Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Protokół ten jest prostym testem opartym na cytometrii przepływowej, umożliwiającym pomiar potencjału błony mitochondrialnej i masy mitochondrialnej w żywych komórkach. Standardowe testy metaboliczne zawodzą w pracy z rzadkimi populacjami, takimi jak hematopoetyczne komórki macierzyste. Metoda ta umożliwia użytkownikom profilowanie błony mitochondrialnej podczas pracy z małą liczbą komórek oraz określenie nowych modulatorów metabolicznych komórek, takich jak HSC.

Co więcej, można go połączyć z dalszymi testami funkcjonalnymi, takimi jak przeszczep szpiku kostnego lub testy tworzenia kolonii, aby określić funkcjonalność komórek po hodowli. Nasza technika może zostać wykorzystana do identyfikacji nowych cząsteczek zdolnych do poprawy funkcji HSC w kontekście przeszczepu szpiku kostnego i regeneracji układu krwiotwórczego po terapiach ablacyjnych. Jak opisano w naszym protokole, nasza metoda może być stosowana do oceny sprawności metabolicznej immunologicznych limfocytów T.

Bardzo ważne jest, aby komórki miały minimalną ekspozycję na światło po barwieniu. Ponadto należy uwzględnić stosowanie inhibitora pompy werapamilu w celu oceny udziału wypływu pompy. Jednak, użytkownicy muszą być świadomi, że werapamil głęboko zaburza równowagę jonową i nie może być stosowany w celu oceny wpływu modulatora metabolicznego na potencjał błony mitochondrialnej.

Wizualna demonstracja tej metody jest niezwykle ważna, ponieważ istnieje kilka krytycznych kroków, o których należy pamiętać podczas pracy z małą liczbą komórek, a tych kroków bardzo często brakuje w zwykłych artykułach, które użytkownicy czytają w PubMed. W przypadku sortowania FAC identyfikowana jest populacja LKS, zdefiniowana przez linię ujemną, Sca1 dodatnią, cKit dodatnią. Hematopoetyczne komórki macierzyste z około 5 do 10% komórek w populacji LKS są identyfikowane przez bramkowanie dla populacji CD150-dodatniej, CD48-ujemnej, oznaczonej jako HSC.

Po posortowaniu krwiotwórczych komórek macierzystych należy odwirować probówki o ciśnieniu 300 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Delikatnie usuń większość supernatantu bez usuwania osadu i pozostaw od 50 do 80 mikrolitrów na wierzchu osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do ekspandowania komórek macierzystych do końcowej objętości 200 mikrolitrów.

Przygotować sterylną płytkę dołka 96 U z dnem i zidentyfikować studzienki, w których komórki będą hodowane. Przenieś 100 mikrolitrów 2x podłoża podstawowego wcześniej przygotowanego w tych studzienkach. W dobrze oznaczonym NR dodaj dwa mikrolitry 100x roztworu rybozydu nikotynamidu.

Przenieś 100 mikrolitrów 2x podłoża podstawowego do studzienek w celu kontroli barwienia. Wysiewaj 100 mikrolitrów przygotowanych hematopoetycznych komórek macierzystych na wierzchu studzienek zawierających 2x podłoże podstawowe. Wysiewać 100 mikrolitrów całych komórek szpiku kostnego na studzienkach oznaczonych jako kontrole barwienia.

Dodaj 200 mikrolitrów autoklawizowanej wody do wszystkich okolicznych studzienek, aby zmniejszyć parowanie ze studni zawierających komórki. Umieść płytkę w spokoju w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla na 72 godziny. Wyjmuj płytkę, aby uzupełnić rybozyd nikotynamidu co 24 godziny i włóż ją z powrotem do inkubatora.

Pod koniec okresu hodowli dodać dwa mikrolitry 100x roztworu TMRM i dwa mikrolitry 100x roztworu zielonej fluorescencji do każdej z basen testowych. Dodaj dwa mikrolitry 100x TMRM do studzienki kontrolnej barwienia TMRM. Dodaj dwa mikrolitry 100-krotnej zielonej fluorescencyjnej plamy do studzienki kontrolnej barwienia MitoTracker.

Przykryj górną część talerza folią aluminiową i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla na 45 minut. Wyjąć płytkę z inkubatora i odwirować ją w temperaturze 300 razy g przez pięć minut.

Odwrócić płytkę, aby usunąć supernatant i dodać 200 mikrolitrów standardowego buforu FACS w celu ponownego zawieszenia. Przykryj talerz folią. Odwirować płytkę w ilości 300 razy g przez pięć minut.

Powtórz ten krok prania trzy razy. Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu FACS i przenieść do probówek FACS. Aby uruchomić próbki na cytometrze przepływowym, najpierw załaduj do urządzenia pojedyncze kolorowe elementy sterujące i zapisz co najmniej 5 000 zdarzeń w każdym z nich jeden po drugim.

W oprogramowaniu naciśnij Pobierz, a następnie Nagraj na pulpicie nawigacyjnym, aby uzyskać i nagrać pojedyncze elementy sterujące kolorem. Naciśnij przycisk Ustawienia rekompensaty, a następnie kliknij przycisk Oblicz odszkodowanie, aby obliczyć odszkodowanie. Po zastosowaniu kompensacji należy pobrać próbkę krwiotwórczych komórek macierzystych i zarejestrować jak najwięcej zdarzeń.

Wyeksportuj pliki FACS z cytometru i otwórz plik w oprogramowaniu do analizy. W FlowJo użyj bramkowania rozproszenia do przodu i bramkowania rozproszenia bocznego, aby zidentyfikować populację komórek. Zidentyfikuj pojedyncze punkty w następnych bramkach, a następnie wykreśl ujemną frakcję DAPI reprezentującą żywe komórki.

W bramie żywej komórki wykonaj wykres konturowy w TMRM i kanale barwienia fluorescencyjnego, aby zmierzyć odpowiednio potencjał i masę błony mitochondrialnej. Eksportuj średnią intensywność fluorescencji tych dwóch kanałów w bramce komórki na żywo. Następnie wyeksportuj proporcję komórek w niskiej bramce TMRM we wszystkich próbkach.

Leczenie rybozydem nikotynamidu wykazało wyraźny wzrost populacji z niskim poziomem TMRM. Znacząco zwiększył również odsetek komórek w niskiej bramce TMRM i wykazał znaczne obniżenie intensywności fluorescencji TMRM. Masa mitochondrialna nie zmieniła się po suplementacji rybozydem nikotynamidu.

Dodatkowo barwienie markerami komórek macierzystych połączono z barwieniem mitochondriów po hodowli. Dzięki strategii bramkowania w celu identyfikacji hematopoetycznych komórek macierzystych, narażenie na rybozyd nikotynamidu wykazało znaczny wzrost populacji o niskim poziomie TMRM i znaczny spadek intensywności fluorescencji TMRM w bramkowanych HSC. Zielony fluorescencyjny sygnał barwienia mitochondriów pozostał niezmieniony w tych dwóch warunkach.

Ważne jest, aby przykryć płytkę barwiącą folią aluminiową, aby zminimalizować narażenie światła na poplamione próbki. Metodę tę można łączyć z dalszymi testami, takimi jak przeszczep szpiku kostnego i testy tworzenia kolonii, w celu określenia funkcjonalności komórek macierzystych. Technika ta pozwala więc na prostą metodę przesiewową w celu identyfikacji nowych modulatorów metabolicznych HSC.