Name: Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę izolacji zamrożonych obszarów mózgu myszy CD-1 do ekstrakcji wysokiej jakości RNA i białek. Technika ta zachowuje integralność molekularną próbek i umożliwia analizy typu RT-qPCR, RNA-Seq oraz Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH, DA043982 i DA046196.

Zwierzęta użyte w tym badaniu były traktowane w sposób etyczny i humanitarny, zgodnie z wytycznymi Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz National Institutes of Health (NIH).
UWAGA: Wszystkie narzędzia i powierzchnie powinny być umyte odpowiednim rozpuszczalnikiem w celu usunięcia nukleaz18 przed rozpoczęciem jakiejkolwiek pracy.
1. Przechowywanie mózgów
<ol>
	<li>Szybko usuń mózgi z poddanych eutanazji dorosłych myszy typu dzikiego CD1 o wadze około 30 g przy użyciu konwencjonalnego podejścia13 i błyskawicznie zamroź przez 60 sekund w ciekłym azocie lub izopentanie wstępnie schłodzonym suchym lodem.</li>
	<li>Zamrożone mózgi należy przechowywać w temperaturze -80 °C w folii aluminiowej lub stożkowych probówkach do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie matrycy mózgowej
<ol>
	<li>Dwadzieścia cztery godziny przed wypreparowaniem tkanki umieść czystą matrycę mózgową (patrz Tabela materiałów) na stosie rozmrożonych opakowań do zamrażania. Umieść boki matrycy między dwoma opakowaniami zamrażarki, upewniając się, że pozostawiono około 0,5 cm między dolną częścią szczelin maszynki do golenia a górną częścią wkładów żelowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). Umieść folię aluminiową na końcach, aby wspomóc chłodzenie. 
	UWAGA: Kupując matrycę mózgową, kup taką, która jest wystarczająco duża, aby objąć całą objętość mózgu, która ma być poddana sekcji.</li>
	<li>Umieść na noc pudełko zawierające matrycę mózgu i opakowania do zamrażania w zamrażarce o temperaturze -20 °C z uchyloną górną częścią.</li>
</ol>
3. Ustawianie zamrożonej szklanej płyty
UWAGA: Celem tego ustawienia jest przygotowanie zamrożonej powierzchni, na której można przeprowadzić sekcję mózgu.
<ol>
	<li>Umieść lód w izolowanym pudełku w odległości do około 5 cm od góry. Następnie umieść 2,5 cm warstwę suchego lodu na wierzchu lodu i przykryj czarną folią z tworzywa sztucznego, aby pomóc w wizualizacji próbki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C).</li>
	<li>Umieść szklany talerz (powinien zmieścić się w otworze pudełka) na plastiku i umieść suchy lód na wierzchu talerza w odległych rogach (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Wyjmij zamrożoną macierz mózgową z zamrażarki i włóż mózg, który ma zostać przecięty korą do góry. Pozwól mu wyrównać się do temperatury w pudełku przez 10 minut. W tym czasie trzymaj pokrywę pudełka</li>.
	<li>Dostosuj pozycję mózgu w macierzy za pomocą zimnych kleszczy tak, aby zatoka strzałkowa i zatoka poprzeczna pokrywały się z prostopadłymi rowkami bloku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Pomoże to zapewnić symetryczne przekroje dla łatwiejszej sekcji. Dotknij końcówek kleszczy do suchego lodu na krótko, aby schłodzić się przed dostosowaniem mózgu.</li>
	<li>Gdy mózg znajdzie się na swoim miejscu, umieść schłodzoną żyletkę w pobliżu jej środka i wciśnij ostrze na około 1 mm w tkankę. Dodaj schłodzone ostrza do końców rostralnych i ogonowych, aby pomóc utrzymać mózg na miejscu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A i <silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Zaczynając od końca rostralnego, dodawaj ostrza pojedynczo, umieszczając je w szczelinach i delikatnie wciskając je w tkankę na około 1 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Kontynuuj dodawanie ostrzy w odstępach 1 mm, kierując się w stronę końca ogonowego.</li>
	<li>Upewnij się, że w tym czasie mózg się nie przesuwa. Ustaw ostrza poziomo i pionowo (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Do cięcia odcinków o szerokości 0,5 mm można użyć niskoprofilowych ostrzy mikrotomowych (patrz Tabela materiałów). Umieść je między większymi żyletkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Gdy ostrza znajdą się na swoim miejscu, dociśnij górną część grupy palcami, dłonią lub inną płaską powierzchnią (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C, <silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Powoli kołysz grupą ostrzy z boku na bok, aby przesuwać je przez tkankę. 
	UWAGA: Może to zająć trochę czasu (1–2 minuty) i wymaga cierpliwości. Powinien istnieć opór dla ostrzy poruszających się po tkance. Łatwe wejście oznacza, że mózg się rozmraża, a blok powinien być chłodzony suchym lodem.</li>
	<li>Gdy wszystkie ostrza dotrą do dna szczelin, chwyć każdą stronę grupy ostrzy i uwolnij się od matrycy, kołysząc się w przód iw tył. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uniknąć skaleczenia się ostrymi krawędziami ostrzy.</li>
	<li>Gdy grupa będzie wolna, połóż stos, rostralną stroną do góry, na szklanej płycie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). Umieść suchy lód obok i/lub na szczycie stosu, aby jeszcze bardziej zamrozić próbki w celu łatwiejszego oddzielenia.</li>
	<li>Połóż stos ostrymi krawędziami w dół na szklanej płycie i oddziel ostrza, przesuwając stos między kciukami i palcami. Ostrza powinny oddzielać się od siebie za pomocą dołączonych sekcji.</li>
	<li>Ułóż sekcje na szklanej płycie od rostralnego do ogonowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Oddziel tkankę od ostrzy, zginając ostrza między palcami lub oddzielając drugą zimną maszynką do golenia (rysunki 2G,2H,2I).</li>
</ol>
4. Sekcja preparowania
<ol>
	<li>Otwórz atlas mózgu myszy Allen lub inne odniesienie i znajdź punkty orientacyjne niezbędne do zidentyfikowania interesujących regionów. Niektóre oczywiste punkty orientacyjne to spoidło przednie, ciało modzelowate, komory boczne i hipokamp (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).</li>
	<li>Odwróć sekcję do cięcia za pomocą schłodzonych kleszczy i upewnij się, że obszar, który ma zostać zebrany, jest spójny w całej sekcji. Podczas zbiorów należy często zaglądać do atlasu referencyjnego, aby upewnić się, że uzyskano prawidłowy zwrot z inwestycji. 
	UWAGA: Lupa lub mikroskop preparacyjny są często pomocne w tym procesie. Niezbędne jest również dobre oświetlenie. Do tego celu można użyć lamp LED o niskiej mocy lub chłodnej lampy (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Czystym skalpelem lub dziurkaczem wytnij sekcję (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Schłodź każde narzędzie przed cięciem, dotykając go krótko, aby uzyskać suchy lód. Wciśnij ostrze delikatnie, ale stanowczo w tkankę, kołysząc nim w przód iw tył, aby wykonać cięcie. Nie naciskaj zbyt mocno, bo tkanka pęknie. 
	UWAGA: Narzędzia nagrzewają się z czasem. Lekko rozgrzane ostrza mogą być pomocne w wykonywaniu czystych cięć i mogą ograniczyć pękanie, ale należy uważać, aby uniknąć rozmrożenia tkanki. Okresowo schładzaj narzędzia na suchym lodzie.</li>
	<li>Po zebraniu ROI umieść go w oznakowanych, wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 1.5 ml. Pobrane tkanki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	<li>Zamrożoną tkankę zebraną w ten sposób przetworzyć poprzez dodanie zimnego buforu RIPA (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS i koktajlu inhibitorów białek (patrz Tabela materiałów)) do ekstrakcji białek lub rozpuszczalnika zawierającego guanidynę (patrz Tabela materiałów) do ekstrakcji RNA do zamrożonej próbki i natychmiast homogenizować za pomocą homogenizatora szklanego lub mechanicznego (patrz tabela materiałów). W ten sposób inhibitory proteazy i nukleazy są na miejscu, gdy próbka się nagrzewa, aby chronić białka i kwasy nukleinowe przed degradacją.</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%2C+Neuromethods%22">Neuroproteomics, Neuromethods</a>. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalkovits%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 103, Academic Press. 368-376 (1983).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf</a> (2008).</li>
<li>Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf</a> (2016).</li>
<li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy opisano technikę izolowania małych, specyficznych obszarów mózgu przy jednoczesnym ograniczeniu degradacji kwasu nukleinowego i białka. Do uszkodzenia tkanek mózgowych dochodzi szybko po śmierci organizmu. Jest to częściowo spowodowane szybkim gromadzeniem się zewnątrzkomórkowego glutaminianu i wynikającą z tego ekscytotoksycznością, która występuje21. Informacyjny RNA jest szczególnie podatny na degradację 22,23. Rozkład białek i ...

Ta praca ilustruje analizę zamrożonych obszarów mózgu w celu ekstrakcji wysokiej jakości kwasu nukleinowego lub białka za pomocą odniesienia, takiego jak Allen Mouse Brain Atlas1, jako przewodnik. W tej technice mózgi są zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze -80 °C w celu późniejszego cięcia i sekcji, podczas gdy są utrzymywane w stanie zamrożonym. Proces ten pozwala badaczowi na zebranie dużej liczby mózgów podczas jednej sesji, a następnie ich preparację w celu dokładnego zebrania wielu regionów mózgu.
Dokładny zbiór interesujących regionów mózgu (ROI) jest często wymagany podczas odpowiadania na pytania związane z ekspresją genów i białek. Podczas gdy farmakologia, elektrofizjologia i optogenetyka mogą być stosowane w przypadku gryzoni typu dzikiego lub zmodyfikowanego genetycznie, aby pomóc w wyjaśnieniu zmian molekularnych leżących u podstaw obserwowanych zachowań2,3,4, pomiar indukowanych zmian w transkryptomach i proteomach jest często wykorzystywany do poparcia tych ustaleń. Techniki takie jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), western blotting, RNAseq5, MAPSeq6 i HPLC7 są solidne i stosunkowo tanie, co pozwala wielu laboratoriom badać indukowane zmiany molekularne w małych obszarach mózgu2,4,5,6.
Istnieje kilka sposobów na ekstrakcję i oczyszczenie kwasu nukleinowego lub białka z obszarów mózgu8,9,10,11,12. Wiele laboratoriów pobiera próbki z obszarów mózgu poprzez schładzanie i cięcie mózgów na lodzie w czasie zbiorów9,13. Chociaż takie podejście może skutkować wysokiej jakości kwasem nukleinowym i białkiem, jest nieco ograniczone w czasie, ponieważ degradacja w mikrośrodowisku tkanki może zachodzić w tych temperaturach. Może to być szczególnie prawdziwe, gdy próbujesz przeprowadzić sekcję dużej liczby zwierząt lub ROI za jednym posiedzeniem. Utrzymywanie próbek w stanie zamrożonym pomaga utrzymać labilne cząsteczki docelowe, jednocześnie dając badaczowi czas na dokładne porównanie punktów orientacyjnych po obu stronach każdej sekcji w celu zebrania stosunkowo czystych próbek. Przechwytywanie laserowe to kolejny sposób na pobranie tkanki do analizy RNA lub białka z obszarów mózgu10. Ta procedura jest lepsza od sekcji mechanicznej, ponieważ można zidentyfikować i wyizolować bardzo małe i nieregularne obszary robocze. Jednak wychwytywanie laserowe jest ograniczone przez użycie drogiego sprzętu i odczynników, jest czasochłonne i może być również bardziej podatne na degradację próbki.
Mikrodziurkowanie zamrożonych tkanek nie jest niczym nowym. Wczesne prace Miklosa Palkovitsa i innych szczegółowo opisują podstawowe techniki14,15. Ta prezentacja w dużej mierze podąża za oryginalną pracą, z pewnymi ulepszeniami w celu zwiększenia wydajności i zmniejszenia kosztów potrzebnego sprzętu. Na przykład sekcje mózgu są wykonywane w zamrożonym bloku mózgowym, a nie na kriostacie. W ten sposób powstają grubsze sekcje, co zmniejsza liczbę sekcji potrzebnych do pobrania próbek ROI. Metoda ta polega również na rozwarstwieniu próbek na zamrożonej szklanej płytce, która znajduje się na suchym lodzie w izolowanym pudełku. W ten sposób na stole roboczym powstaje etap podmrożenia, na którym należy pracować. Przekroje analizowane w ten sposób są łatwe do manipulowania, co pozwala badaczowi porównać obie strony każdej sekcji z odniesieniem w celu ograniczenia zanieczyszczenia z regionów spoza pożądanego zwrotu z inwestycji.
Zalety tego protokołu to, że 1) mózg jest utrzymywany w stanie zamrożonym przez cały proces, co pomaga zachować białko i kwas nukleinowy oraz daje badaczowi czas na staranne zebranie ROI, oraz 2) wymagane odczynniki są tanie i można je znaleźć w większości laboratoriów biologii molekularnej. W tym procesie całe mózgi są cięte na 0,5–1,0 mm w macierzy mózgowej i umieszczane na zamrożonej szklanej płytce, która jest stale schładzana suchym lodem. Punkty orientacyjne znalezione w Allen Brain Atlas1 lub innych atlasach mózgu16,17 są używane do identyfikacji obszarów zainteresowania, które są następnie analizowane za pomocą zimnego stempla lub skalpela. Ponieważ tkanka nigdy nie jest rozmrażana, regiony zebrane w ten sposób dostarczają wysokiej jakości RNA i białka do dalszych analiz.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Mysia koronalna matryca mózgu</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>Blok tnący</td></tr><tr><td>0,5 mm Matryca koronalna mózgu szczura</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>Blok tnący</td></tr><tr><td>1,0 mm Dziurkacz do biopsji z tłokiem</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Dot Scientific</td><td>229443</td><td>Do przechowywania zamrożonych ROI</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 1,5 mm z tłokiem</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>69031-02</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 2,0 mm z tłokiem</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>4-12% żel NuPage</td><td>Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>żel gradientu białek</td></tr><tr><td>System Bioanalizatora</td> System <td>analizy RNA</td><td>Agilent</td><td>2100</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Dounce</td><td>Millipore Sigma</td><td> D8938</td><td>Homogenizator tkanek szklanych</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>Model 180</td><td>Chłodna lampa</td></tr><tr><td>Szklane płytki</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td> koktajl <td>inhibitorów proteazy</td></tr><tr><td>Niskoprofilowe ostrza</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-aktynowe</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>JLA20</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Używany we wstępnej analizie czystości RNA</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne nr 15</td><td>Surgical Design Inc</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Bufor blokujący</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>Zachodni odczynnik</td></tr> <tr>blokujący<td>Omni Tissue Master 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>Homogenizator tkanek</td></tr><tr><td>królik przeciwciało anty-KCC2</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>94725S</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>RNA Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>Służy do ekstrakcji RNA z małych próbek tkanek</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Excelta Corp.</td><td></td><td></td>16050103</tr><tr><td>Standardowe żyletki</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Służy do ekstrakcji RNA z tkanek</td></tr></tbody></table>

gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Wraz z postępem naszego zrozumienia neurobiologii, analizy molekularne są często wykonywane na małych obszarach mózgu, takich jak przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) lub jądro półleżące. Wyzwaniem w tej pracy jest przeanalizowanie właściwego obszaru przy jednoczesnym zachowaniu badanego mikrośrodowiska. W tym artykule opisujemy prostą, tanią metodę wykorzystującą zasoby łatwo dostępne w większości laboratoriów. Ta metoda zachowuje kwas nukleinowy i białka, utrzymując tkankę zamrożoną przez cały proces. Mózgi są cięte na odcinki o grubości 0,5–1,0 mm za pomocą matrycy mózgowej i układane na zamrożonej szklanej płycie. Punkty orientacyjne w każdej sekcji są porównywane z odniesieniem, takim jak atlas mózgu myszy Allena, a regiony są preparowane za pomocą zimnego skalpela lub stempla do biopsji. Tkanka jest następnie przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Dzięki temu procesowi mPFC szczurów i myszy, jądro półleżące, hipokamp grzbietowy i brzuszny oraz inne regiony zostały z powodzeniem przeanalizowane za pomocą qRT-PCR i testów zachodnich. Ta metoda jest ograniczona do obszarów mózgu, które można zidentyfikować za pomocą wyraźnych punktów orientacyjnych.

W celu walidacji tej metody pobrano przyśrodkową korę przedczołową od dorosłych samców myszy szczepu CD1 typu dzikiego, a następnie wyekstrahowano i scharakteryzowano RNA oraz białka. RNA przeanalizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej. Degradowane RNA wykazuje spadek intensywności prążków rybosomalnych 28S i 18S, a także obecność produktów degradacji w postaci rozmycia (smear) między 25 a 200 nukleotydami (Rycyna 5A, próbka 1). Wysokiej jakości RNA wykazuje wyraźne prążki rybosomalne prz...

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Procedura ta opisuje pobieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu niedrogich i powszechnie dostępnych narzędzi. Ponieważ obszary mózgu są utrzymywane w stanie zamrożonym od zbioru do sekcji, cząsteczki docelowe są zachowywane, a badacz ma czas na staranne przeanalizowanie i przechowywanie interesujących go regionów. Identyfikacja obszarów zainteresowania może początkowo być trudna.Korzystanie ze wspólnych punktów orientacyjnych mózgu, gdy pojawiają się i cofają przez sekcje w odniesieniu do pożądanych regionów, sprawi, że identyfikacja będzie jasna. Po usunięciu mózgów od uśpionych dorosłych myszy typu dzikiego CD-1, należy błyskawicznie zamrozić tkankę na 60 sekund w ciekłym azocie lub izopentanie. Wstępnie schłodzić suchym lodem i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Na 24 godziny przed wycięciem tkanki umieść czystą matrycę mózgu na stosie rozmrożonych opakowań do zamrażania. I umieść boki do matrycy między dwoma opakowaniami zamrażarki, upewniając się, że pozostawiłeś około pół centymetra między dolną częścią szczelin na maszynkę do golenia a górną częścią opakowań. Ustaw zamrożoną szklaną płytkę do

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikrosekcja mózgu szczura z podziałem na poszczególne obszary jest niezwykle istotna dla badania różnych chorób neurodegeneracyjnych. Niniejszy film demonstruje mikrosekcję czterech głównych obszarów mózgu, w tym oparyczu węchowego, kory czołowej, prążkowia oraz hipokampa w świeżej tkance mózgowej szczura. Przedstawiono pomocne wskazówki dotyczące szybkiego usuwania poszczególnych regionów, aby zapobiec degradacji RNA i białek w tkance.

Mikrodysekcja mózgu szczura w celu ekstrakcji RNA lub białek ze specyficznego obszaru mózgu

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Opisujemy szczurzy model zespołu stresu pourazowego (PTSD), który wykazuje trwałe zmiany w funkcji neuroendokrynnej oraz opóźnioną, długotrwałą i nasiloną reakcję lękową, charakterystyczną dla pacjentów z PTSD. Opisany tutaj model zwierzęcy oraz metody są przydatne do korelacji biomarkerów w jądrach mózgu, które mają charakter mechanistyczny, ale nie mogą być mierzone u pacjentów, z biomarkerami w obwodowych leukocytach, które podlegają pomiarowi.

Biomarkery w modelu zwierzęcym służące do ujawnienia korelatów neuronalnych, hematologicznych i behawioralnych PTSD

Ten film przedstawia szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący przygotowania zamrożonych skrawków tkanki mózgowej myszy do dalszych analiz.

Przetwarzanie mózgu myszy do dalszej analizy

Opisujemy użycie mikrodysekcji laserowej do uzyskania próbek różnych populacji komórek z różnych regionów mózgu do analizy genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na badanie zróżnicowanych skutków urazowego uszkodzenia mózgu w określonych obszarach mózgu szczura.

Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym

Tutaj prezentujemy protokół zamrażania i cięcia tkanki mózgowej od wielu zwierząt jako oszczędzającą czas alternatywę dla przetwarzania pojedynczych mózgów. Zmniejsza to zmienność barwienia podczas immunohistochemii i skraca czas kriosekcji i obrazowania.

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Poznaj metodę izolacji zamrożonych obszarów mózgu myszy CD-1 do ekstrakcji wysokiej jakości RNA i białek. Technika ta zachowuje integralność molekularną próbek i umożliwia analizy typu RT-qPCR, RNA-Seq oraz Western blot.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Przeglądaj więcej filmów