Name: Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwiania enocytów i barwienia kropelek lipidów u larw Drosophila za pomocą barwnika BODIPY 493/503. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu lipidów w warunkach normalnych i stresowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31671422, 31529004 i 31601112), Projektu 111 (D18010), Projektu Lokalnych Zespołów Innowacyjnych i Badawczych Programu Talentów Rzeki Guangdong Perl (2017BT01S155) oraz Chińskiej Fundacji Nauki Podoktorskiej (2018M640767).

1. Składanie jaj
<ol>
	<li>Przygotuj standardowy pokarm z mąki kukurydzianej do składania jaj. 
	nuta: Aby zapoznać się z przepisem i procedurą gotowania dla standardowej żywności z mąki kukurydzianej używanej tutaj, zobacz wcześniej opublikowane szczegóły15.</li>
	<li>Przygotuj świeżą pastę drożdżową, dodając 6 ml wody destylowanej do 4 g aktywnych suszonych drożdży w probówce odśrodkowej o pojemności 50 ml. Użyj szpatułki, aby wymieszać i zrobić pastę.</li>
	<li>Przygotuj butelki do składania jaj, napełniając je jedzeniem z mąki kukurydzianej i rozprowadź około 1 g pasty drożdżowej na powierzchni żywności z mąki kukurydzianej za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Umieść muchy o pożądanych genotypach w butelce do składania jaj i umieść ją w inkubatorze o stałej temperaturze 25 °C i wilgotności 60%. 
	nuta: Idealne krzyżówki składają się zwykle ze 150 dziewiczych much i co najmniej 75 samców. Trzymanie much w ciemności poprzez umieszczenie światłoszczelnego pudełka na butelkach do składania jaj zwiększy szybkość rozmnażania.</li>
	<li>Przed pobraniem jaj pozwól muchom złożyć jaja przez 1 godzinę, aby umożliwić usunięcie wszystkich starych jaj, które pozostają przechowywane w jajowodach samic.</li>
	<li>Pozwól muchom złożyć jaja w nowej butelce do składania jaj przez 1 godzinę i wyjmij dorosłe osobniki z butelki. 
	nuta: Kontroluj czas składania jaj, aby zminimalizować zakres rozwoju w celu uzyskania larw w precyzyjnie kontrolowanym stadium rozwojowym.</li>
	<li>Pozostawić jaja do rozwinięcia się przez 84 godziny w larwy trzeciego stadium rozwojowego w inkubatorze w temperaturze 25 °C w cyklu 12 godzin/12 godzin światła i ciemności.</li>
</ol>
2. Leczenie głodu u larw
UWAGA: Jak wspomniano powyżej, u larw trzeciego stadium rozwojowego, w normalnych warunkach żywieniowych w enocytach jest niewiele lub nie ma ich wcale, ale w warunkach stresu, takich jak głód, w oenocytach mogą powstać liczne duże kropelki lipidów. Aby dokładniej zweryfikować tę metodę, konieczne jest wstępne poddanie tych larw obróbce w celu wywołania biogenezy kropelek lipidów w enocytach. Tutaj jako paradygmat wybrano przebieg głodu wynoszący 12 godzin, 24 godziny i 36 godzin. W szczególności krótki okres głodu (np. 3 godziny) jest wystarczający do wywołania wykrywalnych kropelek lipidów w enocytach. Czas głodu może się różnić w zależności od konkretnych celów i ustawień eksperymentalnych.
<ol>
	<li>Zrób komory do głodzenia i zabiegów kontrolnych.
	<ol>
		<li>W przypadku komór do leczenia głodowego: umieścić bibułę filtracyjną o odpowiednim rozmiarze na szalce Petriego o średnicy 6 cm i odpipetować 1 ml PBS na bibułę filtracyjną.</li>
		<li>W przypadku komór kontrolnych do zabiegów: umieść 5 ml standardowego pokarmu z mąki kukurydzianej Bloomington na szalce Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą szpatułki delikatnie wykop górną warstwę pokarmu zawierającego larwy, które nadal zagrzebują się w pożywieniu i przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną 5 ml PBS. Delikatnie wymieszaj larwy w PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pokarmowe z larw i uczynić je tak czystymi, jak to tylko możliwe.</li>
	<li>Użyj małego pędzla, aby zebrać 40 larw trzeciego stadium rozwojowego o tej samej przybliżonej wielkości. Posortuj je losowo do komory głodowej lub kontrolnej, z 20 larwami każda.</li>
	<li>Umieścić komory w inkubatorze w temperaturze 25 °C przy wilgotności 60% i pozostawić na rozwój przez 12 godzin, 24 godziny i 36 godzin leczenia. 
	nuta: W przypadku larw w komorze głodowej dodawaj 1 ml PBS co 12 godzin, aby uniknąć odwodnienia larw.</li>
</ol>
3. Sekcja enocytów
<ol>
	<li>Użyj małego pędzla, aby wybrać larwy w odpowiednim wieku (12 godzin, 24 godziny lub 36 godzin po zabiegu), a następnie przenieś je na nową szalkę Petriego wypełnioną 5 ml lodowatego PBS do umycia. 
	nuta: Powtórz krok 2.2 w przypadku larw w komorze kontrolnej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia żywności.</li>
	<li>Napełnij płytkę preparacyjną lodowatym PBS i za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy na płytkę preparacyjną. Umieść płytkę separacyjną pod mikroskopem stereoskopowym w celu wykonania następującego etapu sekcji. 
	nuta: Lodowata temperatura pomoże spowolnić ruchy larw i ułatwi preparację.</li>
	<li>Obróć larwy brzuszną stroną do góry i grzbietową do dołu i delikatnie przytrzymaj w miejscu za pomocą kleszczy. Przymocuj larwy do płytki preparcyjnej, umieszczając szpilkę do wypreparowania przez gardło na przednim końcu, a drugą szpilkę przez przetchlinkę na tylnym końcu. 
	nuta: Stronę grzbietową najłatwiej zidentyfikować po obecności pni grzbietowych tchawicy.</li>
	<li>Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby naciąć (wzdłużnie) naskórek od przodu do tylnego końca.</li>
	<li>Usuń wewnętrzną tkankę naskórka za pomocą kleszczy. 
	nuta: Należy zachować ostrożność podczas usuwania gałęzi tchawicy, aby uniknąć uszkodzenia enocytów, które są zlokalizowane na wewnętrznej powierzchni naskórka.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy wyjmij szpilki preparacyjne i przenieś naskórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej PBS na lodzie.</li>
	<li>Kontynuuj sekcję innych larw zgodnie z procedurą opisaną powyżej.</li>
</ol>
4. Barwienie kropelkami lipidów
<ol>
	<li>Inkubuj wypreparowany naskórek w buforze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze. 
	nuta: Bufor utrwalający zawiera 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.</li>
	<li>Usuń bufor utrwalający, a następnie szybko umyj. Aby przeprowadzić szybkie płukanie, dodaj 1 ml PBS w temperaturze pokojowej do probówki po usunięciu PFA, delikatnie zawieś ponownie chusteczki i wyrzuć PBS. 
	ostrożność: Bufor utrwalający zawiera PFA, który jest szkodliwy dla zdrowia ludzkiego. Ważne jest, aby prawidłowo zutylizować bufor utrwalający jako odpad niebezpieczny.</li>
	<li>Przemyć próbki 3 razy przez 5 minut każda za pomocą PBS, aby wypłukać wszystkie możliwe pozostałości PFA.</li>
	<li>Inkubować naskórek za pomocą BODIPY 493/503 (1 μg/ml; patrz tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. 
	nuta: Począwszy od tego etapu, owiń probówkę mikrowirówki kawałkiem folii aluminiowej, aby chronić próbki przed światłem i zminimalizować możliwe fotowybielanie.</li>
	<li>Usunąć roztwór barwiący BODIPY 493/503 i przemyć próbki 3x przez 10 minut każda za pomocą PBS, aby całkowicie usunąć resztki barwników.</li>
</ol>
5. Montaż i obrazowanie
<ol>
	<li>Umieścić 6 μl podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym. 
	nuta: Medium montażowe służy do wydłużenia czasu wykrywania ze względu na jego właściwości zapobiegające blaknięciu.</li>
	<li>Użyj kleszczyków, aby podnieść jeden naskórek i delikatnie usuń resztki PBS za pomocą chusteczki.</li>
	<li>Umieść naskórek w podłożu montażowym i dostosuj jego orientację tak, aby jego wewnętrzna powierzchnia zawierająca enocyty znajdowała się na dole, a jego zewnętrzna powierzchnia znajdowała się na górze.</li>
	<li>Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na naskórek. 
	nuta: W razie potrzeby usunąć nadmiar materiału montażowego wyciekającego spod szkiełka nakrywkowego za pomocą ściereczki. Aby ułatwić obrazowanie, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe kleszkami, aby podczas obserwacji szkiełka przez mikroskop można było łatwo zobrazować klaster enocytów w jednej płaszczyźnie. Alternatywnie możliwe jest przecięcie naskórka na dwie półnaskórki przez środkową linię, aby uniknąć zwijania się całego naskórka podczas montowania tkanek.</li>
	<li>Nałóż bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić.</li>
	<li>Umieść szkiełka w światłoodpornym pudełku na próbki i pozwól lakierowi do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, co może zająć 5-10 minut.</li>
	<li>Kontynuuj analizę mikroskopową. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego (powiększenie 63x ze zoptymalizowanymi ustawieniami filtra GFP lub FITC, wzbudzenie = 488 nm, emisja = 503 nm), aby uzyskać czyste i czułe sygnały o zminimalizowanym tle.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila: development and disease.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Cheng, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+fly+research+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Fruit fly research in China.</a> Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).</li>
<li>Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+and+Drosophila+models+to+investigate+the+mechanistic+links+between+diet%2C+obesity%2C+type+II+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).</li>
<li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).</li>
<li>Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+functions+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The development and functions of oenocytes.</a> Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+suppresses+age-dependent+ectopic+fat+accumulation+by+maintaining+the+proteostasis+of+PLIN2+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila.</a> Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+lipid+droplet+turnover+in+response+to+nutrient+deprivation+via+p62-mediated+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).</li>
<li>Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+roles+of+intracellular+lipid+droplets%3A+from+archaea+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals.</a> Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nile+red%2C+a+fluorescent+hydrophobic+probe%2C+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections%3A+comparison+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).</li>
<li>Gocze, P. M., Freeman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+underlying+the+variability+of+lipid+droplet+fluorescence+in+MA-10+Leydig+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells.</a> Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials (Basel). 11 (9), (2018).</li>
<li>BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).</li>
<li>Milon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+estrogens+regulate+lipid+status+in+testicular+steroidogenic+Leydig+cell%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?</a> Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).</li>
<li>Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+alters+astrocyte+fatty+acid+metabolism+and+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Wśród tych opisanych powyżej w tym protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, a jednym z nich jest okres składania jaj. Jako tkanka mobilizująca lipidy, enocyt jest bardzo wrażliwy na stan odżywienia 6,8. Wydłużony czas składania jaj może skutkować zatłoczonymi larwami i zwiększoną konkurencją pokarmową, co prowadzi do niedokładnych wyników. Zastosowany w tym protokole 1-godzinny okres składania jaj pozwala larwom rozwijać się bez konkurencji żywieniowej. Z...

Lipidy są niezbędne do przetrwania komórek. Oprócz swojej tradycyjnej roli jako integralnych składników systemów błon komórkowych, lipidy odgrywają również kluczowe funkcje w dostarczaniu energii i transdukcji sygnałowej w całym cyklu życia poszczególnych zwierząt1. W związku z tym metabolizm lipidów musi być zgodny ze ścisłymi przepisami, aby utrzymać fizjologiczną hemostazę w komórkach. Wiadomo, że rozregulowanie gospodarki lipidowej prowadzi do różnych chorób, takich jak cukrzyca i stłuszczenie wątroby. Pomimo ogromnego znaczenia metabolizmu lipidów w zdrowiu zwierząt, mechanizmy leżące u podstaw regulacji metabolizmu lipidów pozostają w dużej mierze nieznane.
Drosophila jest szeroko stosowana od lat, odkąd profesor Thomas H. Morgan zaczął używać ich w badaniach dotyczących genetyki i innych podstawowych zagadnień biologicznych2. W ciągu ostatnich kilku dekad pojawiły się dowody na to, że Drosophila jest doskonałym organizmem modelowym w badaniu wielu chorób związanych z metabolizmem lipidów, takich jak otyłość1,3. W szczególności Drosophila ma wysoce konserwatywne geny metaboliczne z ludźmi i posiada podobne istotne tkanki/narządy i typy komórek do metabolizmu lipidów.
Na przykład, ciało tłuszczowe Drosophila, które jest odpowiedzialne za magazynowanie triacyloglicerydów, funkcjonuje analogicznie do ludzkiej tkanki tłuszczowej. Ostatnio wykazano, że grupa wyspecjalizowanych komórek podobnych do hepatocytów (tj. enocytów), które zostały zgłoszone jako funkcjonalny analog ludzkiej wątroby, jest zaangażowana w metabolizm kwasów tłuszczowych i węglowodorów u muszek owocowych4,5. Podobnie jak w przypadku wątroby ssaków, enocyty reagują na głód, aktywując tworzenie kropelek lipidów zarówno u larw, jak i dorosłych Drosophila, co powoduje akumulację kropelek lipidów u enocytów4,6,7,8. Anatomicznie enocyty są ściśle przylegające do podstawowej wewnętrznej powierzchni naskórka bocznego w skupiskach około sześciu komórek na półsegment brzuszny, co uniemożliwia wyizolowanie skupisk enocytów z naskórka. Dlatego enocyty muszą być przyczepione do naskórka podczas preparowania i barwienia.
Lipidy są przechowywane w postaci kropelek lipidów, które są organellami z jednowarstwowymi błonami w komórkach9. Kropelki lipidów występują w prawie wszystkich typach komórek u różnych gatunków10. Dynamika kropelek lipidów, w tym ich wielkość i liczba, zmienia się w odpowiedzi na stresory środowiskowe. Jest to uważane za odzwierciedlenie stanu metabolicznego w odpowiedzi na stres, taki jak starzenie się i głód7,8. Dlatego tak ważne jest opracowanie wykonalnej i wiarygodnej metody jakościowego określania dynamiki kropelek lipidów w enocytach podczas rozwoju i w warunkach stresowych. W szczególności, u larw trzeciego stadium rozwojowego, enocyty zawierają niewiele lub nie zawierają żadnych wykrywalnych kropelek lipidów w warunkach karmienia, ale zawierają liczne duże kropelki lipidów po deprywacji żywieniowej4. Aby zweryfikować skuteczność tej metody, sugeruje się barwienie kropelkami lipidów w enocytach w warunkach głodu.
Obecnie dostępnych jest kilka barwników lipofilowych do barwienia kropelek lipidów, takich jak barwniki niefluorescencyjne Sudan Black i Oil Red O oraz barwniki fluorescencyjne Nile Red i BODIPY 493/50311. Sudan Black i Oil Red O są powszechnie stosowane do tkanek estrów cholesterolu i triacylogliceroli i można je łatwo wykryć za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak stosunkowo wysokie barwienie tła i stosunkowo niska rozdzielczość to dwa czynniki ograniczające jego zastosowania w jakościowej analizie dynamiki kropelek lipidów. Aby przezwyciężyć ograniczenia barwników niefluorescencyjnych, czerwień nilowa i BODIPY 493/503 są stosowane jako idealne substytuty barwienia kropelkami lipidów. Doniesiono, że czerwień nilowa może również wykrywać pewien nieestryfikowany cholesterol, co sprawia, że BODIPY 493/503 jest do pewnego stopnia bardziej specyficznym barwnikiem dla komórkowych kropelek lipidów12,13,14.
Przede wszystkim, aby zaspokoić potrzebę szybkiej i czułej analizy kropelek lipidów w enocytach, ten protokół przedstawia wykonalną i wysoce powtarzalną metodę barwienia specyficznego dla kropelek lipidów na bazie utrwalacza przy użyciu BODIPY 493/503 jako barwnika barwiącego. W tym raporcie enocyty są preparowane, a BODIPY 493/503 jest używany do barwienia kropelkami lipidów w enocytach, w których kropelki lipidów są wykrywane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Łatwość i przystępność cenowa tej procedury sprawiają, że idealnie nadaje się ona do modyfikacji i dalszego wykorzystania w innych zastosowaniach, takich jak cytometria przepływowa.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>6 cm szalka Petriego</td><td>Thermo Fisher</td><td>150326</td><td>6 cm</td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td>Do pokarmu na muchy</td></tr><tr><td>Folia</td><td>aluminiowa N/A</td><td>N/A</td><td>Chroń klon przed światłem</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Barwnik barwiący kropelki lipidów</td></tr><tr><td>Mikroskop</td> <td>konfokalnyLeica</td><td>Leica TSC SP5</td><td>Obrazowanie konfokalne</td></tr><tr><td>Syrop</td><td></td><td></td> kukurydziany <td>Do pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Mąka</td><td></td><td></td> kukurydziana <td>Do pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td>20 i razy; 20 mm, grubość 0,13-0,17</td></tr><tr><td>Trzpień preparacyjny</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Płytka preparcyjna</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Średnica: 11 cm</td></tr><tr><td>Bufor utrwalający</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>4% paraformaldehydu (PFA) w 1x</td></tr><tr><td>PBS Kleszcz</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>#5</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Jiangnan</td><td>SPX-380</td><td>Do hodowli much</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>VECTASHIELDAntifade Medium montażowe</td><td>H-1000</td><td>Medium do montażu Antifade</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>PanEra</td><td>AAPR419</td><td>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7,4)</td></tr> <tr><td>Rotator</td><td>Kylin-Bell Lab Instruments</td><td>WH-986</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki nożycowe</td><td>Smartdata</td><td>Medical SR81</td><td>Vannas Wiosenne nożyczki</td></tr><tr><td>Mąka</td><td></td><td></td> sojowa <td>Do pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa karma z mąki kukurydzianej</td><td>NIE</td> DOTYCZY Nie <td>dotyczy</td><td>Zgodnie ze standardowym przepisem na żywność z mąki kukurydzianej</td></tr><tr><td>Bloomington Stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica S6E</td><td>Do rozwarstwiania tkanek</td></tr><tr><td>Wytrzyj papier</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td></td><td></td><td>Do pokarmu dla much</td></tr><tr><td>yw</td><td>Przechowywane jako zapas laboratoryjny</td><td>N/A</td><td>Drosophila</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw drosophila

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipidy są niezbędne dla rozwoju zwierząt i fizjologicznej homeostazy. Rozregulowanie gospodarki lipidowej skutkuje różnymi wadami rozwojowymi i chorobami, takimi jak otyłość i stłuszczenie wątroby. Zwykle lipidy są przechowywane w kropelkach lipidów, które są wielofunkcyjnymi organellami magazynującymi lipidy w komórkach. Kropelki lipidów różnią się wielkością i liczbą w różnych tkankach i w różnych warunkach. Doniesiono, że kropelki lipidów są ściśle kontrolowane poprzez regulację ich biogenezy i degradacji. U Drosophila melanogaster enocyt jest ważną tkanką dla metabolizmu lipidów i został niedawno zidentyfikowany jako analog ludzkiej wątroby pod względem mobilizacji lipidów w odpowiedzi na stres. Jednak mechanizmy leżące u podstaw regulacji metabolizmu kropelek lipidów w enocytach pozostają nieuchwytne. Aby rozwiązać ten problem, niezwykle ważne jest opracowanie niezawodnej i czułej metody bezpośredniej wizualizacji dynamicznych zmian kropelek lipidów w enocytach podczas rozwoju i w warunkach stresowych. Korzystając z lipofilowego BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów, opisano tutaj szczegółowy protokół preparacji, a następnie barwienia kropelkami lipidów w enocytach larw Drosophila w odpowiedzi na głód. Pozwala to na jakościową analizę dynamiki kropelek lipidów w różnych warunkach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Co więcej, ta szybka i wysoce powtarzalna metoda może być również stosowana w genetycznych badaniach przesiewowych do identyfikacji nowych czynników genetycznych związanych z metabolizmem kropelek lipidów w enocytach i innych tkankach.

Prawidłowe wykonanie tej procedury powinno skutkować wyraźnym barwieniem kropli lipidowych, co pozwoli określić liczbę i rozmiar kropli lipidowych w oenocytach. Rycina 1A, A', A'' wykazuje, że w oenocytach larw karmionych w sposób prawidłowy na różnych etapach rozwoju znajduje się niewiele wykrywalnych kropli lipidowych (zielone kropki). Rycina 1B,B',B'' wykazuje zwiększoną liczbę kropel lipidowy...

Przedstawione tutaj są szczegółowe metody preparowania i barwienia kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila przy użyciu BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów.

Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Ta metoda rozbioru enocytów i barwienia kropelkami lipidów może być wykorzystana do uzyskania wyglądu kropelki lipidowej w oenocytach larw drosophila w warunkach normalnych i stresowych. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badania metabolizmu lipidów nie tylko u owadów, ale także u ssaków z niewielkimi modyfikacjami. Aby wywołać składanie jaj, umieść 150 dziewiczych samic much i 75 samców o pożądanych genotypach w butelce do składania jaj i umieść butelkę pod światłoodpornym pudełkiem w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60%.Po godzinie przenieś muchy do nowej butelki i pozwól muchom złożyć jaja w nowej butelce na godzinę przed usunięciem dorosłych. Następnie pozwól jajom rozwinąć się w larwy trzeciego stadium rozwojowego przez 84 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność. Przed rozpoczęciem leczenia głodowego umieść odpowiedniej wielkości kawałek bibuły filtracyjnej na sześciocentymetrowej szalce Petriego i dodaj jeden mililitr PBS na bibułę, aby stworzyć komorę głodową.Aby przygotować kontrolną komorę zabiegową, umieść pięć mililitrów standardowej mąki kukurydzianej Bloomington na sześciocentymetrowej szalce Petriego. Gdy komory są gotowe, użyj małego pędzla, aby zebrać larwy o tej samej przybliżonej wielkości z butelki do składania jaj. I 20 larw losowo do każdej komory głodowej i kontrolnej.Następnie umieść komory w inkubatorze na 12, 24 lub 36 godzin rozwoju i/lub głodu. Pod koniec okresu leczenia za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy z każdej komory do płytki preparacyjnej zawierającej lodowaty PBS i umieść płytkę pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw pierwszą larwę brzuszną stroną do góry i użyj kleszczy, aby delikatnie przytrzymać larwę na miejscu.Umieść jedną szpilkę przez gardło, a drugą szpilkę przez przetchlinkę, aby przymocować larwę do płytki. Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby wykonać podłużne nacięcie przez naskórek od przodu do tylnego końca zwierzęcia. Za pomocą kleszczy należy usunąć wewnętrzną tkankę naskórka, uważając, aby uniknąć uszkodzenia enocytów na wewnętrznej powierzchni naskórka.Następnie użyj kleszczy, aby pobrać szpilki preparacyjne i przenieś naskórek do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej PBS na lodzie. W celu barwienia kropelkami lipidów należy inkubować wycięty naskórek w buforze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze, a następnie szybko zawiesić w jednym mililitrze PBS. Następnie umyj próbki trzema pięciominutowymi płukaniami w jednym mililitrze PBS na pranie, aby usunąć wszelkie pozostałości utrwalacza.Po ostatnim myciu inkubować próbki naskórka za pomocą odpowiedniej sondy lipofilowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. Podczas inkubacji należy owinąć probówki z próbkami w folię, aby chronić tkanki przed światłem i umyć próbki trzy razy w jednym mililitrze PBS przez 10 minut na pranie. Aby zobrazować enocyty, przenieś każdą próbkę naskórka do sześciu mikrolitrów podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym, dostosuj orientację tkanki tak, aby wewnętrzna powierzchnia zawierająca enocyty dotykała dna szkiełka.Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na naskórek i uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci. Po wyschnięciu pasty zobrazuj próbki pod mikroskopem konfokalnym, umieść 63-krotne powiększenie o odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji. W enocytach normalnie żerujących larw na różnych etapach rozwoju znajduje się kilka wykrywalnych kropelek lipidów.Jednak, jak zaobserwowano na tych reprezentatywnych obrazach, kropelki lipidów zwiększają swoją liczbę w enocytach w odpowiedzi na 12-, 24- i 36-godzinne okresy głodu. Metoda ta zapewnia łatwy i wykonalny protokół dla naukowców z odpowiednich dziedzin badawczych w celu zbadania, czy manipulacje genetyczne lub środowiskowe powodują zmiany w kropelkach lipidów w komórkach.

dissection-lipid-droplet-staining-oenocytes-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

U owadów oenocyty wytwarzają węglowodory kutykularne. Związki te chronią przed wysychaniem i ułatwiają komunikację chemiczną. W niniejszej pracy prezentujemy technikę sekcji stosowaną do izolacji oenocytów z dorosłych osobników Drosophila melanogaster oraz ilustrujemy, w jaki sposób preparat ten może zostać wykorzystany do badania genów zaangażowanych w syntezę węglowodorów.

Disekcja oenocytów u dorosłych Drosophila melanogaster

Sposób, w jaki nisze i komórki macierzyste tworzą się podczas rozwoju, jest istotnym zagadnieniem o praktycznym znaczeniu. W jajniku Drosophila komórki macierzyste linii zarodkowej oraz ich nisze somatyczne powstają podczas rozwoju larwalnego. Niniejszy film prezentuje sposób preparowania, barwienia i montowania gonad samic larw Drosophila w późnym trzecim stadium larwalnym (LL3).

Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Ten film pokazuje barwienie kropelkami lipidów w enocytach larwalnych Drosophila - komórkach podobnych do hepatocytów - przy użyciu lipofilowego barwnika fluorescencyjnego na bazie BODPY. Komórki te działają jako model do badania metabolizmu lipidów podczas rozwoju i w odpowiedzi na stres środowiskowy, taki jak głód.

Barwienie kropelkami lipidów larw Drosophila oenocytes: technika oceny akumulacji kropelek lipidów w warunkach normalnych i stresowych przy użyciu barwnika na bazie BODIPY

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Poznaj metodę rozwarstwiania enocytów i barwienia kropelek lipidów u larw Drosophila za pomocą barwnika BODIPY 493/503. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu lipidów w warunkach normalnych i stresowych.

Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów