Przestrzenna analiza czasowa przepływu w terenie w mikrokrążeniu
18 listopada 2019
Aby określić ilościowo przepływ mikronaczyniowy na podstawie sekwencji obrazów przepływu kapilarnego o dużej prędkości, opracowaliśmy oprogramowanie STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Na całym polu obrazu i w czasie STAFF ocenia prędkości przepływu i generuje sekwencję oznaczonych kolorami map przestrzennych do wizualizacji i tabelarycznych danych wyjściowych do analiz ilościowych.
Ponieważ przepływ mikronaczyniowy zmienia się między naczyniami włosowatymi i zmienia się w ciągu kilku sekund, potrzebna jest metoda ciągłego oznaczania ilościowego przepływu przez całe pola. Personel umożliwia niemal ciągły pomiar prędkości przepływu w całych polach mikroskopu w ciągu kilku godzin, który w przeciwnym razie zajęłby miesiące. Chociaż procedury te są proste, demonstracja wizualna znacznie pomoże nowym użytkownikom po raz pierwszy w nawigowaniu po personelu.
Aby użyć TrakEM2 do zdefiniowania sieci naczyniowej, najpierw wybierz Plik, Nowy i TrakEM2 Puste, aby skonfigurować nowy pusty projekt TrakEM2, a następnie wybierz nowy folder zawierający pojedynczy obraz z filmu jako folder projektu. Otworzą się okna TrakEM2. Kliknij prawym przyciskiem myszy w głównym obszarze roboczym i wybierz Importuj i importuj obraz.
Przejdź do pojedynczego zapisanego obrazu i wybierz obraz. Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy w głównym obszarze roboczym i wybierz opcję Wyświetl i automatycznie zmień rozmiar płótna/zestawu warstw. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy w głównym oknie roboczym.
Obraz wypełni obszar roboczy. Aby wybrać obszary na obrazie, które zawierają sieć naczyniową, w mniejszym oknie TrakEM2 kliknij prawym przyciskiem myszy szablon Anything i wybierz Dodaj nowe dziecko i listę obszarów. W mniejszym oknie TrakEM2 przeciągnij szablon Anything na Project Objects, projekt bez tytułu.
Następnie przeciągnij szablon Anything, area list, na Project Objects, untitled projects, Anything. W obszarze Obiekty projektu, projekt bez nazwy będzie teraz obecna lista obszaru Anything. W głównym oknie TrakEM2 w zakładce Z Space zostanie utworzony pasek oznaczony jako Lista obszarów.
Kliknij, aby zaznaczyć listę. W głównym oknie TrakEM2 wybierz narzędzie pędzla i kliknij Shift podczas obracania kółkiem myszy, aby wybrać rozmiar pędzla, który jest mniejszy niż średnica interesującego Cię układu krwionośnego. Naciśnij Control S, aby zapisać projekt.
Za pomocą narzędzia pędzla pomaluj sieć naczyniową, wykluczając wszelkie nieostre obszary. Po zakończeniu etykietowania kliknij prawym przyciskiem myszy w głównym oknie TrakEM2 i wybierz opcję Eksportuj i listy obszarów jako etykiety. W wyskakującym okienku wybierz Skala, 100% i eksportuj całą listę obszarów.
Zamknij okna TrakEM2 i wybierz opcję Tak, aby zapisać projekt. Otworzy się obraz listy obszarów, który może pojawić się jako pusty, obraz. W menu głównym Fidżi wybierz Obraz, Dostosuj i Jasność/Kontrast.
W oknie Jasność i kontrast kliknij przycisk Auto, a lista obszarów stanie się widoczna. W menu głównym Fidżi wybierz Obraz, Tabele przeglądowe i Odwróć tabelę przeglądową. Zapisz ten obraz czarnych etykiet na białym tle jako plik t-i-f i zamknij obraz.
Otwórz plik Labels na Fidżi i wybierz Wtyczki, Szkielet i Oczy szkieletu. Następnie zapisz obraz Skeleton Eyes jako plik t-i-f. Aby utworzyć nowy projekt pracowniczy, wybierz Wtyczki, makra i Otwórz/Utwórz projekt, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć lub zaktualizować plik konfiguracyjny.
Z menu Otwórz/Utwórz projekt przejdź do folderu Plik wejściowy katalogu projektu oraz pliki wejściowe filmu i szkieletu i wybierz go. Wprowadź wartości maksymalnej zmierzonej szybkości, maksymalnej odwzorowanej prędkości, minimalnej długości segmentu, rozmiaru piksela i liczby klatek na sekundę. Zaznacz pole Korekcja migotania, jeśli obrazy mają okresowe intensywne migotanie tła i kliknij przycisk OK. Dostosuj parametry, aby uzyskać najlepszą wizualizację danych.
Ustaw maksymalną szybkość mapowania tak, aby obejmowała około 95 procent danych, tak aby dane były odwzorowywane w pełnym zakresie skali kolorów. Aby przeanalizować szkielet, wybierz Wtyczki, Makra i Analizuj szkielet. Otworzy się plik szkieletu, a menedżer obszaru zainteresowania zostanie otwarty i uruchomiony.
W menedżerze Region zainteresowania kliknij Pokaż wszystko i Oznacz etykietę, a następnie kliknij przycisk OK.To wybierz przedziały czasu, wybierz opcję Wtyczki, makra i Edytuj interwały czasowe, a następnie poczekaj, aż makro wygeneruje kimograf z jednego segmentu w całkowitym czasie trwania filmu. Użyj Control plus i minus, aby w razie potrzeby zwiększyć rozmiar kimografu, a następnie użyj narzędzia Zaznaczanie prostokąta, aby narysować prostokąt wokół każdego interwału czasu. Naciśnij T lub kliknij przycisk Dodaj, aby nagrać wybór przedziału czasu i powtórzyć wybór dla dowolnej liczby interwałów czasowych.
Aby ocenić wybrane parametry, wybierz od trzech do czterech interwałów czasu i zakończ analizę tylko dla tych interwałów. Kliknij przycisk OK po zakończeniu wybierania przedziału czasu. Wyskakujące okienko pojawi się, gdy wybrane interwały zostaną zapisane w folderze projektu.
Kliknij OK.To przeanalizować przepływ, wybierz Wtyczki, makra i Analizuj przepływ. Otworzy się okno dialogowe Analizuj parametry przepływu, w którym zostaną wyświetlone wartości wprowadzone w kroku Otwórz/Utwórz projekt. W razie potrzeby edytuj te wartości i kliknij przycisk OK. Otworzy się okno dialogowe Nazwy plików wyjściowych z nazwami wprowadzonymi w kroku Otwórz/Utwórz projekt.
W razie potrzeby zmodyfikuj te nazwy i kliknij przycisk OK, aby rozpocząć analizę przepływu. Gdy pojawi się okno dialogowe informujące, że przepływ został przeanalizowany, kliknij przycisk OK, aby zapisać wyniki analizy w plikach arkusza kalkulacyjnego CSV. Aby utworzyć mapy przestrzenne, wybierz opcje Wtyczki, Makra i Utwórz mapę przestrzenną.
Otworzy się okno Parametry mapy przestrzennej, w którym zostaną wyświetlone wartości wprowadzone w kroku Otwórz/Utwórz projekt. W razie potrzeby zmodyfikuj te wartości i kliknij przycisk OK. Zostanie wygenerowana sekwencja czasowa map przestrzennych prędkości przepływu, przy czym każdy kolor wskazuje prędkość przepływu. Przewiń wygenerowany stos jednego obrazu na interwał, aby zobrazować przestrzenne i czasowe różnice w przepływie, a następnie zapisz stos jako plik a-v-i, aby udostępnić plik jako film.
Analiza personelu generuje pełny spis prędkości mikronaczyniowych w całych polach mikroskopu, w okresach czasu trwających od sekund do minut. Na przykład, wykorzystując pojedynczy obraz w tym szeregu czasowym sieci mikronaczyniowej w wątrobie myszy, wygenerowany szkieletowy obraz został wykorzystany do zdefiniowania osi przepływu mikronaczyniowego, co pozwoliło na zidentyfikowanie wygenerowanej przez Staff mapy poszczególnych segmentów naczyń w celu późniejszej kwantyfikacji przepływu. Z poszczególnych segmentów naczyń krwionośnych wygenerowanych na podstawie szkieletowego obrazu można wygenerować kimografy przedstawiające intensywność wzdłuż każdego odcinka linii w czasie.
Przedziały czasowe Szkieletu i Zaopatrzenia użytkownika mogą być używane do podziału kimografu każdego segmentu na poszczególne przedziały czasowe segmentu. Następnie personel identyfikuje dominujący kąt na kimografie z każdego przedziału czasowego segmentu i dostarcza obliczone pomiary prędkości w postaci plików danych CSV. Dane wyjściowe CSV personelu można wykorzystać do analizy ogólnego rozkładu prędkości, aby umożliwić wykreślenie prędkości w poszczególnych segmentach naczyń w czasie.
I mogą być wizualizowane jako stosy oznaczonych kolorami obrazów mapy prędkości. Należy pamiętać, że wyniki uzyskane przez personel zależą od jakości serii obrazów w odniesieniu do stabilności próbki, liczby klatek na sekundę, rozdzielczości i stosunku sygnału do szumu. Dane wyjściowe mapy prędkości personelu umożliwiają intuicyjną eksplorację przestrzennych wzorców przepływu, podczas gdy wyniki CSV personelu umożliwiają analizę statystyczną prędkości przepływu, zarówno w obrębie grup terapeutycznych, jak i między nimi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Oprogramowanie STAFF umożliwia ciągłą kwantyfikację przepływu mikronaczyniowego w całym polu widzenia mikroskopu, co znacznie skraca czas potrzebny na wykonanie pomiarów. Metoda ta pozwala na ocenę prędkości przepływu oraz generowanie kolorystycznych map przestrzennych w celu wizualizacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- analiza przepływu mikronaczyniowego
- techniki obrazowania
Wstęp
- Przepływ mikronaczyniowy różni się znacząco pomiędzy poszczególnymi kapilarami.
- Tradycyjne metody pomiarowe są czasochłonne.
- Ciągły pomiar jest niezbędny do przeprowadzenia dokładnej analizy.
- Oprogramowanie STAFF stanowi rozwiązanie umożliwiające ilościowe określanie przepływu w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Opracowanie metody ciągłej kwantyfikacji przepływu mikronaczyniowego.
- Poprawa wydajności pomiaru przepływu w polach widzenia mikroskopu.
- Zapewnienie narzędzi wizualnych dla nowych użytkowników oprogramowania STAFF.
Zastosowane metody
- Opracowanie oprogramowania STAFF do analizy przepływu.
- Wykorzystanie programu TrakEM2 do zdefiniowania sieci naczyniowej.
- Importowanie obrazów do analizy w oprogramowaniu.
- Generowanie kolorowych map przestrzennych w celu wizualizacji.
Główne wyniki
- STAFF umożliwia niemal ciągły pomiar prędkości przepływu.
- Znaczne skrócenie czasu wymaganego do analizy przepływu.
- Mapy z kodowaniem kolorystycznym usprawniają wizualizację dynamiki przepływu.
- Procedury są proste i przyjazne dla użytkownika.
Wnioski
- Oprogramowanie STAFF jest wartościowym narzędziem do analizy przepływu mikronaczyniowego.
- Pozwala ono badaczom na uzyskanie danych, których ręczne opracowanie zajęłoby miesiące.
- Demonstracje wizualne mogą pomóc użytkownikowi w nawigacji i zrozumieniu działania programu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe mapowanie dynamiki przepływu w mikrokrążeniu jest kluczowe dla zrozumienia perfuzji tkankowej oraz identyfikacji wczesnych defektów mikrokrażeniowych istotnych w modelach chorób. Workflow STAFF umożliwia obiektywną, wysokoprzepustową analizę przestrzenną i czasową przepływu w naczyniach włosowatych, co zwiększa wiarygodność predykcyjną w przedklinicznej biologii naczyniowej i badaniach translacyjnych. Możliwość ta wzmacnia mechanistyczną redukcję ryzyka i dostarcza danych niezbędnych do walidacji celów terapeutycznych w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia kompleksową analizę funkcji mikrokrążenia w całych obszarach tkankowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację heterogeniczności przepływu i regionalnych różnic w perfuzji.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów terapeutycznych poprzez powiązanie dynamiki naczyniowej z fenotypami istotnymi dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, ilościowe mapy przepływu dla późniejszych etapów procesów przesiewania związków.
- Standaryzuje pomiar prędkości w naczyniach włosowatych, poprawiając odtwarzalność i porównywalność testów.
- Generuje skalowalne, kolorystyczne wyniki odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewania obrazowego (high-content screening) i ponownego wykorzystania platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wskaźniki przepływu mikronaczyniowego z modelami chorób w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez dostarczenie wiarygodnych, ilościowych punktów końcowych.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane dotyczące przestrzennej i czasowej zmienności przepływu.
Integracja potoku i przepływu pracy
STAFF integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, zapewniając ilościową analizę przepływu w obrębie pola, która łączy wczesne badania mechanistyczne z walidacją modeli translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia bezstronną, opartą na hipotezach kwantyfikację dynamiki mikronaczyniowej w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe mapy prędkości oraz pliki wyjściowe CSV do analizy porównawczej.
- Analityka: Umożliwia statystyczną ocenę rozkładów przepływu wewnątrz i pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy przepływu mikronaczyniowego z punktami końcowymi istotnymi dla choroby, gdy są one wspierane przez systemy modelowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Zapewnia wielokrotnego użytku, otwartoźródłowy przepływ pracy, który można dostosować do różnych tkanek i planów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad biologią naczyniową.
- Wartość operacyjna: Usprawnia pozyskiwanie danych, standaryzację oraz skalowalność w badaniach na dużą skalę.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki wprowadzeniu solidnych, ilościowych punktów końcowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów ukierunkowanych na układ naczyniowy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu intravitalnym i cyfrowej analizie obrazu.
- Zależy od wysokiej jakości i stabilności akwizycji obrazu przy odpowiedniej częstotliwości klatek i rozdzielczości.
- Wymaga standaryzacji doboru parametrów w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Możliwość adaptacji do różnych tkanek i modeli naczyniowych po przeprowadzeniu odpowiedniej optymalizacji.
- Jakość wyników jest uzależniona od stabilności próbki i stosunku sygnału do szumu.
