Name: Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy lipidomu w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Technika ta umożliwia wykrywanie izobarycznych i izomerycznych gatunków lipidowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni obecnym i byłym członkom laboratorium Titorenko za dyskusje. Wyrażamy uznanie dla Centrum Biologicznych Zastosowań Spektrometrii Mas oraz Centrum Genomiki Strukturalnej i Funkcjonalnej (oba na Uniwersytecie Concordia) za wybitne usługi. Badanie to było wspierane przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) z Kanady (RGPIN 2014-04482) oraz Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. otrzymał wsparcie od Concordia University Merit Award.

1. Przygotowanie sterylnych pożywek do hodowli drożdży
<ol>
	<li>Przygotuj 90 ml kompletnej pożywki YP, która zawiera 1% (w/v) ekstraktu drożdżowego i 2% (w/v) baktopeptonu.</li>
	<li>Przygotować 90 ml syntetycznej minimalnej pożywki YNB zawierającej 0,67% (w/v) drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 mg/l L-histydyny, 30 mg/l L-leucyny, 30 mg/l L-lizyny i 20 mg/l uracylu.</li>
	<li>Podzielić 90 ml kompletnej pożywki YP równo na dwie kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml (tj. 45 ml każda).</li>
	<li>Podzielić 90 ml syntetycznej minimalnej pożywki YNB na dwie kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml (tj. 45 ml każda).</li>
	<li>Autoklawować kolby z pożywkami YP i YNB w temperaturze 15 psi/121 °C przez 45 minut przed użyciem.</li>
</ol>
2. Szczep drożdży
<ol>
	<li>Użyj szczepu typu dzikiego BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).</li>
</ol>
3. Hodowla drożdży w kompletnym pożywce YP z glukozą
<ol>
	<li>Autoklawować 20% (w/v) roztwór podstawowy glukozy o temperaturze 15 psi/121 °C przez 45 minut przed użyciem.</li>
	<li>Dodać 5 ml sterylnego 20% (m/v) roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających sterylne podłoże YP, aby uzyskać końcowe stężenie 2% glukozy (w/v).</li>
	<li>Użyć pętli mikrobiologicznej do zaszczepienia komórek dzikiego szczepu BY4742 do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających pożywkę YP z glukozą.</li>
	<li>Hodować komórki przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem rotacyjnym przy 200 obr./min.</li>
	<li>Weź porcję kultury drożdży. Użyj hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek drożdży na ml hodowli.</li>
</ol>
4. Przenoszenie drożdży i hodowla ich w syntetycznym minimalnym pożywce YNB z glukozą
<ol>
	<li>Dodać 5 ml sterylnego 20% (m/v) roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających sterylne podłoże YNB do końcowego stężenia 2% glukozy (w/v).</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety przenieść objętość nocnej kultury drożdży, która zawiera łączną liczbę 5,0 x 107 komórek, do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających pożywkę YNB z glukozą.</li>
	<li>Hodować komórki przez co najmniej 24 godziny (lub dłużej, jeśli wymaga tego doświadczenie) w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem rotacyjnym przy 200 obr./min.</li>
</ol>
5. Przygotowanie odczynników, sprzętu laboratoryjnego i sprzętu do ekstrakcji lipidów
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: 1) chloroform wysokiej jakości (>99,9%); 2) metanol wysokiej jakości (>99,9%); 3) 28% (v/v) roztwór wodorotlenku amonu w wodzie nanoczystej; 4) kulki szklane (myte kwasem, 425-600 μM); 5) wir z odpowiednim adapterem; 6) Szybkoobrotowe szklane probówki wirówkowe o pojemności 15 ml z nakrętkami wyłożonymi politetrafluoroetylenem; 7) mieszaniny chloroformu i metanolu w proporcjach 17:1 i 2:1; 8) mieszanina chloroformu/metanolu (2:1) z 0,1% wodorotlenkiem (v/v) amonu; 9) roztwór ABC (155 mM wodorowęglanu amonu, pH = 8,0); 10) mieszanina wewnętrznych wzorców lipidowych przygotowana w mieszaninie chloroformu i metanolu w stosunku 2:1, jak wskazano w tabeli 1; oraz 11) szklane fiolki na próbki o pojemności 2 ml z kapslami wyłożonymi politetrafluoroetylenem do ekstrakcji lipidów komórkowych.</li>
</ol>
6. Przygotowanie odczynników, sprzętu laboratoryjnego i sprzętu do LC
<ol>
	<li>Przygotować następujące elementy: 1) mieszaninę acetonitrylu/2-propanolu/wody nanoczystej (65:35:5); 2) wir z odpowiednim adapterem; 3) ultradźwiękowy sonikator 4) szklane fiolki z wkładkami do płytki studzienki; 5) system LC wyposażony w pompę dwustopniową, odgazowywacz i autosampler; 6) kolumna C18 z odwróconymi fazami (2,1 mm; 75 mm; wielkość porów 130 A; zakres pH 1-11) sprzężona z systemem przedkolumnowym; 7) mieszanina A: acetonitryl/woda (60:40); oraz 8) mieszanina B: izopropanol/acetonitryl (90:10).</li>
</ol>
7. Ekstrakcja lipidów z komórek drożdży
<ol>
	<li>Weź porcję kultury drożdży. Użyj hemocytometru lub zmierz OD600, aby określić całkowitą liczbę komórek drożdży na ml hodowli.</li>
	<li>Weź objętość kultury drożdży, która zawiera całkowitą liczbę 5,0 x 107 komórek (3,3 jednostki OD600). Umieść tę objętość kultury w wstępnie schłodzonej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml lodowatej wody o barwie nano-czystej i przepłukać komórki przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml lodowatego roztworu ABC i przemywać komórki przez odwirowanie w stężeniu 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Osad komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C przed ekstrakcją lipidów.</li>
	<li>Aby rozpocząć ekstrakcję lipidów, rozmrozić osad komórkowy na lodzie.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 200 μl lodowatej nano-czystej wody. Przenieść zawiesinę komórek do 15 ml szklanej probówki wirówkowej o wysokiej wytrzymałości z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem. Dodać do tej probówki: 1) 25 μl mieszaniny wewnętrznych wzorców lipidowych przygotowanych w mieszaninie chloroform/metanol (2:1); 2) 100 μL kulek szklanych płukanych kwasem o pojemności 425-600 μM; oraz 3) 600 μl mieszaniny chloroformu/metanolu (17:1).</li>
	<li>Wiruj rurkę z dużą prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby rozbić komórki.</li>
	<li>Wirować probówkę z niską prędkością przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby ułatwić ekstrakcję lipidów.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 15 minut na lodzie, aby przyspieszyć wytrącanie się białek i oddzielenie od siebie fazy wodnej i organicznej.</li>
	<li>Odwirować probówkę w wirówce klinicznej przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ten etap wirowania pozwala oddzielić górną fazę wodną od dolnej fazy organicznej, która zawiera wszystkie klasy lipidów.</li>
	<li>Za pomocą pipety ze szkła borokrzemianowego przenieś dolną fazę organiczną (~400 μl) do innej 15 ml szklanej probówki wirówkowej o wysokiej wytrzymałości z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem. Nie należy naruszać szklanych kulek ani górnej fazy wodnej podczas takiego przenoszenia. Utrzymuj dolną fazę organiczną pod przepływem azotu gazowego.</li>
	<li>Dodać 300 μl mieszaniny chloroformu i metanolu (2:1) do pozostałej górnej fazy wodnej, aby umożliwić ekstrakcję sfingolipidów oraz PA, PS, PI i CL. Energicznie wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówkę w wirówce klinicznej przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety ze szkła borokrzemianowego przenieść dolną fazę organiczną (~ 200 μl) powstałą po odwirowaniu do fazy organicznej zebranej w kroku 7.13.</li>
	<li>Wykorzystaj przepływ azotu gazowego do odparowania rozpuszczalnika w połączonych fazach organicznych. Zamknąć probówki zawierające film lipidowy pod przepływem azotu gazowego. Przechowywać te probówki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
8. Separacja wyekstrahowanych lipidów przez LC
<ol>
	<li>Dodać 500 μl mieszaniny acetonitrylu/2-propanolu/wody nanoczystej (65:35:5) do probówki zawierającej film lipidowy otrzymany w kroku 7.16. Wiruj rurkę 3x przez 10 s przy RT.</li>
	<li>Poddać zawartość probówki działaniu ultradźwięków przez 15 minut. Wirować probówkę 3x przez 10 s przy temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać 100 μl próbki z probówki i dodać ją do szklanej fiolki z wkładką używaną do płytki studziennej. Wyeliminuj pęcherzyki powietrza we wkładce przed włożeniem jej do płytki studzienki.</li>
	<li>Użyj systemu LC do oddzielenia różnych gatunków lipidów na kolumnie C18 CSH z odwróconą fazą sprzężoną z systemem przedkolumnowym (patrz tabela materiałów). Podczas rozdzielania utrzymywać kolumnę w temperaturze 55 °C i natężeniu przepływu 0,3 ml/min. Przechowywać próbkę w płytce studzienkowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Stosować fazy ruchome, które składają się z mieszaniny A (acetonitryl/woda [60:40 (v/v)]) i mieszaniny B (izopropanol/acetonitryl [90:10 (v/v)]). Dla dodatniego trybu wykrywania jonów macierzystych utworzonych przy użyciu źródła jonów jonizacji elektronopryskowej (ESI), trybu ESI (+), fazy ruchome A i B zawierają mrówczan amonu w końcowym stężeniu 10 mM. Dla ujemnego trybu wykrywania jonów macierzystych, trybu ESI (-), fazy ruchome A i B zawierają octan amonu o końcowym stężeniu 10 mM.</li>
	<li>Do wstrzyknięcia zarówno w trybie ESI (+), jak i ESI (-) należy użyć próbki o objętości 10 μl.</li>
	<li>Oddziel różne gatunki lipidów przez LC, stosując następujący gradient LC: 0-1 min 10% (faza B); 1-4 min 60% (faza B); 4-10 min 68% (faza B); 10-21 97% (faza B); 21-24 min 97% (faza B); 24-33 min 10% (faza B).</li>
	<li>Przeprowadzić ślepe próby ekstrakcyjne jako pierwszą próbkę, między każdymi czterema próbkami i jako ostatnią próbkę. Odejmij tło, aby znormalizować dane.</li>
	<li>Reprezentatywny chromatogram jonów całkowitych z danych LC/MS lipidów wyekstrahowanych z komórek szczepu typu dzikiego BY4742 pokazano na rysunku Rysunek 1.</li>
</ol>
9. Analiza spektrometryczna mas lipidów oddzielonych LC
<ol>
	<li>Użyj spektrometru mas wyposażonego w źródło jonów HESI (podgrzewana jonizacja elektronrozpylająca) do analizy lipidów, które zostały oddzielone przez LC. Użyj ustawień podanych w Tabeli 2.</li>
	<li>Za pomocą analizatora transformaty Fouriera można wykrywać jony macierzyste (MS1) z rozdzielczością 60 000 i w zakresie mas 150-2 000 Da.</li>
	<li>Użyj ustawień podanych w Tabeli 3, aby wykryć jony wtórne (MS2).</li>
</ol>
10. Identyfikacja i kwantyfikacja różnych klas i gatunków lipidów poprzez przetwarzanie surowych danych z LC-MS/MS
<ol>
	<li>Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z oprogramowaniem do identyfikacji i oceny ilościowej różnych lipidów z surowych plików LC-MS/MS. To oprogramowanie korzysta z największej bazy danych lipidów, zawierającej ponad 1,5 miliona prekursorów jonów lipidowych (MS1) i ich przewidywanych jonów fragmentacyjnych (MS2). Oprogramowanie wykorzystuje również piki MS1 do ilościowego oznaczania lipidów i MS2 do identyfikacji lipidów. Reprezentatywny chromatogram dwóch izomerycznych form fosfatydyloseryny (34:0), które mają tę samą wartość m/z, ale różne czasy retencji, a także ich widma MS1 i MS2, są pokazane odpowiednio na Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4.</li>
	<li>Przeszukaj surowe pliki LC-MS zawierające pełne dane MS1 i zależne od danych dane MS2 pod kątem wolnych (nieestryfikowanych) kwasów tłuszczowych (FFA), kardiolipiny (CL), fitoceramidu (PHC), fitosfingozyny (PHS), fosfatydylocholiny (PC), fosfatydyloetanoloaminy (PE), fosfatydyloglicerolu (PG), fosfatydyloinozytolu (PI), fosfatydyloseryny (PS) i triacyloglicerolu (TAG), stosując tolerancję m/z 5 ppm dla jonów prekursorowych i 10 ppm dla jonów produktowych. Pozostałe parametry wyszukiwania przedstawiono w tabeli 4. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi oprogramowania. Tożsamość wewnętrznych wzorców lipidowych i gatunków lipidów o nietypowym składzie kwasów tłuszczowych musi być weryfikowana ręcznie.</li>
	<li>Aby zidentyfikować i określić ilościowo różne klasy i gatunki lipidów za pomocą swobodnie dostępnych alternatyw typu open source dla oprogramowania Lipid Search, użyj Lipid Data Analyzer (<a href="http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml" target="_blank">http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml</a>), MZmine 2 (<a href="http://mzmine.github.io/" target="_blank">http://mzmine.github.io/</a>) lub XCMS ( <a href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html" target="_blank">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html</a>) oprogramowanie do przetwarzania surowych danych z LC-MS/MS.</li>
</ol>

<ol><li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+era%3A+accomplishments+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Review%22%5BJournal%5D)">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li>
<li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+coming+to+grips+with+lipid+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li>
<li>Brügger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li>
<li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li>
<li>Eisenberg, T., Büttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+and+cell+death+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li>
<li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+liponecrosis%2C+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li>
<li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals%3A+searching+for+activators+of+liponecrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li>
<li>Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li>
<li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li>
<li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid%3A+cellular+functions+and+disease+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83(2019).</li>
<li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li>
<li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obese+and+anorexic+yeasts%3A+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li>
<li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li>
<li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li>
<li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+peroxisomes%3A+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+%27em+up+or+burn+%27em+down%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li>
<li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li>
<li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li>
<li>Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology%3A+structure+and+signaling+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li>
<li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li>
<li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li>
<li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeissman%2C+J+%22Guide+to+Yeast+Genetics%3A+Functional+Genomics%2C+Proteomics%2C+and+Other+Systems+Analyses%22">Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses</a>. , Academic Press. Burlington. (2010).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+for+budding+geneticists%3A+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li>
<li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li>
<li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li>
<li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li>
<li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li>
<li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li>
<li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li>
<li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMSD%3A+LIPID+MAPS+structure+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li>
<li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Następujące środki ostrożności są ważne dla pomyślnego wdrożenia opisanego tutaj protokołu:
1. Chloroform i metanol są toksyczne. Skutecznie usuwają różne substancje z powierzchni, w tym z laboratoryjnych wyrobów z tworzyw sztucznych i skóry. Dlatego z tymi rozpuszczalnikami organicznymi należy obchodzić się ostrożnie, unikając stosowania tworzyw sztucznych na etapach wiążących się z kontaktem z chloroformem i/lub metanolem, używając do tych etapów pipet ze szkła borokrzemianowego i przepłukuj...

Materiał dowodowy wskazuje, że lipidy, jedna z głównych klas biomolekuł, odgrywają istotną rolę w wielu ważnych procesach w komórce eukariotycznej. Procesy te obejmują składanie dwuwarstw lipidowych, które tworzą błonę plazmatyczną i błony otaczające organelle komórkowe, transport małych cząsteczek przez błony komórkowe, odpowiedź na zmiany w środowisku zewnątrzkomórkowym i wewnątrzkomórkową transdukcję sygnału, wytwarzanie i magazynowanie energii, import i eksport białek ograniczonych do różnych organelli, pęcherzykowy transport białek w systemie endomembranowym i wydzielanie białek, oraz kilka trybów regulowanej śmierci komórki1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Pączkujący drożdż S. cerevisiae, jednokomórkowy organizm eukariotyczny, został z powodzeniem wykorzystany do odkrycia niektórych mechanizmów leżących u podstaw zasadniczych ról lipidów w tych ważnych procesach komórkowych4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. S. cerevisiae jest cennym organizmem modelowym do odkrywania tych mechanizmów, ponieważ jest podatny na kompleksowe analizy biochemiczne, genetyczne, biologiczne komórek, chemiczne biologiczne, biologiczne systemowe i mikroprzepływowe analizy rozwarstwienia21,22,23,24,25. Dalszy postęp w zrozumieniu mechanizmów, dzięki którym metabolizm lipidów i transport wewnątrzkomórkowy przyczyniają się do tych ważnych procesów komórkowych, wymaga czułych technologii spektrometrii mas do ilościowej charakterystyki lipidomu komórkowego, zrozumienia złożoności molekularnej lipidomu i integracji lipidomiki ilościowej z multidyscyplinarną platformą biologii systemów1,2,3,26,27,28,29,30.
Obecne metody ilościowej lipidomiki komórek drożdży i komórek innych organizmów eukariotycznych wspomaganej spektrometrią mas nie są wystarczająco wszechstronne, solidne ani czułe. Co więcej, te obecnie stosowane metody nie są w stanie odróżnić od siebie różnych izobarycznych lub izomerycznych gatunków lipidów. W tym miejscu opisujemy wszechstronną, solidną i czułą metodę, która umożliwia zastosowanie chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS / MS) do analizy ilościowej głównych lipidów komórkowych S. cerevisiae.

<table><tbody><tr><td>Szybkie szklane probówki wirówkowe o pojemności 15 ml z nasadkami wyłożonymi teflonem</td><td>PYREX</td><td>05-550</td><td></td></tr> 2 <tr><td>ml Szklane fiolki na próbki z nakrętkami wyłożonymi teflonem</td><td>Fisher Scientific</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>System LC Fisher Scientific</td><td>A9554</td><td></td></tr><tr><td>Agilent serii 1100</td><td>Agilent Technologie</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent1100 Wellplate</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1367A</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11550</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-2</td><td></td></tr><tr><td>Kardiolipina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>750332</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka kliniczna Centra CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Ceramid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860517</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>CSH C18 VanGuard</td><td>Wody</td><td>186006944</td><td>System przedkolumnowy</td></tr><tr><td>Wolne kwasy tłuszczowe (19:0)</td><td>Matreya</td><td>1028</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane (myte kwasem, 425-600 &mu; M)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Oprogramowanie</td> do wyszukiwania lipidów Sigma <td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>(V4.1)</td>Oprogramowanie do analizy <td>Fisher Scientific</td><td>V4.1</td><td>LC-MS/</td></tr><tr><td>MSL-leucyna</td><td>Sigma</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydylocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850340</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydyloetanoloamina</td><td>Avanti Polarne lipidy</td><td>850704</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydyloglicerol</td><td>Avanti Polarne lipidy</td><td></td><td></td>840446</tr><tr><td>Fosfatydyloinozytol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM1502</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydyloseryna</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840028</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna z odwróconymi fazami CSH C18</td><td>Wody</td><td>186006102</td><td></td></tr><tr><td>Sfingozyna</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860669</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>Tricylglycerol</td><td>Larodan, Malmö</td><td>TAG Mixed FA</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator ultradźwiękowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-15-3</td><td></td></tr><tr><td>Szczep drożdży BY4742</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa lipidomu komórkowego saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipidy to strukturalnie zróżnicowane cząsteczki amfipatyczne, które są nierozpuszczalne w wodzie. Lipidy są niezbędnymi czynnikami przyczyniającymi się do organizacji i funkcji błon biologicznych, magazynowania i produkcji energii, sygnalizacji komórkowej, transportu pęcherzykowego białek, biogenezy organelli i regulowanej śmierci komórki. Ponieważ pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae są jednokomórkowymi eukariontami nadającymi się do dokładnych analiz molekularnych, ich wykorzystanie jako organizmu modelowego pomogło odkryć mechanizmy łączące metabolizm lipidów i transport wewnątrzkomórkowy ze złożonymi procesami biologicznymi w komórkach eukariotycznych. Dostępność wszechstronnej metody analitycznej do solidnej, czułej i dokładnej oceny ilościowej głównych klas lipidów w komórce drożdży ma kluczowe znaczenie dla uzyskania głębokiego wglądu w te mechanizmy. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS / MS) do analizy ilościowej głównych lipidów komórkowych S. cerevisiae. Opisana metoda LC-MS/MS jest wszechstronna i niezawodna. Umożliwia identyfikację i kwantyfikację wielu gatunków (w tym różnych form izobarycznych lub izomerycznych) w obrębie każdej z 10 klas lipidów. Metoda ta jest czuła i umożliwia identyfikację i ocenę ilościową niektórych gatunków lipidów w stężeniach tak niskich, jak 0,2 pmol/μl. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do oceny lipidomów całych komórek drożdży i ich oczyszczonych organelli. Zastosowanie alternatywnych dodatków do fazy ruchomej do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania w tej metodzie może zwiększyć efektywność jonizacji niektórych form lipidów i dlatego może być wykorzystane do poprawy ich identyfikacji i kwantyfikacji.

Nasza metoda ilościowej oceny głównych lipidów komórkowych w komórce drożdży z wykorzystaniem LC-MS/MS okazała się wszechstronna i niezawodna. Pozwoliła ona na identyfikację i kwantyfikację 10 różnych klas lipidów w komórkach S. cerevisiae hodowanych w syntetycznym minimalnym medium YNB, początkowo zawierającym 2% glukozy. Klasy lipidów te obejmują wolne (nieestryfikowane) kwasy tłuszczowe (FFA), CL, fitoceramid (PHC), fitosfingozynę (PHS), PC, PE, PG, PI, PS oraz TAG (Ta...

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Protokół ten zapewnia dokładną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania dziesięciu różnych klas lipidów Saccharomyces cerevisiae przy użyciu jednej metody ekstrakcji i jednej metody LC-MS. Metoda ta pozwala na wykrycie i ilościowe określenie izobarycznych i izomerycznych form lipidów o różnych właściwościach chemicznych i fizycznych. W przypadku hodowli Saccharomyces cerevisiae należy najpierw dodać 5 ml sterylnego 20% roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających sterylne podłoże YNB do końcowego stężenia 2% glukozy.Następnie za pomocą sterylnej pipety przenieść objętość nocnej kultury drożdży zawierającej pięć razy dziesięć do siódmych komórek drożdży do każdej kolby i hodować kolby przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem rotacyjnym z prędkością 200 obrotów na minutę. W celu ekstrakcji lipidów oznacz całkowitą liczbę komórek drożdży na mililitr kultury i przenieś pięć razy dziesięć do siódmych komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj lodowatą nanoczystą wodę, aby zwiększyć całkowitą objętość do 15 ml i zbierz komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić osad drożdżowy w 15 ml lodowatego izotonicznego buforu wodorowęglanu amonu do drugiego odwirowania i ponownie zawiesić osad w 1,5 ml świeżego lodowatego roztworu wodorowęglanu amonu. Pod koniec wirowania przechowuj osad w temperaturze 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji. Aby rozpocząć ekstrakcję lipidów, rozmrozić osad komórkowy na lodzie przed ponownym zawieszeniem komórek w 200 mikrolitrach lodowatej nanoczystej wody.W dygestorium przenieść zawiesinę komórek do 15 ml szklanej rurki wirówkowej o wysokiej wytrzymałości, zakręcanej górnej probówki wirówkowej z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem i dodać 25 mikrolitrów mieszaniny wewnętrznych wzorców lipidów, przygotowanej w metanolu chloroformowym w proporcji 2:1. 100 mikrolitrów szklanych kulek przemytych kwasem mikromolowym o wysokiej wytrzymałości i 600 mikrolitrów metanolu chloroformowego w proporcji 17:1 do probówki. Wiruj rurkę z dużą prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby rozbić komórki.Następnie wirowanie przez godzinę z niską prędkością w temperaturze pokojowej w celu ułatwienia ekstrakcji lipidów. Pod koniec ekstrakcji inkubować próbkę przez 15 minut na lodzie, aby ułatwić wytrącanie białek i oddzielenie fazy wodnej i organicznej. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę w celu dalszego oddzielenia górnej fazy wodnej od dolnej fazy organicznej i w dygestoriach użyć pipety ze szkła borokrzemianowego w celu przeniesienia dolnej fazy organicznej do nowej 15 ml szklanej probówki wirówkowej o wysokiej wytrzymałości z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem.Umieścić dolną fazę organiczną pod strumieniem azotu gazowego i w dygestorium dodać 300 mikrolitrów mieszaniny metanolu chloroformowego w proporcji 2:1 do pozostałej górnej fazy wodnej. Aby ułatwić ekstrakcję kwasu fosfatydydowego, fosfatydyloseryny, fosfatydyloinozytolu i kardiolipidów, energicznie wirować probówkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed odwirowaniem próbki. Za pomocą pipety ze szkła borokrzemianowego przenieść dolną fazę organiczną do dolnej fazy organicznej pod wpływem azotu i odparować rozpuszczalnik w połączonych fazach organicznych w dygestorium.Następnie zamknij probówki filmu lipidowego pod przepływem gazowego azotu i przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W przypadku chromatografii cieczowej, oddzielenie wyekstrahowanych lipidów w 500 mikrolitrach mieszaniny nanoczystej wody aceto-nitryl-2-propanol o proporcji 63:35:5 do probówki filmu lipidowego i wirowanie trzy razy przez dziesięć sekund na wir w temperaturze pokojowej. Poddaj zawartość probówki ultradźwiękowej sonikacji przez 15 minut, a następnie trzykrotnie wiruj probówkę przez dziesięć sekund na wir, jak właśnie pokazano.Przenieść 100 mikrolitrów próbki do szklanej fiolki z wkładką używaną do płytki 24-dołkowej i usunąć wszelkie pęcherzyki we wkładce. Umieścić wkładkę w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i załadować CSH kolumny C18 z odwróconą fazą sprzężoną z kolumną wstępną do systemu chromatografii cieczowej. Ustaw temperaturę kolumny na 55 stopni Celsjusza, a przepływ na 300 mikrolitrów na minutę.Po ustawieniu wszystkich parametrów załadować dziesięć mikrolitrów ślepej próby ekstrakcyjnej przed załadowaniem pierwszej próbki. Następnie oddziel różne gatunki lipidów za pomocą gradientu chromatografii cieczowej, jak wskazano. Na podstawie danych LC-MS zostanie wygenerowany reprezentatywny chromatogram jonów całkowitych dla lipidów wyekstrahowanych z komórek.W celu analizy spektrometrii mas wyekstrahowanych lipidów należy załadować próbki do spektrometru mas wyposażonego w podgrzewane źródło jonów jonizacyjnych w rozpylaniu elektrogazowym i ustawić parametry analizy zgodnie z tabelą. Analizator transformaty Fouriera służy do wykrywania jonów macierzystych MS-1 z rozdzielczością 60 000 i w zakresie mas 150-2000 daltonów. Następnie wykryj jony wtórne MS-2 przy użyciu ustawień wskazanych w tabeli.Aby zidentyfikować i określić ilościowo różne lipidy z szerokich tandemowych plików LC-MS, przeszukaj surowe pliki LC-MS zawierające pełne dane skanowania MS-1 i dane MS-2 zależne od danych dla wolnych, nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych, kardiolipidów, fitocerimidów, fitosfigocenu, fosfatydylocholiny, fosfatydyloglicerolu, fosfatydlinozytolu, fosfatydlseryny i triacyloglicerolu, używając masy podzielonej przez tolerancję ładunku wynoszącą pięć części na milion dla jonów prekursorowych i dziesięć części na milion dla jony produktowe. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi oprogramowania, aby zidentyfikować wewnętrzne wzorce lipidowe i gatunki lipidów o nietypowym składzie kwasów tłuszczowych. Ta czuła tandemowa metoda LC-MS umożliwia identyfikację i kwantyfikację cząsteczek lipidów w stężeniach tak niskich, jak 0,165 pikomolara na mikrolitr.Ta granica oznaczalności różni się od różnych klas lipidów w szerokim zakresie stężeń. Metoda ta może być stosowana w celu zwiększenia efektywności jonizacji lipidów poprzez zastosowanie alternatywnych dodatków do fazy ruchomej do spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylaną. Każdy z tych alternatywnych dodatków do fazy ruchomej może być stosowany zarówno w kolumnach LC z fazą normalną, jak i z odwróconą fazą.Metoda dysocjacji wywołanej zderzeniem jest korzystna, jeśli jest stosowana w połączeniu z dodatkiem do fazy ruchomej octanu amonu w ujemnym trybie jonizacji elektrorozpylania spektrometrii mas, ponieważ w tych warunkach pozwala na zwiększenie wydajności fragmentacji jonów lipidowych MS-1 do produktów MS-2. Natomiast metoda dysocjacji kolizyjnej o wysokiej energii jest korzystna, jeśli jest stosowana w połączeniu z dodatkiem fazy ruchomej mrówczanu amonu do dodatniego trybu jonizacji elektrorozpylania spektrometrii mas, ponieważ w tych warunkach umożliwia zwiększenie efektywności fragmentacji jonów lipidowych MS-1 na produkty MS-2. Nie mieszaj faz podczas zbierania fazy organicznej.Zamknij rurki pod przepływem azotu gazowego. Wyeliminuj wszelkie pęcherzyki powietrza we wkładce i podłącz kolumnę we właściwym kierunku. Jeśli tożsamość dowolnego piku nie może być określona przez LC-MS, MS-NMR można użyć do wydedukowania struktury tej cząsteczki.

quantitative-analysis-cellular-lipidome-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj metodę ilościowej analizy lipidomu w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Technika ta umożliwia wykrywanie izobarycznych i izomerycznych gatunków lipidowych.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów