Name: Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metodę pomiaru masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych oraz limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej. Technika umożliwia analizę metabolizmu mitochondrialnego w małych populacjach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie Centralnemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej UNIL, szczególnie Dr. Romainowi Bedelowi. Praca ta została wsparta grantem fundacji Kristiana Gerharda Jebsena dla N.V i O.N.

Wszystkie eksperymenty opisane w manuskrypcie są zgodne z wytycznymi naszej instytucji i zostały przeprowadzone zgodnie ze szwajcarskim prawem dla eksperymentów na zwierzętach (Autoryzacja: VD3194) oraz dla badań z udziałem próbek ludzkich (Protokół: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Ekstrakcja hematopoetycznych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Kup myszy C57BL6/J typu dzikiego i trzymaj je w pomieszczeniu dla zwierząt przez co najmniej tydzień, aby zmniejszyć stres związany z transportem.</li>
	<li>W dniu eksperymentu poddać mysz eutanazji za pomocą uduszenia CO2 .</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem, aby wysterylizować futro i rozetnij mysz na brzuchu za pomocą standardowych narzędzi chirurgicznych, takich jak nożyczki preparacyjne i kleszcze, aby przeciąć kości udowe i piszczelowe od tylnych nóg.</li>
	<li>Usuń mięśnie przyczepione do kości udowej, piszczelowej i miednicy za pomocą miękkiego ręcznika papierowego i umieść oczyszczone kości w probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS z 1 mM EDTA (buforem) na lodzie.</li>
	<li>Spryskaj moździerz i tłuczek 70% etanolem i umieść je w kapturze do hodowli komórkowych. Sterylizuj UV przez 30 min. Po sterylizacji spłucz moździerz i tłuczek buforem, aby usunąć ślady etanolu.</li>
	<li>Umieść czyste kości z odrobiną buforu (~10 ml) w moździerzu i delikatnie je zmiażdż, aby wydostać szpik kostny w postaci zawiesiny. Teraz zbierz zawiesinę komórek i przepuść ją przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
	<li>Powtarzaj krok 1.6, aż cały szpik kostny zostanie usunięty, a resztki kości zmienią kolor na biały.</li>
	<li>Umieścić probówkę (probówki) o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę jednokomórkową szpiku kostnego na wirówce. Uruchomić wirówkę przy 300 x g na 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj 10 ml 1x buforu do lizy RBC w autoklawowanej wodzie destylowanej. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm.</li>
	<li>Pobrać probówkę z próbką z wirówki i zdekantować supernatant. Odpipetować 1x bufor do lizy RBC (tabela materiałów) na osad komórkowy. Usunąć osad i przygotować jednorodny roztwór, pipetując kilka razy w górę i w dół. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 1–2 minuty, aby nastąpiła liza RBC. Zatrzymaj proces lizy, napełniając probówkę buforem.</li>
	<li>Umieścić probówkę na wirówce i wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić osad, dodając 10 ml buforu i przefiltrować roztwór do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sitka do komórek 70 μm, aby usunąć zanieczyszczenia spowodowane lizą RBC.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 500 μl buforu.</li>
	<li>Wyjąć podwielokrotność 100 μl i przechowywać w osobnej probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl koktajlu przeciwciał zubożających linię biotyny z zestawu wzbogacającego progenitory (tabela materiałów) do pozostałych 450 μl zawiesiny komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 15 ml buforu i odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 460 μl buforu. Pobrać podwielokrotność 10 μl i przechowywać w osobnej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny z zestawu do wzbogacania progenitorów (tabela materiałów) do pozostałych 450 μl zawiesiny komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 15 ml buforu i odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 5 ml buforu i przenieść roztwór do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przenieść probówkę do automatycznego separatora komórek (tabela materiałów). Uruchom program mycia, aby przepłukać i zalać rurki separatora komórek. Umieścić próbkę i dwie probówki zbiorcze na uchwycie probówki. Wykonaj separację za pomocą programu "Zubożenie". Zbierz frakcje dodatnie i ujemne z automatycznego separatora komórek po zakończeniu cyklu. 
	nuta: W przypadku braku automatycznego separatora komórek użytkownicy mogą korzystać z ręcznych kolumn magnetycznych i odpowiednich magnesów, zgodnie z instrukcją obsługi. Użytkownicy powinni pamiętać, że proces ręcznej separacji jest wolniejszy niż automatycznej. Ponadto kolumny ręczne są bardziej podatne na zatykanie. Dlatego użytkownikom zaleca się rozcieńczanie próbki i powolne ładowanie kolumny.</li>
	<li>Odrzuć frakcję dodatnią. Napełnij probówkę z frakcją ujemną buforem. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W międzyczasie przygotować mieszaninę przeciwciał w 1 ml roztworu do końcowej objętości, a jednokolorowe kontrole w 200 μl roztworu do końcowej objętości, jak opisano w Tabeli Materiałów i Tabeli 1. 
	nuta: Jeśli TMRM i zielone fluorescencyjne barwienie mitochondriów mają być połączone z barwieniem markerem komórek macierzystych, należy zastąpić CD150-PE CD150-PEcy5, a czerwień Streptavidin-Tx Streptavidin-Pac Orange.</li>
	<li>Pobrać probówkę z próbką z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 1 ml mieszanki przeciwciał. Dodaj 10 μl komórek (z kroku 1.13) do każdej z jednokolorowych probówek kontrolnych (z wyjątkiem linii). Dodaj 10 μl komórek (z kroku 1.14) do jednokolorowej probówki z linią produkcyjną.</li>
	<li>Inkubować próbkę i jednokolorowe probówki kontrolne w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez 45 minut. Przykryć wiadro na lód pokrywką lub folią aluminiową.</li>
	<li>Napełnić wszystkie probówki buforem i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbkę w 1 ml buforu, a jednobarwne kontrole w 200 μl buforu.</li>
	<li>Przenieś próbkę i jednokolorowe kontrolki do górnych probówek FACS o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Weź probówki do maszyny sortującej i posortuj populację HSC (strategia bramkowania w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) w probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 400 μl pożywki do namnażania komórek macierzystych.</li>
</ol>
2. Hodowla ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Zebrać probówki zawierające posortowane komórki (patrz sekcja 1 dotycząca ekstrakcji komórek). Odwirować probówki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie usunąć większość supernatantu bez usuwania osadu i pozostawić 50–80 μl na wierzchu osadu komórkowego. Minimalizuje to utratę komórek.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w pożywce do ekspandowania komórek macierzystych do końcowej objętości w zależności od liczby warunków, które mają być badane (liczba na 100 μl na studzienkę/warunek hodowli).</li>
	<li>Przygotować 2x pożywkę hodowlaną zawierającą pożywkę do ekspandowania komórek macierzystych, czynnik komórek macierzystych (200 ng/ml), ligand FLT3 (4 ng/ml) i antybiotyki pen-strep (1%) (2x podłoże podstawowe; Tabela materiałów).</li>
	<li>Weź sterylną kulturę tkankową poddaną działaniu 96 U-dolnej płytki dołkowej (tabela materiałów) i zidentyfikuj studzienki, w których komórki będą hodowane (projekt płytki w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). 
	nuta: Użytkownikom zaleca się unikanie studni brzeżnych, ponieważ są one bardziej podatne na parowanie.</li>
	<li>Umieść 100 μl 2x podłoża podstawowego przygotowanego wcześniej w kroku 2.3 do tych studzienek. Do dobrze oznaczonej NR dodać 2 μl roztworu 100x NR (Tabela Materiałów). Uzupełniaj NR co 24 godziny < >
	nuta: Uzupełnianie zapasów jest specyficzne dla NR. Inne modulatory metaboliczne mogą, ale nie muszą, wymagać uzupełnienia.</li>
	<li>Wysiewać 100 μl komórek przygotowanych w kroku 2.2 na wierzchu studzienek zawierających 2x podłoże podstawowe. W tym eksperymencie liczba HSC wysianych na studzienkę wynosiła od 800 do 1000 komórek.</li>
	<li>Przygotuj pięć dodatkowych studzienek zawierających 2x podłoże podstawowe. Do każdego z nich dodać 100 000 całych komórek szpiku kostnego (z kroku 1.13) zawieszonych w 100 μl pożywki do ekspandowania komórek macierzystych, która ma być wykorzystana jako kontrola barwienia do analizy cytometrii przepływowej po hodowli. 
	nuta: Jeśli użytkownicy chcą połączyć markery komórek macierzystych i markery mitochondrialne do analizy po hodowli, zaleca się dodatkowe sortowanie populacji progenitorów (komórki Ckit+ lub komórki LKSCD150-). Zasiej te posortowane progenitory w studzienkach kontrolnych barwienia w celu analizy cytometrii przepływowej po hodowli. Przygotuj jedną studzienkę na pojedynczy kolor plamy.</li>
	<li>Wlej 200 μl autoklawizowanej wody do wszystkich okolicznych studzienek, aby zmniejszyć parowanie ze studni zawierających komórki. Pozostawić płytkę w nienaruszonym stanie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cały okres hodowli (72 godziny). Wyjąć płytkę, aby uzupełnić NR co 24 godziny i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
3. Pomiar masy mitochondriów i potencjału błonowego
<ol>
	<li>Pod koniec okresu hodowli przygotuj 100-krotny roztwór TMRM (20 μM) i Mitotracker green (10 μM) (zielone barwienie fluorescencyjne) w pożywce do ekspandowania komórek macierzystych (tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 2 μl 100x roztworu TMRM i 2 μl 100x roztworu zielonej fluorescencji do każdej z dołków testowych. Dodaj 2 μl 100x TMRM do studzienki kontrolnej TMRM. Dodaj 2 μl 100x zielonej plamy fluorescencyjnej do studzienki kontrolnej Mitotracker. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 45 minut. Przykryj górną część talerza folią aluminiową. 
	nuta: Dodatkowa kontrola z Verapamilem (inhibitorem pompy ABC) może być przygotowana, jeśli konieczne jest przetestowanie wypływu barwnika za pośrednictwem pompy ABC. W tym celu dodać 50 μM Werapamilu do jednej z studzienek testowych na 1 godzinę przed barwieniem na TMRM i barwienie zieloną fluorescencyjną.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i odwirować ją przy sile 300 x g przez 5 minut. Odwrócić płytkę, aby usunąć supernatant. Dodać 200 μl standardowego buforu FACS (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), odwirować płytkę przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant. Powtórz ten krok prania 3 razy. Użytkownicy muszą upewnić się, że płyta jest zawsze przykryta folią, aby zapewnić minimalną ekspozycję na bezpośrednie działanie światła. 
	nuta: Jeśli użytkownicy muszą połączyć barwienie mitochondriów z barwieniem komórek macierzystych, próbka będzie musiała być inkubowana z mieszanką przeciwciał wszystkich markerów komórek macierzystych, a jednokolorowe kontrole będą musiały być barwione pojedynczymi przeciwciałami oddzielnie w temperaturze 4 °C przez 30–45 min. 
	nuta: Na wszystkich etapach użytkownicy muszą przykryć płytę folią aluminiową. Użytkownicy muszą pamiętać, że ten dodatkowy etap barwienia i kolejne etapy prania mogą spowodować dodatkową utratę komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS i przenieść do probówek FACS.</li>
	<li>Uruchom próbki na cytometrze przepływowym (patrz Rysunek 1). Jednokolorowe probówki zawierające WBM obejmują: (1) Niebarwione; (2) DAPI; 3) TMRM (PE); (4) zielona plama fluorescencyjna (FITC); (5) Pełna plama (PE i FITC).</li>
	<li>Najpierw zdobądź jednokolorowe elementy sterujące, aby skonfigurować urządzenie. Użyj uruchomionego oprogramowania na maszynie, aby obliczyć odszkodowanie. Po zastosowaniu kompensacji należy pobrać próbkę HSC i zarejestrować jak najwięcej zdarzeń. 
	nuta: W przypadku połączenia markerów komórek macierzystych i mitochondriów, użytkownicy muszą być szczególnie ostrożni przy kompensacji między TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) i Sca-1 (APC). Ponadto próbki należy uruchomić natychmiast po barwieniu.</li>
	<li>Wyeksportuj pliki FACS z cytometru i przeanalizuj dane w oprogramowaniu analitycznym (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić analizę, otwórz plik w oprogramowaniu do analizy. Za pomocą bramkowania FSC-A i SSC-A zidentyfikuj populację komórek. Zidentyfikuj pojedyncze punkty w następnych bramkach przed wykreśleniem frakcji ujemnej DAPI (żywe komórki). W bramie komórki pod napięciem wykonaj wykres konturowy w kanale TMRM i zielonym fluorescencyjnym barwieniu, aby zmierzyć odpowiednio ΔΨm i masę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Eksportuj średnią intensywność fluorescencji (MFI) tych dwóch kanałów w bramce komórki na żywo.</li>
		<li>Dolna bramka TMRM jest ustawiana na podstawie populacji pobocza w kanale TMRM. Jednokolorowa kontrolka TMRM może służyć do identyfikowania tej populacji pobocza w celu ustawienia bramy. Eksportuj proporcję żywych komórek w niskiej bramce TMRM w próbkach kontrolnych i testowych do wykreślenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li>
<li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li>
<li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405(2019).</li>
<li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+a+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li>
<li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li>
<li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+Watch%3A+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344(2014).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li>
<li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li>
<li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8%2B+T+cell+memory+and+antitumor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li>
</ol>

Niektóre elementy tej pracy zostały złożone jako P1828EP00 zgłoszeniowe do Europejskiego Urzędu Patentowego.

Ścisła regulacja funkcji HSC jest ważna dla utrzymania stabilnej hematopoezy w ciągu życia organizmu. Podobnie jak różne inne typy komórek w organizmie, kluczowym składnikiem, który przyczynia się do regulacji funkcji HSC, jest metabolizm komórkowy. Poprzednie badania z naszego laboratorium9 i innych 2,3 sugerowały znaczenie mitochondriów w utrzymaniu odrębnego stanu metabolicznego w HSC. Ze względu na wyjątkowo niską liczbę HSC wyizolowanych z mysiego szpiku kos...

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) to niewielka populacja komórek znajdujących się w szpiku kostnym, zapewniająca produkcję krwi i homeostazę przez całe życie organizmu. HSC pośredniczą w tym procesie, dając początek progenitorom, które z kolei wytwarzają terminalnie zróżnicowane linie dojrzałych komórek krwi poprzez kilka rund podziału komórkowego i dobrze zaaranżowane etapy różnicowania1. Co ważne, HSC wytwarzają swoją energię w procesie glikolizy beztlenowej. Natomiast bardziej zaangażowani i aktywni przodkowie układu krwiotwórczego przestawiają swój metabolizm w kierunku metabolizmu mitochondrialnego2,3,4. Uważa się, że ten odrębny stan metaboliczny chroni HSC przed uszkodzeniami komórek spowodowanymi przez reaktywne formy tlenu (ROS) wytwarzane przez aktywne mitochondria, utrzymując w ten sposób ich długoterminową funkcję in vivo5,6,7,8. Bezpośredni pomiar stanu metabolicznego HSC jest trudny i często ma niską przepustowość ze względu na ich ograniczoną liczbę. W tym miejscu opisujemy test oparty na cytometrii przepływowej do solidnego pomiaru potencjału błonowego mitochondriów (ΔΨm) przy użyciu fluorescencji estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM) i masy mitochondrialnej przy użyciu zielonego fluorescencyjnego barwnika mitochondrialnego (Mitotracker Green) w HSC. Wcześniej wykazaliśmy, że niskie ΔΨm jest prawdziwym funkcjonalnym markerem wysoce oczyszczonych HSCs9 i modulatorów metabolicznych zdolnych do obniżania ΔΨm wzmacnia funkcję HSCs9,10. W tym miejscu proponujemy wykorzystanie naszej metody profilowania mitochondriów HSC jako strategii identyfikacji nowych cząsteczek zdolnych do poprawy długoterminowego potencjału rekonstytucji krwi HSC.
Jako przykład, pokazujemy, że ten test wiarygodnie mierzy obniżenie HSC ΔΨm po ekspozycji na analog witaminy B3, rybozyd nikotynamidu (NR). W związku z tym w naszym niedawno opublikowanym badaniu wykazaliśmy, że NR silnie poprawia regenerację krwi po przeszczepie zarówno u myszy, jak i humanizowanych myszy poprzez bezpośrednią poprawę funkcji krwiotwórczych pni i progenitorów10. Zdolność takich modulatorów metabolicznych ma dużą wartość kliniczną, biorąc pod uwagę, że 25% śmiertelność jest związana z opóźnieniem powrotu krwi i odporności u pacjentów po przeszczepie11,12.
Ponadto, dostarczamy dowodów na to, że ta metodologia może być zastosowana do charakterystyki profilu metabolicznego i funkcji ludzkich limfocytów T. W ostatnich latach rozwój adoptywnej terapii komórkowej (ACT) z wykorzystaniem autologicznych limfocytów naciekających nowotwór (TIL) stał się najskuteczniejszym podejściem do niektórych typów zaawansowanych nowotworów o wyjątkowo niekorzystnym rokowaniu (np. czerniak z przerzutami, gdzie >50% pacjentów reaguje na leczenie, a do 24% pacjentów ma całkowitą regresję)13. Jednak TIL o wystarczającej aktywności przeciwnowotworowej są trudne do wygenerowania14. Rozległa proliferacja i stymulacja, której poddawane są TIL podczas ekspansji ex vivo, powoduje wyczerpanie i starzenie się limfocytów T, co dramatycznie upośledza odpowiedź przeciwnowotworową limfocytów T15. Co ważne, zdolność przeciwnowotworowa TIL jest ściśle związana z ich metabolizmem16,17, a podejścia mające na celu modulację metabolizmu poprzez hamowanie szlaku PI3K/Akt przyniosły zachęcające wyniki18,19. Z tego powodu porównujemy ΔΨm limfocytów T pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i TIL pochodzących od pacjentów i pokazujemy, że mniej zróżnicowane limfocyty T pochodzące z PBMC mają niższy ΔΨm i masę mitochondrialną w porównaniu z kończnie zróżnicowanymi TIL.
Przewidujemy, że ten test może być wykorzystany do identyfikacji nowych modulatorów metabolicznych, które poprawiają funkcję komórek HSC i T poprzez modulację ΔΨm.

<table><tbody><tr><td>Probówki FACS 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Płyta dolna 96-U</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Separator AutoMACS pro</td> do <td>hodowli komórkowych Miltenyi Biotec</td><td></td><td>Automatyczna separacja komórek</td></tr><tr><td>BD FACS AriaIII</td><td>Becton i Dickinson</td><td></td><td>Sortowanie komórek</td></tr><tr><td>BD IMag zestaw do wzbogacania krwiotwórczych komórek progenitorowych myszy</td><td>BD</td><td>558451</td><td>Zubożenie linii</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>Maszyna do akwizycji FACS</td><td>Becton and Dickinson</td><td></td></tr><tr><td>BD-DIVA</td><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Becton and Dickinson</td><td></td></tr><tr><td>CD150 PE</td><td>Biolegend</td><td>115904</td><td>Mieszanka do barwienia przeciwciał</td></tr><tr><td>CD150 PE-Cy5</td><td>Biolegend</td><td>115912</td><td>Mieszanka do barwienia przeciwciał</td></tr><tr><td>CD48 PB</td><td>Biolegend</td><td>103418</td><td>Mieszanka do barwienia przeciwciał</td></tr><tr><td>Wirówka- 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Wirowanie</td></tr><tr><td>Ckit PeCy7 Biolegend</td><td></td><td>105814</td><td>Mieszanka do barwienia przeciwciał</td></tr><tr><td>Flow jo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy FACS</td></tr><tr><td>GraphPad-Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Wykres danych na wykresach</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>Barwienie mitokondrium o zielonej fluorescencji do pomiaru masy mitochondrialnej; stężenie robocze = 100 nM; stężenie zapasów = 1 mM</td></tr><tr><td>Rybozyd nikotynamidu (NR)</td><td>Specjalnie syntetyzowany w domu</td><td></td><td>Modulator metaboliczny; stężenie robocze = 500 &mikro; M; stężenie zapasów = 50 mM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>CHUV</td><td></td> 1000324 <td>Przygotowanie buforu; stężenie robocze = 1x; stężenie zapasu = 1x</td></tr><tr><td>Pen-Strep (P/S)</td><td>Technologie życia</td><td>15140122</td><td>Hodowla ex vivo; stężenie robocze = 1x; stężenie zapasu = 1x</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>Liza Czerwone krwinki; stężenie robocze = 1x; stężenie zapasu = 10x</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi ligand Flt-3 (FLT3)</td><td>RnD</td><td>427-FL-005/CF</td><td>Hodowla ex vivo; stężenie robocze = 2 ng/mL; stężenie podstawowe = 10 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik mysich komórek macierzystych (SCF)</td><td>RnD</td><td>455-MC-010/CF</td><td>Hodowla ex vivo; stężenie robocze = 100 ng/mL; stężenie podstawowe = 50 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Sca1 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5981-82</td><td>Mieszanka do barwienia przeciwciał</td></tr><tr><td>StemlineII Pożywka do ekspansji hematopoetycznych komórek macierzystych</td><td>SIGMA</td><td>S0192</td><td>Hodowla ex vivo</td></tr><tr><td>Streptawidyna Pac pomarańczowa</td><td>Life Technologies</td><td>S32365</td><td>Mieszanka do barwienia przeciwciał</td></tr><tr><td>Streptawidyna Tx czerwona</td><td>Life Technologies</td><td>S872</td><td>Mieszanka</td></tr> <tr><td>do barwienia przeciwciałTMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>Barwienie potencjału błony mitochondrialnej; stężenie robocze = 200 nM; stężenie podstawowe = 10 mM</td></tr><tr><td>Ultra czysty EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Przygotowanie buforu; stężenie robocze = 0,5 M; stężenie wyjściowe = 1 mM</td></tr></tbody></table>

pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach t metodą cytometrii przepływowej

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Delikatna równowaga między spoczynkiem, samoodnawianiem się i różnicowaniem jest kluczem do zachowania puli krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) i utrzymania produkcji wszystkich dojrzałych komórek krwi przez całe życie. W ostatnich latach metabolizm komórkowy stał się kluczowym regulatorem funkcji i losu HSC. Wcześniej wykazaliśmy, że modulacja metabolizmu mitochondrialnego wpływa na los HSC. W szczególności, poprzez chemiczne rozprzęgnięcie łańcucha transportu elektronów, byliśmy w stanie utrzymać funkcję HSC w warunkach hodowli, które normalnie indukują szybkie różnicowanie. Jednak ograniczenie liczby HSC często wyklucza stosowanie standardowych testów do pomiaru metabolizmu HSC, a tym samym przewidywania ich funkcji. W tym miejscu przedstawiamy prosty test cytometrii przepływowej, który umożliwia wiarygodny pomiar potencjału błony mitochondrialnej i masy mitochondrialnej w rzadkich komórkach, takich jak HSC. Omówiono izolację HSC ze szpiku kostnego myszy oraz pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego po hodowli ex vivo. Jako przykład pokazujemy modulację tych parametrów w HSC poprzez leczenie modulatorem metabolicznym. Co więcej, rozszerzamy zastosowanie tej metodologii na ludzkie limfocyty T pochodzące z krwi obwodowej i ludzkie limfocyty naciekające nowotwór (TIL), wykazując dramatyczne różnice w ich profilach mitochondrialnych, co może odzwierciedlać różne funkcje limfocytów T. Uważamy, że ten test może być stosowany w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji modulatorów metabolizmu mitochondrialnego w różnych typach komórek w różnych kontekstach.

Na Ryc. 1 przedstawiono strategię bramkowania służącą do izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych ze szpiku kostnego myszy oraz układ płyty do ich hodowli ex vivo. Ryc. 1A pokazuje identyfikację frakcji limfocytów na wykresie SSC-A/FSC-A. Dublety zostały usunięte w bramce singletów, a następnie zidentyfikowano żywe komórki na podstawie braku sygnału DAPI. Zidentyfikowano populację LKS, zdefiniowaną jako lineage- Sca1+cKit...

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Protokół ten jest prostym testem opartym na cytometrii przepływowej, umożliwiającym pomiar potencjału błony mitochondrialnej i masy mitochondrialnej w żywych komórkach. Standardowe testy metaboliczne zawodzą w pracy z rzadkimi populacjami, takimi jak hematopoetyczne komórki macierzyste. Metoda ta umożliwia użytkownikom profilowanie błony mitochondrialnej podczas pracy z małą liczbą komórek oraz określenie nowych modulatorów metabolicznych komórek, takich jak HSC.Co więcej, można go połączyć z dalszymi testami funkcjonalnymi, takimi jak przeszczep szpiku kostnego lub testy tworzenia kolonii, aby określić funkcjonalność komórek po hodowli. Nasza technika może zostać wykorzystana do identyfikacji nowych cząsteczek zdolnych do poprawy funkcji HSC w kontekście przeszczepu szpiku kostnego i regeneracji układu krwiotwórczego po terapiach ablacyjnych. Jak opisano w naszym protokole, nasza metoda może być stosowana do oceny sprawności metabolicznej immunologicznych limfocytów T.Bardzo ważne jest, aby komórki miały minimalną ekspozycję na światło po barwieniu. Ponadto należy uwzględnić stosowanie inhibitora pompy werapamilu w celu oceny udziału wypływu pompy. Jednak, użytkownicy muszą być świadomi, że werapamil głęboko zaburza równowagę jonową i nie może być stosowany w celu oceny wpływu modulatora metabolicznego na potencjał błony mitochondrialnej.Wizualna demonstracja tej metody jest niezwykle ważna, ponieważ istnieje kilka krytycznych kroków, o których należy pamiętać podczas pracy z małą liczbą komórek, a tych kroków bardzo często brakuje w zwykłych artykułach, które użytkownicy czytają w PubMed. W przypadku sortowania FAC identyfikowana jest populacja LKS, zdefiniowana przez linię ujemną, Sca1 dodatnią, cKit dodatnią. Hematopoetyczne komórki macierzyste z około 5 do 10% komórek w populacji LKS są identyfikowane przez bramkowanie dla populacji CD150-dodatniej, CD48-ujemnej, oznaczonej jako HSC.Po posortowaniu krwiotwórczych komórek macierzystych należy odwirować probówki o ciśnieniu 300 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Delikatnie usuń większość supernatantu bez usuwania osadu i pozostaw od 50 do 80 mikrolitrów na wierzchu osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do ekspandowania komórek macierzystych do końcowej objętości 200 mikrolitrów.Przygotować sterylną płytkę dołka 96 U z dnem i zidentyfikować studzienki, w których komórki będą hodowane. Przenieś 100 mikrolitrów 2x podłoża podstawowego wcześniej przygotowanego w tych studzienkach. W dobrze oznaczonym NR dodaj dwa mikrolitry 100x roztworu rybozydu nikotynamidu.Przenieś 100 mikrolitrów 2x podłoża podstawowego do studzienek w celu kontroli barwienia. Wysiewaj 100 mikrolitrów przygotowanych hematopoetycznych komórek macierzystych na wierzchu studzienek zawierających 2x podłoże podstawowe. Wysiewać 100 mikrolitrów całych komórek szpiku kostnego na studzienkach oznaczonych jako kontrole barwienia.Dodaj 200 mikrolitrów autoklawizowanej wody do wszystkich okolicznych studzienek, aby zmniejszyć parowanie ze studni zawierających komórki. Umieść płytkę w spokoju w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla na 72 godziny. Wyjmuj płytkę, aby uzupełnić rybozyd nikotynamidu co 24 godziny i włóż ją z powrotem do inkubatora.Pod koniec okresu hodowli dodać dwa mikrolitry 100x roztworu TMRM i dwa mikrolitry 100x roztworu zielonej fluorescencji do każdej z basen testowych. Dodaj dwa mikrolitry 100x TMRM do studzienki kontrolnej barwienia TMRM. Dodaj dwa mikrolitry 100-krotnej zielonej fluorescencyjnej plamy do studzienki kontrolnej barwienia MitoTracker.Przykryj górną część talerza folią aluminiową i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla na 45 minut. Wyjąć płytkę z inkubatora i odwirować ją w temperaturze 300 razy g przez pięć minut.Odwrócić płytkę, aby usunąć supernatant i dodać 200 mikrolitrów standardowego buforu FACS w celu ponownego zawieszenia. Przykryj talerz folią. Odwirować płytkę w ilości 300 razy g przez pięć minut.Powtórz ten krok prania trzy razy. Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu FACS i przenieść do probówek FACS. Aby uruchomić próbki na cytometrze przepływowym, najpierw załaduj do urządzenia pojedyncze kolorowe elementy sterujące i zapisz co najmniej 5 000 zdarzeń w każdym z nich jeden po drugim.W oprogramowaniu naciśnij Pobierz, a następnie Nagraj na pulpicie nawigacyjnym, aby uzyskać i nagrać pojedyncze elementy sterujące kolorem. Naciśnij przycisk Ustawienia rekompensaty, a następnie kliknij przycisk Oblicz odszkodowanie, aby obliczyć odszkodowanie. Po zastosowaniu kompensacji należy pobrać próbkę krwiotwórczych komórek macierzystych i zarejestrować jak najwięcej zdarzeń.Wyeksportuj pliki FACS z cytometru i otwórz plik w oprogramowaniu do analizy. W FlowJo użyj bramkowania rozproszenia do przodu i bramkowania rozproszenia bocznego, aby zidentyfikować populację komórek. Zidentyfikuj pojedyncze punkty w następnych bramkach, a następnie wykreśl ujemną frakcję DAPI reprezentującą żywe komórki.W bramie żywej komórki wykonaj wykres konturowy w TMRM i kanale barwienia fluorescencyjnego, aby zmierzyć odpowiednio potencjał i masę błony mitochondrialnej. Eksportuj średnią intensywność fluorescencji tych dwóch kanałów w bramce komórki na żywo. Następnie wyeksportuj proporcję komórek w niskiej bramce TMRM we wszystkich próbkach.Leczenie rybozydem nikotynamidu wykazało wyraźny wzrost populacji z niskim poziomem TMRM. Znacząco zwiększył również odsetek komórek w niskiej bramce TMRM i wykazał znaczne obniżenie intensywności fluorescencji TMRM. Masa mitochondrialna nie zmieniła się po suplementacji rybozydem nikotynamidu.Dodatkowo barwienie markerami komórek macierzystych połączono z barwieniem mitochondriów po hodowli. Dzięki strategii bramkowania w celu identyfikacji hematopoetycznych komórek macierzystych, narażenie na rybozyd nikotynamidu wykazało znaczny wzrost populacji o niskim poziomie TMRM i znaczny spadek intensywności fluorescencji TMRM w bramkowanych HSC. Zielony fluorescencyjny sygnał barwienia mitochondriów pozostał niezmieniony w tych dwóch warunkach.Ważne jest, aby przykryć płytkę barwiącą folią aluminiową, aby zminimalizować narażenie światła na poplamione próbki. Metodę tę można łączyć z dalszymi testami, takimi jak przeszczep szpiku kostnego i testy tworzenia kolonii, w celu określenia funkcjonalności komórek macierzystych. Technika ta pozwala więc na prostą metodę przesiewową w celu identyfikacji nowych modulatorów metabolicznych HSC.

measurement-mitochondrial-mass-membrane-potential-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje znakowanie komórek neuronalnych przeciwciałami dla mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, białka związanego z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnego białka błony zewnętrznej, a następnie cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ich poziomów.

Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.

Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Adaptacja metaboliczna jest fundamentalna dla limfocytów T, ponieważ decyduje o różnicowaniu, trwałości i cytotoksyczności. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół monitorowania oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych ex vivo cytokinami.

Monitorowanie oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych cytokinami

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

Poznaj metodę pomiaru masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych oraz limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej. Technika umożliwia analizę metabolizmu mitochondrialnego w małych populacjach komórek.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów