy do tyłu i założyć maskę, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test DMMB, aby określić ilościowo ilość GAG, która pozostaje w tkance pozbawionej komórek.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 1 μl roztworu siarczanu chondroityny A i 499 μl 1x PBS, aby uzyskać wzorce. Rozcieńczyć roztwór siarczanu chondroityny A wodą destylowaną o stężeniach 0, 4, 8, 12, 16 i 20 μg/ml.</li>
		<li>Załadować trzy porcje po 50 μl każdego stężenia próbki wzorcowej i wytrawionej do płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Dodaj 200 μl barwnika DMMB do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Natychmiast odczytać absorbancję przy długości fali 525 nm na czytniku mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test hydroksyproliny, aby określić ilościowo ilość kolagenu.
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić test hydroksyproliny, inkubować 250 μl strawionej próbki z równą objętością HCl w temperaturze 120 °C przez 16 godzin.</li>
		<li>Suszyć pozostałości w temperaturze pokojowej przez 3 godziny w celu schłodzenia próbek, a następnie ponownie rozpuścić próbki w 1 ml 1x PBS.</li>
		<li>Wirować przy 2 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Standardowo należy przygotować 100 μg/ml roztworu hydroksyproliny.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór hydroksyproliny wodą destylowaną o stężeniu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/ml dla roztworu wzorcowego.</li>
		<li>Umieścić trzykrotne próbki po 50 μl i roztwór wzorcowy na płytkę 96-dołkową.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu chloraminy T, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu p-DAB i inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 °C. 
		UWAGA: Podwielokrotność w ciemnym pomieszczeniu. Po dodaniu owiń talerz folią aluminiową.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Po schłodzeniu zmierzyć absorbancję przy 540 nm na czytniku mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie biotuszu
UWAGA: proszek pdECM może być przechowywany stabilnie w temperaturze -80 °C przez co najmniej rok. Przed dostosowaniem pH strawiony roztwór pdECM można przechowywać w temperaturze -20 °C przez jeden miesiąc. Przed użyciem rozmrozić próbkę zamrożonego roztworu pdECM w temperaturze 4 °C przez noc. Roztwór pdECM o dostosowanym pH można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Strawiony roztwór pdECM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej kilka dni, ale nie dłużej niż 1 tydzień.
<ol>
	<li>Trawić liofilizowany pdECM z pepsyną.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać skuteczne trawienie biotuszu, sproszkować liofilizowany pdECM z ciekłym azotem za pomocą moździerza i tłuczka.</li>
		<li>Zebrać 200 mg proszku pdECM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 20 mg pepsyny i 8,4 ml 0,5 M kwasu octowego (końcowe stężenie wynosi 2 w/v%).</li>
		<li>Umieść mieszadło magnetyczne w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i mieszaj z prędkością 300 obr./min przez 96 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj pH strawionego roztworu pdECM. 
	UWAGA: Aby uniknąć żelowania przed dostosowaniem pH, proces ten należy przeprowadzić na lodzie.
	<ol>
		<li>Odfiltruj niestrawione cząstki w roztworze pdECM za pomocą sitka komórkowego 40 μm za pomocą pipety wyporowej na lodzie, aby uzyskać optymalne trawienie części.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 10x PBS i odwiruj przed użyciem NaOH.</li>
		<li>Ustawić pH na 7 za pomocą 10 M NaOH, sprawdzając pH za pomocą pasków wskaźnikowych pH. 
		UWAGA: Wirować za każdym razem, gdy dodawany jest NaOH, aby biotusz został dokładnie wymieszany z innymi odczynnikami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza reologiczna
<ol>
	<li>Konfiguracja eksperymentalna
	<ol>
		<li>Przygotować 1,5% (w/v) biotuszu pdECM w celu oceny właściwości reologicznych.</li>
		<li>Ustalić geometrię płytki stożkowej 20 mm (średnica stożka 20 mm pod kątem 2°) w trybie reometru z kontrolowaną szybkością.</li>
		<li>Twórz sekwencje eksperymentalne w zainstalowanym oprogramowaniu (TRIOS), aby mierzyć lepkość, kinetykę żelowania i moduł dynamiczny biotuszu pdECM.
		<ol>
			<li>Lepkość: Umieść biotusz pdECM na płytce. Zmierz złożoną lepkość (Pa·s) biotuszu pdECM przy rosnącej szybkości ścinania od 1 do 1,000 s-1 w stałej temperaturze 15 °C.</li>
			<li>Kinetyka żelowania: Umieść biotusz pdECM na płytce. Obliczyć moduł zespolony (G*), mierząc moduł przechowywania i ubytków biotuszu pdECM w temperaturze 4–37 °C przy szybkości przyrostowego wzrostu wynoszącej 5 °C/min (tryb przemiatania w czasie).</li>
			<li>Moduł dynamiczny: Umieścić biotusz pdECM na płytce w temperaturze 37 °C na 60 minut przed pomiarem. Zmierz zależny od częstotliwości moduł przechowywania (G') i moduł strat (G'') biotuszu pdECM w zakresie 0,1-100 rad/s przy 2% odkształceniu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 3D drukowanie komórek w tkankach trzustkowych za pomocą wysepek trzustkowych
<ol>
	<li>Przygotowanie izolowanych wysepek
	<ol>
		<li>Odizoluj pierwotne wysepki od szczura zgodnie z protokołami opisanymi w poprzednim work5.</li>
		<li>Aby oddzielić szczątki i martwe komórki od izolowanej wysepki, przepuść zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 70 μm. Wysepki o średnicy mniejszej niż 70 μm są uważane za martwe lub nienormalne.</li>
		<li>Zawiesić izolowane wysepki w pożywce RPMI-1640 i umieścić je na szalce Petriego. Usunąć wysepki o średnicy większej niż 300 μm za pomocą pipety objętościowej P200 pod mikroskopem (soczewka obiektywowa 4x) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hermetyzacja wysepek w biotuszu pdECM
	<ol>
		<li>Przygotuj biotusz pdECM o dostosowanym pH i izolowaną wysepkę. 
		UWAGA: Aby uniknąć żelowania przed dostosowaniem pH, proces ten należy przeprowadzić na lodzie.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać biotusz pdECM i pożywkę zawieszoną na wysepkach (w stosunku 3:1) za pomocą pipety wyporowej, aż do uzyskania równomiernego wymieszania. 
		UWAGA: Końcowe stężenie biotuszu pdECM wynosi 1,5%, a gęstość komórek w biotuszu pdECM wynosi 3,000 IEQ/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drukowanie 3D komórek konstruktów tkanki trzustki
	<ol>
		<li>Przygotuj wysterylizowaną strzykawkę i dyszę 22 G. 
		UWAGA: Ten miernik został wybrany do drukowania wysepek o średnicy 100-250 μm.</li>
		<li>Załadować do strzykawki biotusz pdECM z wysepkami.</li>
		<li>Wydrukuj biotusz w zoptymalizowanych warunkach drukowania (prędkość posuwu: 150 mm/min; ciśnienie pneumatyczne: 15 kPa) w temperaturze 18 °C w kształcie siatki.</li>
		<li>Aby usieciować biotusz, umieść wydrukowany konstrukt w inkubatorze na 30 minut.</li>
		<li>Zanurz wydrukowany konstrukt w pożywce do hodowli wysp trzustkowych, która jest pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 3D drukowanie komórek trzustki o wzorzystej strukturze
<ol>
	<li>Przygotowanie dwóch rodzajów biotuszu
	<ol>
		<li>Aby potwierdzić wszechstronność drukowania przy użyciu wielu biotuszów, przygotuj dwa zestawy biotuszów pdECM i zabarwij je, dodając 0,4% roztworu błękitu trypanowego i różu bengalskiego do każdego biotuszu pdECM w proporcji odpowiednio 1:20. 
		UWAGA: Aby uniknąć żelowania przed dostosowaniem pH, proces ten należy przeprowadzić na lodzie.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać biotusz pdECM i pożywkę zawieszoną na wysepkach (w stosunku 3:1) za pomocą pipety wyporowej, aż do uzyskania równomiernego wymieszania. 
		UWAGA: Końcowe stężenie biotuszu pdECM wynosi 1,5%, a gęstość komórek w biotuszu pdECM wynosi 3,000 IEQ/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drukowanie 3D komórek wielomateriałowych konstruktów tkanki trzustkowej
	<ol>
		<li>Przygotuj wysterylizowane strzykawki i dyszę 25 G.</li>
		<li>Załaduj każdy biotusz (niebieski i czerwony) odpowiednio do dwóch różnych strzykawek.</li>
		<li>Wydrukuj biotusz w zoptymalizowanych warunkach drukowania (prędkość posuwu: 150 mm/min; ciśnienie pneumatyczne: 15 kPa) w temperaturze 18 °C w kształcie siatki z naprzemiennymi liniami niebieskim i czerwonym.</li>
		<li>Aby usieciować biotusz, umieść wydrukowany konstrukt w inkubatorze na 30 minut.</li>
		<li>Zanurz wydrukowany konstrukt w pożywce do hodowli wysp trzustkowych, która jest pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).</li>
<li>Venturini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique%2C+complications%2C+and+therapeutic+efficacy+of+percutaneous+transplantation+of+human+pancreatic+islet+cells+in+type+1+diabetes%3A+the+role+of+US%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US.</a> Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).</li>
<li>Xie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoprotection+of+PEG-modified+adult+porcine+pancreatic+islets+for+improved+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation.</a> Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).</li>
<li>Sackett, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffold+and+hydrogel+derived+from+decellularized+and+delipidized+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10452(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+printing+of+islet-laden+pancreatic+tissue-derived+extracellular+matrix+bioink+constructs+for+enhancing+pancreatic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).</li>
<li>Yi, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioprinted+human-glioblastoma-on-a-chip+for+the+identification+of+patient-specific+responses+to+chemoradiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+bioinks+and+the+external+stimuli+to+enhance+cardiac+tissue+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro.</a> Acta Biomaterialia. , (2019).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+alignment+of+collagen+fibrils+using+3D+cell+printing+for+corneal+stroma+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering.</a> Biofabrication. 11 (3), 035017(2019).</li>
<li>Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replacement+for+islet+equivalents+with+improved+reliability+and+validity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetologica%22%5BJournal%5D)">A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity.</a> Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).</li>
<li>Pati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+three-dimensional+tissue+analogues+with+decellularized+extracellular+matrix+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink.</a> Nature Communications. 5, 3935(2014).</li>
<li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1, (2018).</li>
<li>Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix%3A+a+step+towards+the+next+generation+source+for+bioink+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing.</a> Biofabrication. 9 (3), 034104(2017).</li>
<li>Gaetani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+decellularization+protocols+on+the+generation+of+pancreas-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+bio-blood-vessels+constructed+using+a+tissue-specific+bioink+and+3D+coaxial+cell+printing+technique%3A+a+novel+therapy+for+ischemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease.</a> Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798(2017).</li>
<li>La, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemically+replicated+organic+and+inorganic+bony+microenvironment+for+new+bone+formation+generated+by+a+3D+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology.</a> RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-derived+decellularized+extracellular+matrix%3A+a+game+changer+for+bioink+manufacturing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?</a> Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).</li>
<li>Kurpios, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+gut+looping+is+established+by+changes+in+the+extracellular+matrix+and+in+cell%3A+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).</li>
<li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423 (6942), 876(2003).</li>
</ol>

Protokół ten opisywał rozwój biotuszów pdECM i wytwarzanie konstruktów 3D tkanki trzustkowej przy użyciu technik drukowania komórek 3D. Aby zrekapitulować mikrośrodowisko tkanki docelowej w konstrukcie tkanki zaprojektowanej w 3D, wybór biotuszu ma kluczowe znaczenie. W poprzednim badaniu potwierdziliśmy, że specyficzne tkankowo biotusze dECM są korzystne dla promowania różnicowania i proliferacji komórek macierzystych10. W porównaniu z polimerami syntetycznymi, dECM może służyć jako środowisko sp...

Ostatnio przeszczep wysp trzustkowych został uznany za obiecującą metodę leczenia pacjentów z cukrzycą typu 1. Względne bezpieczeństwo i minimalna inwazyjność zabiegu to wielkie zalety tego zabiegu1. Ma jednak kilka ograniczeń, takich jak niski wskaźnik sukcesu izolowania wysp trzustkowych i skutki uboczne leków immunosupresyjnych. Co więcej, liczba przeszczepionych wysp trzustkowych stale spada po przeszczepie ze względu na nieprzyjazne środowisko2. Aby przezwyciężyć te trudności, do przeszczepu wysp trzustkowych zastosowano różne biokompatybilne materiały, takie jak alginian, kolagen, poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) lub glikol polietylenowy (PEG).
Technologia druku komórkowego 3D pojawia się w inżynierii tkankowej ze względu na jej duży potencjał i wysoką wydajność. Nie trzeba dodawać, że biotusze są znane jako ważne składniki zapewniające odpowiednie mikrośrodowisko i umożliwiające poprawę procesów komórkowych w drukowanych konstruktach tkankowych. Znaczna liczba hydrożeli rozrzedzających ścinanie, takich jak fibryna, alginian i kolagen, jest szeroko stosowana jako biotusze. Jednak materiały te wykazują brak złożoności strukturalnej, chemicznej, biologicznej i mechanicznej w porównaniu z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) w natywnej tkance3. Sygnały mikrośrodowiskowe, takie jak interakcje między wyspami trzustkowymi a ECM, są ważnymi sygnałami dla poprawy funkcji wysp trzustkowych. Bezkomórkowy ECM (dECM) może odtworzyć specyficzną dla tkanki kompozycję różnych składników ECM, w tym kolagenu, glikozaminoglikanów (GAG) i glikoprotein. Na przykład pierwotne wyspy trzustkowe, które zachowują swoje obwodowe ECM (np. kolagen typu I, III, IV, V i VI, laminina i fibronektyna) wykazują niską apoptozę i lepszą wrażliwość na insulinę, co wskazuje, że specyficzne tkankowo interakcje komórka-macierz są ważne dla zwiększenia ich zdolności do funkcjonowania podobnie do oryginalnej tkanki4.
W tym artykule wyjaśniamy protokoły przygotowania biotuszu z decelularizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (pdECM) pochodzącego z tkanki trzustkowej, aby dostarczyć korzystnych wskazówek mikrośrodowiskowych dla zwiększenia aktywności i funkcji wysp trzustkowych, a następnie procesów generowania konstruktów tkanki trzustki 3D przy użyciu techniki biodruku opartej na mikroekstruzji (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Szafy bezpieczeństwa biologicznego</td><td>CRYSTE</td><td>PURICUBE 1200</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>957</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa wytrząsarka orbitalna</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>DH. </td><td></td>WSO04010</tr><tr><td>Suszarka sucha</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WON-155</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>LABCONCO</td><td>7670540</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>SANSUNG</td><td>CRFD-1141</td><td></td></tr><tr><td>Tarka</td><td>ABM</td><td>1415605793</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy odwrócone Mikrowirówka</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CRYSTE</td><td>PURISPIN 17R</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan GO</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>CF-5</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła wielopłytkowe</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SMHS-6</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Laboratoryjny</td> miernik pH Fisher <td>Scientific ND-LITE-PR</td> Thermo <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>Reometr</td><td>TA</td><td>Instrument Discovery HR-2</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>Cirurgical Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>Hirose</td><td>HC.13-122</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>HC.203-30</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiały</mocny> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 ml szklana fiolka</td><td>Scilab</td><td>SL. VI1243</td><td></td></tr><tr><td>40 &mikro; m sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 5 L</td><td>Dong Sung Science</td><td>SDS 2400</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka rogowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>500 ml zlewka</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>KA.23-08</td><td></td></tr><tr><td>Butelkowy filtr próżniowy 500 ml</td><td>Corning</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>500 ml plastikowy</td><td>pojemnik LOCK& LOCK</td><td>INL301</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>DAEKYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pręt magnetyczny</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>BA.37110-0003</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SC. Pipeta wielokanałowa MG100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>4982000314</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>SPL</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>Paski wskaźnikowe pH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1095350001</td><td></td></tr><tr><td>Sito siatkowe</td><td>DAIHAN Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Decelularyzacja</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x pbs</td><td>Hyclon</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>4,7% Kwas nadoctowy</td><td>Omegafarm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%</td> etanol <td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>E0220 SAM</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>destylowana</tr><tr><td>IPA</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>samchun I0348</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Biosesang</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>Test biochemiczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,9-dimetylo-metylenowy niebieski chlorek podwójna sól</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2018</td><td></td></tr><tr><td>Chloramina T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857319</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan chondroityny A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4384</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Supelco</td><td>46933</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Merok</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>S2097</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p4762</td><td></td></tr><tr><td>P-DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2004</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Supelco</td><td>SX0607N</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (monozasadowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Bioink</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charicterized</td><td>FBS Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7215</td><td></td></tr><tr><td>Róża bengalska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198250</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 średni</td><td>roztwór błękitu trypanowego Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3d obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Przeszczep wysp trzustkowych jest obiecującym sposobem leczenia dla pacjentów, którzy cierpią na cukrzycę typu 1, której towarzyszy hipoglikemia i wtórne powikłania. Jednak przeszczepianie wysp trzustkowych nadal ma kilka ograniczeń, takich jak niska żywotność przeszczepionych wysp trzustkowych z powodu słabego wszczepienia wysp trzustkowych i nieprzyjaznego środowiska. Ponadto komórki produkujące insulinę zróżnicowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych mają ograniczoną zdolność do wydzielania wystarczającej ilości hormonów, które mogą regulować poziom glukozy we krwi; Dlatego zdecydowanie konieczna jest poprawa dojrzewania poprzez hodowlę komórek z odpowiednimi sygnałami mikrośrodowiskowymi. W tym artykule wyjaśniamy protokoły przygotowania biotuszu do decelularnej macierzy zewnątrzkomórkowej (pdECM) pochodzącego z tkanki trzustki w celu zapewnienia korzystnego mikrośrodowiska, które może zwiększyć wrażliwość wysp trzustkowych na glukozę, a następnie opisujemy procesy generowania konstruktów tkanki trzustki 3D przy użyciu techniki biodruku opartej na mikroekstruzji.

Decelularyzacja tkanek trzustki 
Opracowaliśmy proces przygotowania biotuszu pdECM w celu zapewnienia specyficznych dla tkanki trzustki mikrośrodowisk, które zwiększają funkcjonalność wysepek w biodrukowanej konstrukcji tkankowej 3D (Rysunek 2A). Po procesie decelularyzacji usunięto 97,3% dsDNA, natomiast reprezentatywne komponenty ECM, takie jak kolagen i GAGs, pozostały na poziomie odpowiednio 1278,1% i 96,9% w porównani...

Bezkomórkowa matryca zewnątrzkomórkowa (dECM) może dostarczyć odpowiednich wskazówek mikrośrodowiskowych do podsumowania inherentnych funkcji tkanek docelowych w skonstruowanym konstrukcie. W tym artykule wyjaśniono protokoły decelularyzacji tkanki trzustkowej, ocenę biotuszu dECM pochodzącego z tkanki trzustki oraz generowanie konstruktów 3D tkanki trzustki przy użyciu techniki biodruku.

Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Biotusz pdECM może zapewnić korzystne mikrośrodowisko dla wysp trzustkowych przy użyciu komponentów i architektury specyficznych dla tkanek oraz ma optymalne właściwości neurologiczne, które zmniejszają śmierć komórek i zwiększają ich drukowność. Główną zaletą tej techniki jest to, że specyficzny dla tkanki skład może zostać zachowany w biotuszu pdECM, co sprzyja konstruktywnemu oddziaływaniu między trójwymiarowymi konstruktami tkanki trzustki a zamkniętymi w kapsułkach wyspami trzustkowymi. Opracowanie enkapsulacji wysp trzustkowych w biotuszu pdECM może być stosowane do wytwarzania nadających się do przeszczepu konstruktów tkanki trzustkowej w leczeniu cukrzycy typu pierwszego.Ten biotusz może być wykorzystany do poszerzenia zastosowania konstruktów do przeszczepów, a także modeli tkanek in vitro w cukrzycy, powikłaniach związanych z cukrzycą i raku trzustki. W celu decelularyzacji zamrożonej próbki tkanki trzustki świni za pomocą tarki pokrój zamrożoną trzustkę na kawałki o grubości jednego milimetra i przenieś 50 gramów pokrojonej tkanki do plastikowego pojemnika o pojemności 500 mililitrów. Umyj tkankę 300 mililitrami destylowanej wody o temperaturze czterech stopni Celsjusza na cyfrowej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obrotów na minutę przez około 12 godzin.Gdy mętna woda zniknie, zastąp wodę 400 mililitrami 1%Triton-X 100 w PBS na 84 godziny. Pod koniec zabiegu detergentem inkubuj tkankę z 400 mililitrami izopropanolu przez dwie godziny, aby usunąć pozostały tłuszcz z trzustki, a następnie przemyj ją przez 24 godziny w 400 mililitrach PBS. Pod koniec prania wysterylizuj pozbawioną komórek tkankę 400 mililitrami 0,1% kwasu nadoctowego w 4% etanolu przez dwie godziny, a następnie umyj próbkę 400 mililitrami świeżego PBS przez sześć godzin, aby usunąć wszelkie pozostałości detergentu.Pod koniec prania za pomocą kleszczy przenieś kawałki tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i ponownie zamroź próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Następnie przykryj stożkową rurkę niestrzępiącą się chusteczką przymocowaną gumką i liofilizuj zdecelulozowaną tkankę w temperaturze minus 50 stopni Celsjusza przez cztery dni. Aby przygotować biotusz, przenieś 200 miligramów liofilizowanego pdECM do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj 20 miligramów pepsyny i 8,4 mililitra 0,5 molowego kwasu octowego do próbki tkanki.Następnie umieść mieszadło magnetyczne w probówce na 96-godzinną inkubację z mieszaniem przy 300 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji użyj sitka o długości 40 mikrometrów i pipety wyporowej, aby przefiltrować roztwór do nowej probówki na lodzie, aby odfiltrować wszelkie niestrawione cząstki i dodać jeden mililitr 10X PBS do probówki. Po wirowaniu użyj wodorotlenku sodu, aby dostosować pH roztworu do siedmiu.Aby przygotować biotusz do drukowania komórek 3D konstruktu trzustki o wzorzystej strukturze, zabarwić jedną porcję biotuszu pdECM 0,4% błękitem trypanowym i jedną podwielokrotność roztworem Rose Bengal w stosunku od jednego do 20. Następnie użyj pipety wyporowej, aby delikatnie wymieszać każdy roztwór biotuszu z pożywką zawieszoną roztworem wysepek w stosunku trzy do jednego do końcowego stężenia 1,5% biotuszu i gęstości komórek trzy razy 10 do odpowiednika trzech wysepek na mililitr. W przypadku drukowania komórek 3D wielomateriałowych konstruktów tkanki trzustkowej, załaduj każdą mieszaninę wysepek biotuszu do indywidualnych wysterylizowanych strzykawek wyposażonych w 25 dysz i wydrukuj 3D każdy biotusz w zoptymalizowanych warunkach drukowania w temperaturze 18 stopni Celsjusza w kształcie siatki z naprzemiennymi liniami niebieskiego i czerwonego.Aby usieciować biotusz, umieść wydrukowany konstrukt w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 30 minut. Następnie zanurz wydrukowany konstrukt w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 jednostkami na mililitr penicyliny i streptomycyny. Po procesie decelularyzacji 97,3% dwuniciowego DNA jest usuwane, a reprezentatywne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak kolagen i glikozaminoglikany, pozostają na poziomie odpowiednio 1278,1% i 96,9% w porównaniu z natywną tkanką trzustki.W tej reprezentatywnej analizie biotusz pdECM wykazywał rozrzedzenie przy ścinaniu o wartości około 10 paskali na sekundę przy szybkości ścinania jednego na sekundę, co wskazuje, że biotusz wykazywał odpowiednie właściwości reologiczne do wytłaczania przez dyszę. Co więcej, zespolony moduł biotuszu zaczął rosnąć, gdy temperatura osiągnęła 15 stopni Celsjusza i gwałtownie wzrastał, gdy temperatura utrzymywała się na poziomie 37 stopni Celsjusza, co wskazywało na przemianę zol-żel roztworu. Dynamiczne G prime i G double prime biotuszu pdECM zostały zbadane w fizjologicznie odpowiednich temperaturach, aby zapewnić jego stabilność po procesie drukowania, co zaowocowało osiągnięciem stabilnego modułu w warunkach przemiatania częstotliwości.Korzystając z wielogłowicowego systemu drukowania, można następnie wytworzyć różne rodzaje konstruktów 3D, jak pokazano za pomocą opracowanego pdECM, demonstrując wszechstronność pdECM do celów biodruku 3D w celu zharmonizowania dwóch lub więcej rodzajów żywych tkanek w układzie podobnym do tkanki. Zachowaj ostrożność podczas mieszania biotuszu z komórkami, aby uniknąć śmierci komórek i tworzenia się pęcherzyków, ponieważ obecność pęcherzyków obniża rozdzielczość drukowania i zmniejsza żywotność komórek. Funkcjonalność zamkniętych wysp trzustkowych w konstruktach 3D tkanki trzustkowej można ocenić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lub testu tolerancji glukozy.Ten biotusz pdECM i technika biodruku 3D mogą być potencjalnie wykorzystane do rozwoju funkcjonalnych konstruktów tkanki trzustkowej w dziedzinie inżynierii tkankowej. Badacze powinni nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby zapobiec obrażeniom podczas obchodzenia się z ostrą tarką i odczynnikami.

pancreatic-tissue-derived-extracellular-matrix-bioink-for-printing-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Poznaj metodę biotuszowania pdECM do drukowania 3D konstruktów tkanki trzustkowej z izolowanymi wyspami. Technika zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej, poprawiając przeżywalność komórek i funkcjonalność dla terapii cukrzycy typu 1.

Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej (Wideo) | JoVE Journal

Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej

Przeglądaj więcej filmów