Name: Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Naucz się nukleofekcji pasożytów Eimeria kurczaka w celu manipulacji genetycznej i rozwoju szczepionek. Ta metoda umożliwia modyfikację genetyczną in vivo oraz tworzenie wektorów szczepionkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2017YFD0501200) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31572507, 31772728 i 31873007).

Kurczaki do wszystkich eksperymentów na zwierzętach były trzymane i utrzymywane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Rolniczego oraz przestrzegały Międzynarodowych Wytycznych dla Badań Biomedycznych z udziałem zwierząt. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Pekiński Komitet Administracyjny ds. Zwierząt Laboratoryjnych.
1. Ekstrakcja i oczyszczanie sporozoitów Eimeria spp. (np. E. tenella)
<ol>
	<li>Uwalnianie sporocyst
	<ol>
		<li>Odwirować 1 x 107zarodnikowanych oocyst w roztworze dichromianu potasu (2,5%, m/v) w stężeniu 2 300 x g przez 5 min. Przemyć je trzykrotnie PBS (roztworem buforu fosforanowego).</li>
		<li>Zawiesić granulki w 1 ml PBS i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj równą objętość szklanych kulek (zakres średnic 1 mm x 1 mm) i oscyluj zawiesinę oocyst za pomocą mieszalnika wirowego, aby uwolnić sporocysty.</li>
		<li>Monitoruj uwalnianie sporocyst za pomocą mikroskopii co minutę. Przestań wirować, gdy więcej niż 90% oocyst zostanie uszkodzonych. 
		UWAGA: Większość oocyst (takich jak E. tenella, E. necatrix i E. acervulina) została złamana po 1 minucie przy użyciu mieszalnika wirowego.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę sporocyst do nowych probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1 600 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad za pomocą 1 ml roztworu o 50% gradiencie gęstości, połączyć w probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 1 min. 
		UWAGA: Skład gradientu gęstości znajduje się w Tabeli 1. Gradient gęstości to ośrodek koloidalny na bazie krzemionki, składający się z koloidalnych cząstek krzemionki o średnicy 15-30 nm (23% w/w w wodzie), które zostały pokryte poliwinylopirolidonem (PVP).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwalnianie sporozoitów
	<ol>
		<li>Zawiesić osad za pomocą buforu ekscystacyjnego (tabela 1) i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 40-60 minut w celu uwolnienia sporozoitów. Przerwij inkubację, gdy uwolni się ponad 90% sporozoitów. Następnie odwirować przy 600 x g przez 10 min. 
		UWAGA: Potrząsaj probówkami raz na 5 minut podczas ekscytacji.</li>
		<li>Zawiesić wytrącanie za pomocą 1 ml roztworu o gradiencie gęstości 55% i odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę.</li>
		<li>Ponownie zawiesić wytrącanie za pomocą 1 ml PBS i policzyć sporozoity za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zbieranie i oczyszczanie merozoitów E. necatrix
UWAGA: W eksperymencie użyj brojlerów Arbor Acre (AA) w wieku 7-14 dni. Kurczęta wolne od kokcydii (n = 3) inokulowano 2 x 105 oocyst E. necatrix. Po 109 godzinach od zakażenia ptaki zostały uśmiercone przez zwichnięcie szyjki macicy. Jelito zostało usunięte w celu pobrania merozoitów 2. generacji. Dla różnych gatunków Eimeria istniał różny czas zbierania merozoitów 2. generacji: E. necatrix po 109 godzinach i E. tenella po 112 godzinach od inokulacji. Do transfekcji E. necatrix merozoity są optymalnym wyborem, ponieważ drugie merozoity są łatwe do oczyszczenia.
<ol>
	<li>Kolekcja merozoitów drugiej generacji E. necatrix
	<ol>
		<li>Przetnij jelito kurczaka wzdłuż, od łodygi żółtka (środek jelita cienkiego) do ujścia krętniczo-kątniczej i delikatnie umyj je PBS lub HBSS (Zbilansowany Roztwór Soli Hanka) trzy razy na szalce Petriego.</li>
		<li>Pokrój jelito na kawałki o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm i umieść je w kolbie stożkowej z buforem do wytrawiania (tabela 1). Umieścić kolbę na mieszalniku magnetycznym w temperaturze 37 °C z mieszadłem na 30-60 minut, aby uwolnić merozoity. Po 30 minutach inkubacji monitorować uwalnianie merozoitów za pomocą badania mikroskopowego co 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść merozoity przez filtrację i odwirowanie.
	<ol>
		<li>Przefiltrować zawiesinę zawierającą strawione merozoity za pomocą czterech warstw gazy14 i odwirować przy 600 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Po odwirowaniu wyrzucić sklarowany osad zawierający resztki jelita. Przenieść osad z oczyszczonymi merozoitami do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Ponownie zawiesić wytrącanie za pomocą 1 ml PBS i policzyć merozoity za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nucleofekcja merozoitów lub sporozoitów
<ol>
	<li>Przygotowanie przed nukleofekcją pasożytów
	<ol>
		<li>Przygotuj około 10-7 merozoitów lub sporozoitów w jednej probówce. W przypadku transfekcji merozoitów przygotuj 3-4 probówki.</li>
		<li>Przygotować ilość plazmidowego DNA lub oczyszczonego fragmentu PCR większą lub równą 10 μg. 
		UWAGA: Plazmid użyty w tym badaniu zawiera 2 geny: wzmocnione białko żółtej fluorescencji (EYFP) i syntazę tymidylanu reduktazy dihydrofolianowej pochodzącą z Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15.</li>
		<li>Przygotować 25 j. enzymu restrykcyjnego. Jeśli plazmidy są zlinearyzowane, enzym restrykcyjny może poprawić wydajność transfekcji. Jeśli plazmidy są okrągłe, pomiń enzym restrykcyjny.</li>
		<li>Przygotować 85 μl buforu do nukleofekcji: zmieszać 20 μl buforu nukleofekcyjnego I i 1 ml buforu nukleofekcyjnego II i użyć części roztworu. Objętość całkowitego buforu wynosi 100 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jądrofelekcja
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę sporozoitu lub merozoitu o stężeniu 600 x g przez 10 min. Następnie odrzucić supernatant.</li>
		<li>W następującej kolejności dodaj 85 μl buforu do transfekcji jądrowej, 10 μg plazmidu (fragment PCR) i 25 U enzymu restrykcyjnego (zwykle 5 μl) do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej sporozoity lub merozoity.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę do kubka do transfekcji jądrowej. Umieść kubek w rowku do przenoszenia jądra.</li>
		<li>Włącz urządzenie nukleofekcyjne za pomocą przycisku zasilania i wybierz procedurę transfekcji U-033. Jeśli urządzenie nukleofekcyjne uruchamia się w trybie swobodnego wyboru programu, wyjdź z tego trybu, naciskając przycisk X.</li>
		<li>Po zakończeniu programu naciśnij przycisk X urządzenia do nukleofekcji, a na ekranie powinien pojawić się OK, wskazując, że nukleofekcja się powiodła.</li>
		<li>Dodaj 0,5-1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 do kubka nukleofekcyjnego, aby zatrzymać reakcję i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml po delikatnym wymieszaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Inokulacja kloaką lub wstrzyknięcie dożylne
<ol>
	<li>Zaszczepić pasożyty z nukleofekcją 7-dniowym kurczakom. Zaszczepić merozoity E. necatrix lub sporozoity E. tenella drogą kloaki, ale zaszczepić sporozoity E. acervulina przez wstrzyknięcie dożylne. Zaszczepij około 2 x 107 milionów sporozoitów do każdego kurczaka i włącz merozoity 107 dla każdego ptaka.</li>
</ol>
5. Propagacja i sortowanie FACS
<ol>
	<li>Zebrać oocysty z kału 5-9 dni po inokulacji transfekowanymi sporozoitami. Zbierz oocysty trzeciego dnia po zaszczepieniu transfekowanymi merozoitami.</li>
	<li>Użyj sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) i 150 mg/kg pirymetaminy8, aby sukcesywnie zwiększać współczynnik populacji transgenicznej. 
	UWAGA: Użyj pirymetaminy, dodając ją bezpośrednio do paszy. Dla wygodniejszego użycia przygotuj rozpuszczalną w wodzie pirymetaminę. Rozpuścić 1 g pirymetaminy w 0,2 ml H2SO4 i 9,8 ml N-metylopirolidonu (NMP), a następnie dodać 1,5 ml tego roztworu podstawowego do 1 l wody pitnej dla ptaków.</li>
</ol>
6. Opcjonalne oczyszczanie kolumn
UWAGA: Jeśli potrzebne są więcej czystych sporozoitów lub merozoitów, istnieje opcjonalna metoda, która oczyszcza je za pomocą kolumny z celulozą dietyloaminoetylo-52 (DE-52 celuloza).
<ol>
	<li>Kolumnę celulozową DE-52 należy przygotować co najmniej jeden dzień wcześniej.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor eluentu glicyny (Tabela 1). Dostosować pH buforu eluentu glicyny z 7,6 do 8,0 i ogrzać do 41 °C.</li>
		<li>Dodać 2,5 g celulozy DE-52 do kolumny. Dodaj wodę i moczyć przez noc. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj wodę i moczyć przez 1 godzinę. Wyrzuć supernatant.</li>
		<li>Dodać 0,1 M NaOH i moczyć przez co najmniej 2 godziny. Powtórz ten krok.</li>
		<li>Zastąp supernatant wodą. Gdy celuloza całkowicie opadnie na dno (około pół godziny), powtórz ten krok.</li>
		<li>Odrzucić supernatant, dodać 0,1 M HCl i moczyć przez co najmniej 2 godziny. Powtórz ten krok.</li>
		<li>Odrzucić sklarowany osad i dwukrotnie namoczyć celulozę buforem eluentu glicyny.</li>
		<li>Zmierz i dostosuj pH od 7,6 do 8,0, dodając 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH. 
		UWAGA: W tej części ciecz ma co najmniej 5 razy większą objętość niż celuloza DE-52.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyreguluj natężenie przepływu w zakresie 40-50 obr/min.</li>
	<li>Po zakończeniu sedymentacji celulozy dodać zawiesinę sporozoitu lub merozoitu do kolumny chromatograficznej. Dostosuj natężenie przepływu do 30-40 obr/min. 
	UWAGA: Ponownie zawiesić wytrącanie sporozoitu lub merozoitu z buforem eluentu glicyny przed dodaniem kolumny chromatograficznej.</li>
	<li>Zebrać z buforem eluentu glicyny do probówek o pojemności 50 ml. Przerwać zbieranie zgodnie z wynikami badania mikroskopowego sporozoitów lub merozoitów podczas procesu elucji.</li>
	<li>Odwirować bufor eluentu glicyny zebrany przy 600 x g przez 10 minut. Przenieść wytrącenie sporozoitu lub merozoitu do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Policz sporozoity lub merozoity za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>

<ol><li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox%2C+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li>
<li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li>
<li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii%3A+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li>
<li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li>
<li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li>
<li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li>
<li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li>
<li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Eimeria+tenella%3A+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li>
<li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188(2014).</li>
<li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li>
<li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533(2015).</li>
<li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors%3A+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li>
<li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEckert%2C+J+%22Biotechnology%3A+Guidelines+on+techniques+in+coccidiosis+research%22">Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research</a>. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).</li>
<li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+%28Coccidia%2C+Apicomplexa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li>
<li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Eimeria+magna+Perard%2C+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2(2017).</li>
<li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle%2C+Reproduction+and+Immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807(2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li>
<li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Polytechnica+Hungarica%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li>
</ol>

W latach dziewięćdziesiątych XX wieku opracowano system transfekcji dla pasożytów apikompleksanowych, który był używany do badań nad pasożytami eimerian. Ostatnio stabilną transfekcję przeprowadzono u E. tenella 8,9 i E. nieschulzi15. Osiągnęliśmy stabilną transfekcję E. necatrix poprzez transfekcję merozoitów drugiej generacji11. Inokulacja transfekowanych sporozoitów E. acervulina pr...

Eimeria spp. powoduje kokcydiozę, co prowadzi do znacznych strat ekonomicznych w przemyśle hodowlanym i drobiarskim. Chociaż leki przeciwkokcydiowe, a do pewnego stopnia atenuowane szczepionki przeciwkokcydiowe, są szeroko stosowane do zwalczania kokcydiozy, nadal istnieją niedociągnięcia dotyczące ich oporności na leki, pozostałości leków i potencjalnej dyfuzji szczepów szczepionkowych, które odzyskują zjadliwość1. Wraz z rozwojem biologii molekularnej transfekcja stała się istotnym narzędziem do badania funkcji genów, opracowywania nowych szczepionek i badań przesiewowych nowych celów leków dla Eimeria.
W ostatnich dziesięcioleciach transfekcja była z powodzeniem stosowana w przypadku pasożytów apikompleksów, takich jak Plasmodium i Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Badanie, w którym użyto β-gal jako reportera transfekcji u E. tenella, pilotażowo przeprowadziło takie prace w Eimeria7. Transfekcja E. tenella8,9, E. mitis10 i E. acervulina (Zhang et al., dane niepublikowane) zakończyła się sukcesem u kurcząt. Ostatnio udało nam się przeprowadzić transfekcję przy użyciu merozoitów E. necatrix poprzez nucleofection11.
Badania wykazały, że Eimeria wykazująca ekspresję heterologicznego antygenu ma potencjał do opracowania jako szczepionka rekombinowana, taka jak te wyrażające antygen A Campylobacter jejuni (CjaA) lub interleukina kurczaka 2 (chIL-2)12,13. W związku z tym w niniejszym protokole opisano badanie nukleofekcji Eimeria spp. u kurcząt. Procedura opisuje oczyszczanie sporozoitów lub merozoitów, nukleofekcję plazmidowym DNA, inokulację kloaką/wstrzyknięcie dożylne oraz rozmnażanie in vivo, aby pomóc naukowcom w rozpoczęciu badań nad transgenicznymi pasożytami Eimeria.

<table><tbody><tr><td>ATP-disód</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Celuloza DE-52</td><td>Solarbio</td><td>C8350</td><td></td></tr><tr><td>Pompa o stałym przepływie</td><td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td><td>HL-2B</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MACGENE</td><td></td><td></td></tr> CM15019 <tr><td>Koraliki szklane</td><td>Sigma</td><td>Z250473-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>nr V900116</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Biotoped</td><td>G6200</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>MACGENE</td><td>CC016</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>nr V900041</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka wolnoobrotowa</td><td>PEKIŃSKA WIRÓWKA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td><td>DT5-2</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik magnetyczny</td><td>SCILOGEX</td><td>MS-H280-Pro</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td>Sortownik komórek Sigma</td> 449164 <td></td></tr><tr><td>MoFlo</td><td>BeckMan Coulter, US</td><td>201309995</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do nukleofekcji</td><td>LONZA/amaxa</td><td>90900012 (Nucleofector II)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (roztwór podstawowy DG gradientu)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat taurodeoksycholanu sodu</td><td>Sigma</td><td>T0875</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Mikrowirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Skład DMEM: 4,5 g/L glukozy z pirogronianem sodu, L-glutaminą i 25 mM HEPES.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Solarbio</td><td>T8150</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Pekin Północny TZ-Biotech Develop.co.</td><td>HQ-60-II</td><td></td></tr><tr><td>Termostat do kąpieli wodnej</td><td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td><td>GD120,GM0815010</td><td></td></tr></tbody></table>

nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów eimeria kurczaka

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfekcja to proces techniczny, w którym materiał genetyczny, taki jak DNA i dwuniciowe RNA, jest dostarczany do komórek w celu modyfikacji interesującego genu. Obecnie technologia transgeniczna staje się nieodzownym narzędziem do badania Eimerii, czynników wywołujących kokcydiozę u drobiu i zwierząt gospodarskich. Protokół ten zawiera szczegółowy opis stabilnej transfekcji u pasożytów eimerian: oczyszczanie i nukleofekcję sporozoitów lub merozoitów drugiej generacji oraz rozmnażanie in vivo transfekowanych pasożytów. Korzystając z tego protokołu, osiągnęliśmy transfekcję w kilku gatunkach Eimeria. Podsumowując, nukleofekcja jest użytecznym narzędziem ułatwiającym manipulację genetyczną u pasożytów eimerian.

Niniejszy protokół był stosowany do transfekcji pasożytów eimerioidalnych. W niniejszym badaniu, 2nd generowanie merontów i merozoitów *E. necatrix* przedstawiono w Rycina 2A i Rycina 2Bpodczas gdy Rysunek 2C i Rysunek 2D wykazały obecność sporocyst i sporozoitów *E. tenella*...

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Ustanowienie protokołów transfekcji dla gatunków Eimeria przyczyniłoby się do postępu w badaniach nad funkcjami genów, opracowywaniu nowych szczepionek i badaniach przesiewowych nowych celów terapeutycznych dla Eimeria. Korzystając z tej techniki, udało nam się osiągnąć transfekcję kilku gatunków Eimeria, a nukleofekcja jest użytecznym narzędziem ułatwiającym zastosowanie manipulacji genetycznej u pasożytów eimerian. Jądro Eimeria stanowi odniesienie dla transfekcji innych pasożytów, które nie mogą być hodowane in vitro i przyspieszy badania nad ich manipulacjami genetycznymi.Jeśli próbujesz tej techniki po raz pierwszy, powinieneś dobrze przygotować wszystkie odczynniki i ich instrumenty przed rozpoczęciem transfekcji, aby uniknąć mieszania podczas eksperymentu. Realizacja tej metody pomaga ludziom, którzy koncentrują się na transfekcji Eimerii, dostrzec skomplikowane szczegóły tego eksperymentu. Aby rozpocząć od uwolnienia sporocyst, odwiruj jeden razy 10 do siedmiu zarodnikowanych oocyst w roztworze dichromianu potasu po 2, 300 razy g przez pięć minut.Umyj je trzykrotnie PBS. Ponownie zawiesić granulat z jednym mililitrem PBS i przenieść mieszaninę do 15-mililitrowej probówki. D

nucleofection-and-in-vivo-propagation-of-chicken-eimeria-parasites

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Opisano metodę transferu genów do embrionów kurcz uklutych na późniejszych etapach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych embrionów kurczych i stanowi przydatną technikę badania funkcji i regulacji genów na późniejszych etapach rozwoju.

Transfer genów do starszych zarodków kur w metodzie elektroporacji ex ovo

Źródło: Yates, J. G. E., et al. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje oczyszczanie i zagęszczanie cząstek wirusa z klarownego płynu alantoidowego pobranego z zarodkowych jaj kurzych zainfekowanych wirusem. Przedstawiono serię etapów filtracji i separacji, w tym filtrację wgłębną, filtrację przepływową wzdłużną oraz ultrawirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania nienaruszonych wirusów. Frakcja bogata w...

Oczyszczanie wirusa z płynu alantoicznego zarodkowych jaj kurzych

W tym filmie opisujemy nukleofekcję, procedurę transfekcji opartą na elektroporacji, polegającą na dostarczeniu fluorescencyjnego plazmidowego DNA kodującego białko reporterowe do sporozoitowej formy pasożyta Eimeria kurczaka.

Nukleofekcja form pasożytniczych: metoda transfekcji oparta na elektroporacji polegająca na dostarczaniu plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do jądra sporozoitu

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Płodne jaja kurze są powszechnie używane do produkcji dużych ilości ludzkiego wirusa grypy A, ponieważ zapewniają wygodny i opłacalny system do udowodnienia wysokich plonów wirusa.

Namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj

Diagnoza zakażenia Eimeria u kurcząt pozostaje wymagająca. Podejścia oparte na morfologii pasożytów i patologii żywiciela są zwykle niejednoznaczne, podczas gdy podejścia molekularne oparte na PCR okazały się wymagające pod względem kosztów i wiedzy specjalistycznej. Celem tego protokołu jest ustanowienie amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) jako prostej diagnostyki molekularnej infekcji eimeriana.

Testy amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do specyficznego dla gatunku wykrywania emerii, które infekują kurczaki

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Metoda ta przedstawia zarodek kurczaka jako prosty i opłacalny model in vivo do przywrócenia patogenu bakteryjnego L. monocytogenes ze stanu żywotnego, ale nienadającego się do hodowli (VBNC) i z potencjalnymi dalszymi zastosowaniami w zrozumieniu mechanizmów spoczynku bakteryjnego.

Zarodek kurczaka jako model in vivo do ożywiania żywotnych, ale nienadających się do hodowli patogenów

Rozprzestrzenianie się człowieka zarodkowych komórek macierzystych (ES) Cells

Naucz się nukleofekcji pasożytów Eimeria kurczaka w celu manipulacji genetycznej i rozwoju szczepionek. Ta metoda umożliwia modyfikację genetyczną in vivo oraz tworzenie wektorów szczepionkowych.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Przeglądaj więcej filmów