Name: Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę badania dynamiki serca przy użyciu izolowanego modelu serca świni. Technika łączy elektrofizjologię z podwójną emisją optokardiografii do oceny aktywności elektrycznej serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Matthew Kayowi za pomocne wskazówki eksperymentalne, a Manelle Ramadan i Muhaymin Chowdhury za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01HL139472 do NGP, R01 HL139712 do NI), Children's Research Institute, Children's National Heart Institute i Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż modele badań sercowo-naczyniowych obejmują zarówno preparaty komórkowe, jak i preparaty in vivo, istnieje nieodłączny kompromis między znaczeniem klinicznym a użytecznością eksperymentalną. W tym spektrum izolowane serce perfundowane Langendorffem pozostaje użytecznym kompromisem w badaniu fizjologii serca48. Cały model serca reprezentuje wyższy poziom integracji funkcjonalnej i strukturalnej niż monowarstwy pojedynczej komórki lub tkanki, ale także pozwala uniknąć mylących zawiłości związanych z modelami in vivo. Główną zaletą eksperymentów z podwójnym mapowaniem optycznym jest to, że można obserwować powierzchnię nasierdzia izolowanego serca, a obrazowanie fluorescencyjne potencjału transbłonowego i obchodzenia się z wapniem można wykorzystać do monitorowania fizjologii serca34.
Modele gryzoni są najczęściej używane do izolowanych preparatów serca w przeciwieństwie do większych zwierząt, częściowo ze względu na związany z tym koszt zwiększenia rozmiaru wszystkich zaangażowanych elementów (np. objętości roztworu, obwodu perfuzji, ilości barwników i mechanicznych rozprzęgaczy) wraz z większą niestabilnością i skłonnością do arytmii u większych zwierząt 10,36,49. Jedną z zalet stosowania serc świń jest to, że są one bardzo podobne do ludzkiego serca pod względem struktury, wielkości i szybkości skurczu, dzięki czemu dokładniej modelują parametry hemodynamiczne, takie jak przepływ krwi w naczyniach wieńcowych i pojemność minutowa serca. Podobnie ludzie i świnie mają podobne obchodzenie się z wapniem, odstępy między elektrokardiogramami37 i morfologię potencjału czynnościowego, w tym kanały leżące u podstaw, które reprezentuje 12,50,51,52. Protokół ten szczegółowo opisuje etapy tworzenia powtarzalnego dużego modelu zwierzęcego w celu kompleksowego scharakteryzowania funkcji mięśnia sercowego. Jednoczesne obrazowanie napięcia transbłonowego (RH237) i wewnątrzkomórkowego wapnia (Rhod2), stosowane w połączeniu z ustalonymi protokołami elektrofizjologicznymi, daje możliwość wskazania mechanizmów odpowiedzialnych za zmienioną czynność serca. Opisana metodologia może być stosowana do przedklinicznych badań bezpieczeństwa, toksykologicznych badań przesiewowych oraz badania patologii genetycznych lub innych patologii chorobowych. Ponadto opisana metodologia może być modyfikowana i dostosowywana do stosowania z innymi modelami serca (np. psi, ludzkim) w zależności od konkretnego przedmiotu badań 53,54,55.
Istnieje kilka krytycznych modyfikacji, o których należy pamiętać podczas przechodzenia z mniejszego modelu gryzoni na większy model świni w przypadku izolowanych preparatów z całym sercem. Podczas przygotowania i konfiguracji zalecamy dodanie albuminy do perfuzatu w celu utrzymania ciśnienia onkotycznego i zmniejszenia obrzęku (plus środka przeciwpieniącego, jeśli to konieczne)56,57,58,59. Co więcej, perfuzat zawierający albuminę może również pomóc w badaniach metabolicznych, które również wymagają suplementacji kwasami tłuszczowymi do pożywki60,61. W przeciwieństwie do serc gryzoni, większe serce świni nie musi być zanurzane w ciepłym pożywce ze względu na mniejszy stosunek powierzchni do objętości i zwiększoną objętość podgrzanego podłoża przepływającego przez naczynia wieńcowe, co lepiej utrzymuje temperaturę. Jak wspomniano wcześniej, umieściliśmy sondy temperatury wewnątrz prawej komory i na powierzchni nasierdzia zarówno prawej, jak i lewej komory, obserwując tylko niewielkie wahania temperatury o 1-2 °C we wszystkich trzech miejscach przez cały czas trwania badania. Co ważne, takie szybsze przepływy mogą również zwiększać prawdopodobieństwo wystąpienia pęcherzyków i potencjalnego zatoru. Aby obejść ten problem, zalecamy użycie pułapki bąbelkowej z rurką o dużym otworze prowadzącą prosto w dół do kaniuli aortalnej. Podobnie, stwierdziliśmy, że najbardziej przydatne jest posiadanie dwóch osób pracujących w tandemie, aby kaniulować aortę na większym (i cięższym) sercu; Jedna osoba utrzymuje aortę otwartą za pomocą mocnych hemostatów, a druga przymocowuje aortę do kapiny za pomocą taśmy pępowinowej. W opisanej metodologii stwierdziliśmy, że perfuzja z kardioplegią i defibrylacja były niezbędne do rekonwalescencji serca, co jest przeciwieństwem preparatów na serce gryzoni. Z naszego doświadczenia wynika, że tylko kilka wyciętych serc wznowiło normalną aktywność napędzaną przez zatoki bez kardiowersji.
Aby poprawić punkty końcowe obrazowania optycznego, preparat do wiszącego serca ograniczył efekt olśnienia, które może wystąpić w przypadku zanurzonego serca. Co więcej, wiszące serce pozwala również uniknąć ucisku lub naruszenia naczyń wieńcowych w tylnej części serca, które może wystąpić podczas układania serca poziomo w celu obrazowania pionowego. Odkryliśmy również, że ładowanie barwników fluorescencyjnych po pułapce bąbelkowej (w pobliżu kaniuli aortalnej) znacznie poprawiło barwienie tkanek i sygnały optyczne. Wreszcie, aby poprawić punkty końcowe elektrofizjologii serca, zastosowanie większej elektrody do stymulacji współosiowej ułatwiło skuteczną stymulację przedsionków. Chociaż opisujemy zastosowanie elektrokardiogramów do identyfikacji wychwytywania i utraty wychwytywania dla różnych parametrów EP, można również stosować cewniki wewnątrzsercowe lub bipolarne elektrody rejestrujące.
Nasze badanie koncentrowało się na opracowaniu metodologii podwójnego mapowania optycznego i oceny elektrofizjologicznej serca w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni. Ze względu na podobieństwa do serca młodocianego człowieka, serce świni pozostaje popularnym modelem w badaniach dotyczących kardiologii dziecięcej lub wrodzonych wad serca. Co ważne, opisane podejście można dostosować do stosowania z większymi rozmiarami dorosłych serc i/lub różnymi gatunkami zwierząt. Rzeczywiście, inne laboratoria mogą uznać, że użycie psich lub ludzkich serc (zarówno dawców, jak i chorych) jest bardziej odpowiednie dla ich konkretnego celu badawczego 53,54,55. Innym potencjalnym ograniczeniem tego badania jest zastosowanie mechanicznego rozłączacza w celu zmniejszenia artefaktów ruchu podczas obrazowania. Blebbistatyna stała się rozprzęgaczem z wyboru w zastosowaniach obrazowania serca ze względu na jej minimalny wpływ na parametry EKG, aktywację i okresy refrakcji 41,62,63. BDM jest tańszym wyborem, co może być szczególnie ważne w badaniach na dużych zwierzętach, które wymagają większych objętości perfuzatu i mechanicznego rozprzęgacza, ale wiadomo, że ma większy wpływ na prądy potasu i wapnia, które mogą zmieniać morfologię potencjału czynnościowego 64,65,66,67. Jeśli stosuje się BDM, należy pamiętać, że skrócenie APD zwiększa podatność serca na arytmie wywołane wstrząsem68. I odwrotnie, głównym ograniczeniem stosowania blebbistatyny jest jej nadwrażliwość na światło i fototoksyczność, chociaż alternatywne preparaty, które zmniejszyły te efekty 69,70,71. Wreszcie, opisana metodologia wykorzystuje system pojedynczej kamery do eksperymentów z podwójnym mapowaniem optycznym, ale ważne jest, aby pamiętać, że badania naukowe koncentrujące się na migotaniu komór i / lub śledzeniu fal elektrycznych na powierzchni nasierdzia musiałyby zmodyfikować to podejście, aby uwzględnić trójwymiarowe obrazowanie panoramiczne, jak opisano przez innych 15,19,72,73, Rozdział 74,75.

Choroby układu krążenia są główną przyczyną chorób i zgonów na całym świecie. W związku z tym głównym celem badań jest optymalizacja metodologii, które można wykorzystać do badania prawidłowej fizjologii serca i podstawowych mechanizmów, które mogą przyczyniać się do zachorowalności i śmiertelności u ludzi. Podstawowe badania sercowo-naczyniowe tradycyjnie opierały się na małych modelach zwierzęcych, w tym gryzoni i królików1,2,3, ze względu na dostępność gatunków modyfikowanych genetycznie4,5, niższy koszt, mniejszy ślad eksperymentalny i większa przepustowość. Jednak zastosowanie modelu świni może potencjalnie dostarczyć bardziej istotnych klinicznie danych6. Rzeczywiście, poprzednie badania udokumentowały podobieństwa w elektrofizjologii serca (EP) między ludźmi a świniami, w tym podobne prądy jonowe7, kształt potencjału czynnościowego8 i odpowiedzi na testy farmakologiczne9. Co więcej, serce świni ma kinetykę kurczliwości i relaksacji, która jest bardziej porównywalna z ludzką niż u gryzoni czy królików10. W porównaniu z modelem psów, anatomia naczyń wieńcowych świń bardziej przypomina ludzkie serce11,12 i jest modelem z wyboru dla badań koncentrujących się na rozwoju serca, kardiologii dziecięcej i/lub wrodzonych wadach serca13. Chociaż istnieją różnice między sercem świni a ludzkim8, te podobieństwa sprawiają, że serce świni jest cennym modelem do badań sercowo-naczyniowych14.
Wsteczna perfuzja serca stała się standardowym protokołem do badania dynamiki serca ex vivo15 od czasu pierwszego ustanowienia przez Oskara Langendorffa16. W związku z tym perfuzja Langendorffa może być stosowana do podtrzymywania izolowanego, nienaruszonego serca przy braku wpływów autonomicznych. Model ten jest użytecznym narzędziem do bezpośredniego porównywania elektrofizjologii serca i kurczliwości między zdrowymi i niezdrowymi sercami. Ponieważ dynamika serca jest złożona zarówno czasowo, jak i przestrzennie, niewielka zmiana w jednym regionie może dramatycznie wpłynąć na zdolność całego serca do pracy jako syncytium17. W związku z tym obrazowanie barwników wrażliwych na parametry w czasie przestrzennym jest użytecznym narzędziem do monitorowania funkcji serca na całej powierzchni serca18,19. Rzeczywiście, jednoczesne podwójne obrazowanie napięciowych i wrażliwych na wapń sond fluorescencyjnych pozwala na ocenę aktywności elektrycznej, obchodzenia się z wapniem i sprzężenia wzbudzenie-skurcz na poziomie tkanki20,21,22,23,24,25,26,27,28. Techniki perfuzji Langendorffa i/lub mapowania optycznego były wcześniej wykorzystywane do dokumentowania spadku wydolności serca spowodowanego starzeniem się lub mutacjami genetycznymi oraz do oceny bezpieczeństwa środków farmakologicznych lub ekspozycji środowiskowych29,30,31,32,33.
W warunkach klinicznych, inwazyjne badanie elektrofizjologii serca jest często wykorzystywane do badania zaburzeń rytmu serca, identyfikacji patologii i wskazania możliwych opcji leczenia. Podobnie opisujemy protokół EP, który można wykorzystać do oceny funkcji węzła zatokowego, pomiaru przewodnictwa przedsionkowo-komorowego i identyfikacji ogniotrwałości tkanki mięśnia sercowego. Opisane badanie EP może być przeprowadzone w połączeniu z mapowaniem optycznym lub optokardiografią34, aby w pełni scharakteryzować fizjologię serca w izolowanych sercach. W opisanym protokole obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej wykonano za pomocą kombinacji barwników napięciowych (RH237) i wapniowych (Rhod-2AM) w układzie podwójnej emisji. Dodatkowo monitorowano parametry elektrofizjologii serca zarówno w rytmie zatokowym, jak i w odpowiedzi na zaprogramowaną stymulację elektryczną.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560-5MG</td><td>Rozłącznik mechaniczny</td></tr><tr><td>2,3-butanodionu monoksymu (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-100G</td><td>Mechaniczny rozprzęgacz</td></tr><tr><td>albuminy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Analogowy interfejs sygnałowy</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>Antypieniący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwpieniąca emulsja Y-30</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula aortalna, 5/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka bąbelkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>Kamera, sCMOS</td><td>Andor Technology</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Koncentryczna elektroda stymulacyjna (przedsionki)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td>Defibrylator</td><td>Lustro</td> dichroiczne <td>Zoll serii</td><td></td>M</tr><tr><td></td><td>Chroma Technology</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz różnicowy</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny, wapń</td><td>Chroma Technology</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny, napięciowy</td><td>Stymulator Chroma Technology</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>EP (Bloom)</td><td>Fisher Medical</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia</td><td>Chroma Technology</td><td>CT510/60bp</td><td></td></tr><tr><td>Światła wzbudzenia</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>McMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>Wkład filtra, polipropylen</td><td>Pentair</td><td>PD-5-934</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa filtra</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik przepływu</td><td>Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Cewka grzewcza</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Hemofilter</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>Image Splitter</td><td>Cairn Research</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>Rurki o dużej średnicy, ID 3/8"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 50 mm, 0,95 przysłony</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Wyrównanie obrazu</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Detergent Mucasol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>Na Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody igłowe 29 G, 2 mm</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MLA1204</tr><tr><td>Eliminator hałasu</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik, 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda stymulująca (komora)</td><td>Aparat Harvard</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny</td><td>McKesson Medyczno-chirurgiczny</td><td>890186</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz przetwornika</td> World <td>Precision Instruments</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>Konsola przepływu rurek</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Taśma pępowinowa</td><td>Jorvet</td><td>J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna/cyrkulator</td><td>VWR</td><td>89400-970</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyce do bandaży</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8448</td><td>Nożyczki do bandaży Lister, kątowe,/, 42,0 mm długość ostrza, 17,0 cm</td></tr><tr><td>Elektrokoagulacja</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>BA2ALD001</td><td>Model: 200 podstawowych</td></tr><tr><td>hemostatów</td><td>Roboz</td><td>RS-7476</td><td>Rurka St Vincent Kleszcze do zamykania</td></tr> kleszczy <tr><td>hemostatycznych Aparat</td><td>Harvard</td><td>72-8960</td><td>Kleszcze hemostatyczne Hartmann, zakrzywione, ząbkowane Szerokość końcówki 2,2 mm, 9,5 cm</td></tr><tr><td>Hemostatyki</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-8985</td><td>Kleszcze hemostatyczne Halstead-Mosquito zakrzywione, ząbkowane, końcówka 2 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo</td> 14 cm<td>WPI</td><td>501749</td><td>14,5 cm, Proste</td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbaum</td><td>WPI</td><td>501747</td><td>11,5 cm, Proste</td></tr><tr><td>Kleszcze do komarów</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8980</td><td>Kleszcze hemostatyczne Halstead-Mosquito Proste, gładkie, 2 mm szerokość końcówki 12 cm</td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-8828</td><td>Uchwyty na igły Webster, proste, gładkie, 13,0 cm długości całkowitej</td></tr><tr><td>Krzyż pediatryczny zacisk</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Zacisk Cooley-Derra 6,25" 5 mm Kalibracje</td></tr><tr><td>Kleszcze kątowe</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>Kleszczyki hemostatyczne Baby Mixter, 14 cm, skalpel kątowy</td></tr><tr><td></td><td>Rękojeść skalpela Ted Pella</td><td>549-4</td> nr <td>4, 13,7 cm Nożyczki ze stali nierdzewnej i 10 ostrzy nr 22</td></tr><tr><td></td><td>Aparat Harvard</td><td>72-8380</td><td>Nożyczki operacyjne, proste,/, ostrze 42 mm, 12 cm</td></tr><tr><td>Kleszcze proste ząbkowane</td><td>WPI</td><td>500363</td><td>Kleszcze opatrunkowe 15,5 cm</td></tr><tr><td>Zacisk do ręczników</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>Backhaus Zacisk do ręczników, 13 cm, Zakrzywiony, Uchwyt blokujący, SS</td></tr><tr><td>Zwijacz Weitlaner</td><td>WPI</td><td>501314</td><td>Zwijacz Weitlaner, samopodtrzymujący, 10,2 cm, 2x 3 ostre zęby</td></tr><tr><td><mocny>Jednorazowe</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 prolenu szew</td><td>Różni dostawcy</td><td>Różni dostawcy Różni dostawcy Pętla</td><td></td></tr><tr><td>naczyniowa</td><td>Aspen chirurgiczny</td><td>011001PBX</td><td>Sterion&reg; Pętla naczynia, 0,8 mm x 406 mm</td></tr><tr><td>Kardioplegia (Plegisol)</td><td>Pfizer</td><td>00409-7969-05</td><td>Plegisol; Roztwór do kardioplegii krystaloidalnej św. Tomasza 20 ml / kg</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Różni dostawcy</td><td>Różni dostawcy</td><td>300 U/kg</td></tr><tr><td>Strzykawka i igła</td><td>Różni dostawcy</td><td>Różni dostawcy</td><td>odpowiednio 60 ml i 18 G</td></tr><tr><td>Taśma pępowinowa</td><td>Ethicon</td><td>U12T</td><td></td></tr></tbody></table>

badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo langendorffem

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Modele małych zwierząt są najczęściej wykorzystywane w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na dostępność genetycznie modyfikowanych gatunków i niższe koszty w porównaniu z większymi zwierzętami. Jednak większe ssaki lepiej nadają się do badań translacyjnych związanych z normalną fizjologią serca, patofizjologią i testami przedklinicznymi środków terapeutycznych. Aby przezwyciężyć bariery techniczne związane z zastosowaniem większego modelu zwierzęcego w badaniach kardiologicznych, opisujemy podejście do pomiaru parametrów fizjologicznych w izolowanym, perfundowanym metodą Langendorffa sercu prosiąt. Podejście to łączy w sobie dwa potężne narzędzia eksperymentalne do oceny stanu serca: badanie elektrofizjologii (EP) i jednoczesne mapowanie optyczne napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowego wapnia przy użyciu barwników wrażliwych na parametry (RH237, Rhod2-AM). Opisane metodologie doskonale nadają się do badań translacyjnych badających układ przewodzenia serca, zmiany w morfologii potencjału czynnościowego, obchodzenie się z wapniem, sprzężenie wzbudzenie-skurcz oraz występowanie alternanów lub arytmii serca.

Rysunek 1A przedstawia schemat systemu perfuzji izolowanego serca, który obejmuje obwód rurek, pompę, filtr, oksygenator, zbiorniki oraz elementy grzejne. Rozmieszczenie elektrod EKG (konfiguracja odprowadzenia II) i elektrod stymulujących pokazano na Rysunku 1B, a układ obrazowania przedstawiono na Rysunku 1C. Schemat komponentów optycznych i dróg światła pokazano na Rysunku 1D.
Badania eksperymentalne przeprowadzono na nienaruszonych, całych sercach izolowanych od młodych świń rasy Yorkshire (14–42 dni, n = 18), których masa ciała wynosiła od 2,5 do 10,5 kg, a masa serca od 18 do 137 g (Rycina 2A). Po przeniesieniu izolowanego serca do systemu Langendorffa (37 °C), częstość akcji serca ustabilizowała się na poziomie 70 ± 4,5 bpm (średnia ± SEM) w ciągu około 10 min od defibrylacji i pozostawała stała przez cały czas trwania badania (Rycina 2B). Zmierzono średni przepływ na poziomie 184 ± 17 mL/min (średnia ± SEM), który spadł do 70 ± 7,5 mL/min po perfuzji ogrzanym medium zawierającym mechaniczny rozsprzęgacz (Rycina 2C).
Przez cały czas trwania badania rejestrowano EKG w odprowadzeniu II podczas rytmu zatokowego (Rysunek 3A) lub w odpowiedzi na stymulację zewnętrzną (Rysunek 3B-E) w celu ilościowego określenia parametrów elektrofizjologicznych. Do oceny EP zastosowano dynamiczną stymulację (S1−S1) prawego przedsionka, aby wyznaczyć WBCL oraz SNRT (czas regeneracji po rozpoczęciu S1−S1, Rysunek 3C), gdzie WBCL określono jako najkrótszy PCL inicjujący przewodzenie przedsionkowo-komorowe. W celu zidentyfikowania najkrótszego odstępu sprzężenia inicjującego depolaryzację komór, a tym samym wyznaczenia VERP (Rysunek 3D), wdrożono protokół stymulacji S1−S2 przy użyciu bipolarnej elektrody stymulującej w lewej komorze. Alternatywnie, protokół stymulacji przedsionkowej S1−S2 jest stosowany do wyznaczenia AVNERP (S1−S2), jak pokazano na Rysunku 3E. Reprezentatywne przykłady parametrów elektrofizjologicznych serca świni są zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi37.
Eksperymenty z mapowania optycznego przeprowadzono podczas rytmu zatokowego, spontanicznego migotania komór (Rycina 4) lub podczas dynamicznego stymulowania (S1−S1) lewej komory (LV), aby wygenerować krzywe restytucji elektrycznej i wapniowej przedstawione na Rycini 5. Reprezentatywne obrazy serca prosięcia obciążonego barwnikiem przedstawiono na Rycini 4 wraz z odpowiadającymi im optycznymi potencjałami czynnościowymi (Vm) i przejściami wapniowymi (Ca) zebranymi z dwóch obszarów zainteresowania na powierzchni epicardium (prawa komora [RV] = niebieski, LV = czerwony). Nieprzetworzone sygnały wyświetlono dla rytmu zatokowego oraz dla migotania komór. Jak wspomniano wcześniej, podczas eksperymentów z mapowania optycznego zastosowano również dynamiczne stymulowanie epicardium (S1−S1), aby zniwelować wszelkie niewielkie różnice w wrodzonej częstotliwości akcji serca (Rycina 5A-E). Wyświetlono surowe sygnały (RV = niebieski, LV = czerwony), które posłużyły do przedstawienia czasu sprzężenia potencjału czynnościowego i przejścia wapniowego (Rycina 5C), czasu aktywacji i trwania (Rycina 5D) oraz restytucji elektrycznej i wapniowej (Rycina 5E). W przypadku grubych preparatów mięśnia sercowego do analizy potencjałów czynnościowych lub przejść wapniowych epicardium odpowiednie jest filtrowanie przestrzenne z rozmiarem jądra ~3 mm x 3 mm19,47. W związku z tym obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (w opisanym układzie łącznie 1240 x 1024 lub 620 x 512 na kanał, rozmiar piksela 6,5 µm) są często poddawane binowaniu przestrzennemu w trakcie lub po akwizycji (Rycina 5C). Przetwarzanie obrazu może być wykonane w celu wygenerowania map aktywacji i repolaryzacji przy użyciu niestandardowych algorytmów23,3,43,45 (Rycina 3D), przy czym czas aktywacji każdego piksela w sercu zdefiniowano jako maksymalną pochodną fazy wzrostowej potencjału czynnościowego lub przejścia wapniowego.
<img alt="Schemat systemu perfuzyjnego; ogrzewanie wodne, stymulacja EKG, wzbudzenie optyczne do badań serca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Układ doświadczalny. (A) Schemat systemu perfuzji izolowanego serca; strzałki wskazują kierunek przepływu. (B) Przedstawiono kaniulowane serce z rozmieszczeniem elektrod. RA = prawy przedsionek, RV = prawa komora, LV = lewa komora, ECG = elektrokardiogram w odprowadzeniu II. (C) Platforma obrazująca w bliskim sąsiedztwie tkanki serca. (D) Emisja każdej z sond komplementarnych (napięcia, wapnia) jest rozdzielana według długości fali za pomocą urządzenia do rozdzielania obrazu z odpowiednimi filtrami emisyjnymi i lustrem dichroicznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, należy kliknąć tutaj.</a>
<img alt="Wykres korelacji masy serca i masy ciała, wykres słupkowy częstotliwości akcji serca oraz porównanie natężenia przepływu względem BDM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Pomiary masy serca, tętna i przepływu. (A) Stosunek masy serca do masy ciała dla każdego prosięcia wykorzystanego w badaniu (n = 18). (B) Częstość akcji serca mierzono około 10 min po defibrylacji oraz ponownie na koniec badania (około 1 h). (CPrzepływ wieńcowy gwałtownie spada po perfuzji mechanicznym rozsprzęgaczem (+BDM) z powodu zmniejszonego zapotrzebowania na tlen. Paski skali reprezentują średnią ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schematy EKG stymulacji serca przedstawiające rytm zatokowy, stymulację epikardialną, WBCL, VERP oraz wyniki AVNERP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne przykłady zapisów elektrokardiograficznych z odprowadzenia II, zarejestrowane podczas rytmu zatokowego lub w odpowiedzi na stymulację zewnętrzną. (A) Rytm zatokowy. (B) Przykład stymulacji nadsercowej przy długości cyklu 40 ms (S1−S1), która została zastosowana w eksperymentach obrazowych. (C) Góra: Stymulacja przedsionkowa w celu identyfikacji WBCL; zaobserwowano skuteczne przechwycenie przy S1 = 250 ms, przy którym występuje przewodzenie z przedsionka do komory. Należy pamiętać, że stymulacja przedsionkowa może być wykorzystana do wyznaczenia SNRT (czasu do wyładowania węzła zatokowego po rozpoczęciu stymulacji zewnętrznej). Dół: Po skróceniu cyklu S1 do 205 ms przewodzenie do komory zostaje przerwane. (DGóra: Stymulacja epikardialna (S1−S2) w celu zidentyfikowania VERP; obserwuje się skuteczne przechwycenie przy S1 = 450 ms, S2 = 300 ms. Dół: Wraz ze skróceniem cyklu S2 do 250 ms, tkanka komór przestaje być przechwytywana.E) Stymulacja przedsionkowa (S1−S2) w celu identyfikacji AVNERP. Góra: Obserwowany jest skuteczny zapłon przy S1 = 450 ms, S2 = 20 ms. Dół: Wraz ze skróceniem cyklu S2 do 19 ms przewodzenie do komory zostaje przerwane. Niebieskie strzałki oznaczają impulsy stymulujące, czerwone strzałki oznaczają zapłon („C”) lub brak zapłonu („NC”). S1−S1 = stymulacja dynamiczna, S1−S2 = stymulacja dodatkowym impulsem (extrastimulus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza elektrofizjologiczna, wykresy Vm i Ca, schematy rytmu zatokowego i migotania komór." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Dane optyczne podczas rytmu zatokowego i migotania komór. Po lewej: Reprezentatywne obrazy serca świni obciążonego barwnikami (Vm = napięcie, RH237; Ca = wapń, Rhod2), widok przedni. Przefiltrowane przestrzennie sygnały fluorescencyjne napięcia błony komórkowej i wewnątrzkomórkowego wapnia z serca świni podczas rytmu zatokowego (Środek). Sygnały napięcia i wapnia podczas migotania komór (Prawo). Rozmiary regionów sygnału (15 x 15 pikseli = 2,4 x 2,4 mm)2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 rozmiar jądra) przedstawiony w formie czerwonych i niebieskich kwadratów. Jednostki = ΔF/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Dane obrazowania serca z podwójnym sygnałem; analiza Vm i Ca, aktywacja, krzywe restytucji, rozdzielczość pikseli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5: Dane optyczne z perfundowanych w układzie Langendorffa serc świń. Niezpracowany, przefiltrowany przestrzennie (A) napięcie błonowe i (B) sygnały fluorescencji wapnia wewnątrzkomórkowego z prawej i lewej komory podczas stymulacji elektrycznej wierzchołka. Niefiltrowane, uśrednione przestrzennie sygnały przedstawiają optyczne potencjały czynnościowe i przejściowe zmiany stężenia wapnia w wybranych obszarach zainteresowania (jednostki sygnału to ΔF/F). (C) Nałożenie znormalizowanych stanów przejściowych ilustruje czas sprzężenia potencjału czynnościowego ze stanem przejściowym wapnia (przefiltrowane filtrem dolnoprzepustowym przy 75 Hz). (DPrzetwarzanie sygnałów z całej powierzchni epikardium w celu wygenerowania map izochronicznych parametrów czasowych, w tym czasu aktywacji (tDziałanie) i czasie repolaryzacji 80%. (EKrzywe przywracania stanu równowagi dla transjentów elektrycznych i wapniowych wygenerowane dla wielu częstotliwości (lewo) wraz z analizą statystyczną (prawo), obrazujące dłuższy czas repolaryzacji przy wolniejszych cyklach stymulacji. Paski skali = średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Odczynnik chemiczny</td >
			<td >Wzór</td >
			<td >Masa cząsteczkowa</td >
			<td >g/L</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Chlorek sodu</td>
			<td >NaCl</td >
			<td >58.4</td >
			<td >5.26</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Gluconian sodu</td>
			<td >C6H1NaO7</td >
			<td >218.14</td >
			<td >5.02</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Octan sodu trihydrat</td>
			<td >C2H3NaO2•3H2O</td >
			<td >136.08</td >
			<td >3.68</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Chlorek potasu</td>
			<td >KCl</td >
			<td >74.5</td >
			<td >0.63</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Chlorek magnezu (bezwodny)</td>
			<td >MgCl2</td >
			<td >95.21</td >
			<td >0.1405</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >8.4% wodorowęglan sodu</td>
			<td >NaHCO3</td >
			<td >84.01</td >
			<td >13</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Mannitol</td>
			<td >C6H14O6</td >
			<td >182.17</td >
			<td >16.3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Siarczan magnezu</td>
			<td >MgSO4</td >
			<td >120.37</td >
			<td >4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >pH</td >
			<td >7.4</td >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Osmolarność (mOsmol/L)</td >
			<td >294</td >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Zmodyfikowany skład kardioplegii del Nido.

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Nieprawidłowe funkcjonowanie układu krążenia jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. Izolowany model serca, który tutaj prezentujemy, może służyć jako eksperymentalne okno na dynamikę ludzkiego serca. Podejście to łączy klasyczne badanie elektrofizjologii z jednoczesnym mapowaniem optycznym napięcia transbłonowego i międzykomórkowego wapnia w celu oceny stanu serca.Metodologia ta może być stosowana do modelowania chorób, farmakologii i badań toksykologicznych. Na przykład jednym z obszarów, na których się skupiamy, jest scharakteryzowanie wpływu miarek szklanych na elektrofizjologię serca. Chociaż ta metodologia jest trudniejsza technicznie niż protokół, który wykorzystuje mniejszy model zwierzęcy, ogólnie rzecz biorąc, protokół jest stosunkowo prosty, gdy wszystkie elementy są na swoim miejscu.Trudno jest opisać wszystkie elementy systemu obrazowania i perfuzji za pomocą tekstu, więc wizualna demonstracja tego procesu pomoże w odtworzeniu udanego preparatu. Po odizolowaniu serca z nienaruszoną aortą wstępującą, zanurz wycięty narząd w lodowatej kardioplegii i użyj pary hemostatów, aby chwycić ścianę aorty. Wsuń naczynie na żebrowaną kaniulę przymocowaną do rurki podłączonej do jednego litra lodowatego podłoża do kardioplegii zawieszonego około 95 centymetrów nad sercem.Pozwól, aby płyn wypełnił aortę, aż naczynie się przeleje, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków do naczyń krwionośnych i użyj taśmy pępowinowej, aby przymocować aortę do kaniuli. Przywiąż hemostatyki, aby udźwignąć ciężar serca, które zwisa z kaniuli, aby dodatkowo zabezpieczyć tkankę i pozwolić zimnemu medium na wsteczne przenikanie serca pod stałym ciśnieniem 70 milimetrów słupa rtęci grawitacyjnie. Przenieś dźwięk do systemu Langendorffa o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wprowadzania powietrza do kaniuli.I pozwól, aby normalny rytm zatokowy wypłukał naczynia krwionośne z pozostałej krwi i kardioplegii. W przypadku arytmii ulegających wstrząsom należy umieścić zewnętrzne łopatki na wierzchołku i podstawie serca, aby zdefibrylować narząd, dostarczając pojedynczy wstrząs z prędkością pięciu dżuli i zwiększając w krokach co pięć dżuli, aż do osiągnięcia 50 dżuli, kardiowersji lub rytmu niewstrząsowego. Następnie przepłucz serce co najmniej jednym litrem zmodyfikowanej pożywki Krebs-Henseleit bez recyrkulacji, aby usunąć resztki krwi i kardioplegię.Gdy medium przepłynie przez serce, zamknij pętlę krążącą, aby ponownie wprowadzić perfuzat. Aby zarejestrować standardowe odprowadzenie do EKG w trakcie badania, przymocuj elektrodę igłową o rozmiarze 29 do nasierdzia komory w pobliżu wierzchołka i podłącz kolejną elektrodę w prawym przedsionku. Podłącz dodatnie i ujemne wejścia biowzmacniacza różnicowego odpowiednio do wierzchołka i prawego przedsionka i podłącz jedną bipolarną elektrodę bodźcową do prawego przedsionka, a drugą bipolarną elektrodę bodźcową do bocznej lewej komory w celu stymulacji.Stymuluj pracę serca za pomocą stymulatora elektrofizjologicznego, z prądem początkowym ustawionym na dwukrotność progu rozkurczowego i szerokością impulsu wynoszącą jedną milisekundę. Aby określić próg stymulacji, zastosuj serię impulsów bodźcowych o natężeniu od jednego do dwóch miliamperów z szerokością impulsu wynoszącą jedną milisekundę przy określonych długościach cyklu stymulacji, aby zapewnić spójną reakcję na bodziec. Wykonuj dodatkowe stymulacje bodźców, używając pociągu stymulacji S1, S1 lub S1, S2.Zmniejsz długość cyklu stymulacji S2 krok po kroku o 10 milisekund, aż nie uda się uchwycić tempa. Następnie przejdź do przedostatniego cyklu stymulacji i zmniejsz długość cyklu w odstępach jednomilisekundowych, aby określić najbardziej precyzyjną długość cyklu stymulacji przed utratą przechwytywania. Aby ustalić efektywny okres refrakcji komorowej, użyj elektrody stymulującej na bocznej lewej komorze, aby zidentyfikować najkrótszy interwał S1, S2, w którym przedwczesne uderzenie S2 inicjuje depolaryzację komór.Aby określić długość cyklu Wenckebacha, użyj elektrody stymulacyjnej na prawym przedsionku, aby znaleźć najkrótszy interwał S1, S1, w którym przewodnictwo przedsionkowo-komorowe jeden do jednego rozchodzi się normalną ścieżką przewodzenia. Aby określić czas regeneracji węzła zatokowego, użyj elektrody stymulacyjnej na prawym przedsionku, aby zastosować ciąg stymulacji S1, S1 i zmierzyć opóźnienie czasowe między ostatnim impulsem w pociągu stymulacji a przywróceniem spontanicznej aktywności węzła zatokowo-przedsionkowego. Aby ustalić efektywny okres refrakcji węzła przedsionkowo-komorowego, należy użyć elektrody stymulującej na prawym przedsionku.Znajdź najkrótszy interwał sprzężenia S1, S2, w którym po przedwczesnej stymulacji przedsionków następuje potencjał Hisbunche, który wywołuje zespół QRS, co oznacza depolaryzację komór. W celu optycznego mapowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowego wapnia, najpierw powoli dodaj do pięciu mililitrów świeżo przygotowanego barwnika napięciowego proksymalnie do kaniuli aortalnej, a następnie powoli dodaj świeżo przygotowany barwnik wapniowy. Następnie ustaw sprzęt do przetwarzania obrazu tak, aby ustawił ostrość na odpowiednim polu view i podłącz kamerę do stacji roboczej.Uzyskuj obrazy za pomocą wybranego oprogramowania z czasem naświetlania od 5 do dwóch milisekund. Wyrównaj obraz za pomocą oprogramowania, które może podzielić i nałożyć żądane obszary oraz wyświetlić odjęcie skali szarości lub dodanie pseudo-koloru do wszelkich niewspółosiowości podświetleń. Po zminimalizowaniu oświetlenia otoczenia przetestuj światła LED, aby zapewnić równomierne i maksymalne oświetlenie nasierdzia, zgodnie z głębokością studni czujnika.Następnie zobrazuj mięsień sercowy podczas rytmu zatokowego, migotania komór lub dynamicznego stymulacji za pomocą elektrody stymulacyjnej umieszczonej na lewej komorze, zaczynając od długości cyklu stymulacji 350 milisekund i zmniejszając się o 10 do 50 milisekund, aby wygenerować krzywe restytucji. Aby potwierdzić uzyskanie sygnału optycznego o odpowiedniej jakości podczas całego eksperymentu, otwórz plik wideo, wybierz obszar zainteresowania i wykreśl średnią fluorescencję w czasie. Pod koniec eksperymentu należy usunąć serce z układu i opróżnić perfuzat.Następnie przepłucz rurki i komory systemu oczyszczoną wodą. W celu rutynowej konserwacji należy okresowo płukać system roztworem detergentu w razie potrzeby. W tych reprezentatywnych badaniach procedura została przeprowadzona na nienaruszonych modelach, jak wykazano, o wielkości od 2,5 do 10,5 kilograma masy ciała i od 18 do 137 gramów masy serca.Po przeniesieniu izolowanego serca do systemu Langendorffa, tętno stabilizuje się na poziomie około 70 uderzeń na minutę w ciągu około 10 minut od defibrylacji i pozostaje stałe przez cały czas trwania badania. Zwykle mierzy się średnie natężenie przepływu około 184 mililitrów na minutę. Zwalnia do 70 mililitrów na minutę po perfuzji z podgrzanym medium zawierającym mechaniczny rozprzęgacz.Odprowadzenie drugie EKG może być rejestrowane przez cały czas trwania badania podczas rytmu zatokowego lub w odpowiedzi na stymulację zewnętrzną w celu ilościowego określenia parametrów elektrofizjologicznych. Eksperymenty z mapowaniem optycznym można również przeprowadzać podczas rytmu zatokowego i spontanicznego migotania komór. Reprezentatywne obrazy serca obciążonego barwnikiem można uzyskać z odpowiednimi optycznymi potencjałami czynnościowymi.A stany przejściowe wapnia można zebrać z dwóch obszarów zainteresowania na powierzchni nasierdzia. Ponadto dynamiczna stymulacja nasierdziowa może być stosowana podczas eksperymentów mapowania optycznego w celu normalizacji wszelkich niewielkich różnic w wewnętrznym tętnie. Surowe sygnały można wykorzystać do zobrazowania czasu przejściowego sprzężenia wapnia potencjału czynnościowego, czasu aktywacji i czasu trwania oraz restytucji elektrycznej i wapniowej.Ważne jest, aby nie dopuścić do przedostania się pęcherzyków do aorty, zminimalizować czas transferu ze zwierzęcia do układu i wspierać większe serce. Dane elektrofizjologiczne i sygnały optyczne mogą być analizowane po akwizycji. Dodatkowo serce może zostać zachowane po badaniu w celu histologii, barwienia immunologicznego lub analizy ekspresji genów.Używamy tej techniki do scharakteryzowania rozwoju serca u młodych ludzi i zbadania wpływu ekspozycji środowiskowych na fizjologię serca. Zarówno mechaniczne rozłączniki stosowane w celu zminimalizowania ruchu, jak i przeciwpienne chemikalia stosowane do spieniania albumin są toksyczne, dlatego stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej jest absolutnie niezbędne.

optocardiography-electrophysiology-studies-ex-vivo-langendorff

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis metodologii i wyników jednoczesnego endokardialnego i epikardialnego mapowania optycznego wzbudzenia elektrycznego w nienaruszonym lewym przedsionku serca owczego perfundowanego metodą Langendorffa podczas indukowanego rozciąganiem migotania przedsionków.

Optyczne mapowanie wysokiej rozdzielczości wsierdzia i osierdzia w owczym modelu migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

W tym filmie wykonujemy retrogradacyjną perfuzję Langendorffa izolowanego serca myszy. Podczas zabiegu czynność serca jest utrzymywana poprzez jego wsteczne perfuzję roztworem perfuzyjnym przez tętnice wieńcowe za pomocą kaniuli wprowadzanej do aorty wstępującej. Model służy do badania patofizjologii serca serca.

Wsteczna perfuzja serca Langendorffa: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Większość badań z udziałem aparatu Langendorffa wykorzystuje małe modele zwierzęce ze względu na zwiększoną złożoność systemów dla większych ssaków. Opisujemy system Langendorffa dla dużych modeli zwierzęcych, który pozwala na zastosowanie go u różnych gatunków, w tym ludzi, i stosunkowo łatwe pozyskiwanie danych.

Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół modulacji wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego i oceny jego wpływu na podstawową elektrofizjologię, arytmogenezę i dynamikę cAMP przy użyciu układu Langendorffa ex vivo.

Wpływ neuronów wewnątrzsercowych na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w układzie Langendorffa ex vivo

Obecny protokół opisuje kaniulację aorty i wsteczną perfuzję mysiego serca ex-vivo.  Strategia dwuosobowa, wykorzystująca mikroskop preparacyjny i igłę o małym grubym rozmiarze, pozwala na niezawodną kaniulację. Kwantyfikacja podłużnego napięcia skurczowego uzyskuje się za pomocą przetwornika siły podłączonego do wierzchołka lewej komory.

Zmodyfikowana technika wykorzystania mysich serc noworodków w preparacie Langendorffa

Obecny protokół opisuje metody ekspresji transgenu w sercach szczurów i myszy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa do mięśnia sercowego pod kierunkiem echokardiografii. Wyjaśniono również metody oceny podatności serca na komorowe zaburzenia rytmu serca poprzez programowaną stymulację elektryczną izolowanych serc z perfuzją Langendorffa.

Ekspresja transgenu wirusa w sercach gryzoni i ocena ryzyka arytmii serca

Prezentowany tutaj jest protokół do wiarygodnego ilościowego określenia funkcji prawej i lewej komory serca dawcy po konserwacji na zimno przy użyciu systemu perfuzji ex vivo.

Ocena funkcji dwukomorowej myszy ex vivo w modelu Langendorffa

Badania przesiewowe w kierunku choroby wieńcowej mogłyby zwiększyć liczbę dawców serc z rozszerzonymi kryteriami. Protokół wykonywania powtarzalnej koronarografii podczas perfuzji serca ex-situ opisano w niniejszym dokumencie na modelu świniowym.

Koronarografia podczas perfuzji serca ex situ w modelu świni

Poznaj metodę badania dynamiki serca przy użyciu izolowanego modelu serca świni. Technika łączy elektrofizjologię z podwójną emisją optokardiografii do oceny aktywności elektrycznej serca.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Przeglądaj więcej filmów