Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Protokół ten zapewnia dokładną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania dziesięciu różnych klas lipidów Saccharomyces cerevisiae przy użyciu jednej metody ekstrakcji i jednej metody LC-MS. Metoda ta pozwala na wykrycie i ilościowe określenie izobarycznych i izomerycznych form lipidów o różnych właściwościach chemicznych i fizycznych. W przypadku hodowli Saccharomyces cerevisiae należy najpierw dodać 5 ml sterylnego 20% roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających sterylne podłoże YNB do końcowego stężenia 2% glukozy.

Następnie za pomocą sterylnej pipety przenieść objętość nocnej kultury drożdży zawierającej pięć razy dziesięć do siódmych komórek drożdży do każdej kolby i hodować kolby przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem rotacyjnym z prędkością 200 obrotów na minutę. W celu ekstrakcji lipidów oznacz całkowitą liczbę komórek drożdży na mililitr kultury i przenieś pięć razy dziesięć do siódmych komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj lodowatą nanoczystą wodę, aby zwiększyć całkowitą objętość do 15 ml i zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad drożdżowy w 15 ml lodowatego izotonicznego buforu wodorowęglanu amonu do drugiego odwirowania i ponownie zawiesić osad w 1,5 ml świeżego lodowatego roztworu wodorowęglanu amonu. Pod koniec wirowania przechowuj osad w temperaturze 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji. Aby rozpocząć ekstrakcję lipidów, rozmrozić osad komórkowy na lodzie przed ponownym zawieszeniem komórek w 200 mikrolitrach lodowatej nanoczystej wody.

W dygestorium przenieść zawiesinę komórek do 15 ml szklanej rurki wirówkowej o wysokiej wytrzymałości, zakręcanej górnej probówki wirówkowej z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem i dodać 25 mikrolitrów mieszaniny wewnętrznych wzorców lipidów, przygotowanej w metanolu chloroformowym w proporcji 2:1. 100 mikrolitrów szklanych kulek przemytych kwasem mikromolowym o wysokiej wytrzymałości i 600 mikrolitrów metanolu chloroformowego w proporcji 17:1 do probówki. Wiruj rurkę z dużą prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby rozbić komórki.

Następnie wirowanie przez godzinę z niską prędkością w temperaturze pokojowej w celu ułatwienia ekstrakcji lipidów. Pod koniec ekstrakcji inkubować próbkę przez 15 minut na lodzie, aby ułatwić wytrącanie białek i oddzielenie fazy wodnej i organicznej. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę w celu dalszego oddzielenia górnej fazy wodnej od dolnej fazy organicznej i w dygestoriach użyć pipety ze szkła borokrzemianowego w celu przeniesienia dolnej fazy organicznej do nowej 15 ml szklanej probówki wirówkowej o wysokiej wytrzymałości z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem.

Umieścić dolną fazę organiczną pod strumieniem azotu gazowego i w dygestorium dodać 300 mikrolitrów mieszaniny metanolu chloroformowego w proporcji 2:1 do pozostałej górnej fazy wodnej. Aby ułatwić ekstrakcję kwasu fosfatydydowego, fosfatydyloseryny, fosfatydyloinozytolu i kardiolipidów, energicznie wirować probówkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed odwirowaniem próbki. Za pomocą pipety ze szkła borokrzemianowego przenieść dolną fazę organiczną do dolnej fazy organicznej pod wpływem azotu i odparować rozpuszczalnik w połączonych fazach organicznych w dygestorium.

Następnie zamknij probówki filmu lipidowego pod przepływem gazowego azotu i przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W przypadku chromatografii cieczowej, oddzielenie wyekstrahowanych lipidów w 500 mikrolitrach mieszaniny nanoczystej wody aceto-nitryl-2-propanol o proporcji 63:35:5 do probówki filmu lipidowego i wirowanie trzy razy przez dziesięć sekund na wir w temperaturze pokojowej. Poddaj zawartość probówki ultradźwiękowej sonikacji przez 15 minut, a następnie trzykrotnie wiruj probówkę przez dziesięć sekund na wir, jak właśnie pokazano.

Przenieść 100 mikrolitrów próbki do szklanej fiolki z wkładką używaną do płytki 24-dołkowej i usunąć wszelkie pęcherzyki we wkładce. Umieścić wkładkę w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i załadować CSH kolumny C18 z odwróconą fazą sprzężoną z kolumną wstępną do systemu chromatografii cieczowej. Ustaw temperaturę kolumny na 55 stopni Celsjusza, a przepływ na 300 mikrolitrów na minutę.

Po ustawieniu wszystkich parametrów załadować dziesięć mikrolitrów ślepej próby ekstrakcyjnej przed załadowaniem pierwszej próbki. Następnie oddziel różne gatunki lipidów za pomocą gradientu chromatografii cieczowej, jak wskazano. Na podstawie danych LC-MS zostanie wygenerowany reprezentatywny chromatogram jonów całkowitych dla lipidów wyekstrahowanych z komórek.

W celu analizy spektrometrii mas wyekstrahowanych lipidów należy załadować próbki do spektrometru mas wyposażonego w podgrzewane źródło jonów jonizacyjnych w rozpylaniu elektrogazowym i ustawić parametry analizy zgodnie z tabelą. Analizator transformaty Fouriera służy do wykrywania jonów macierzystych MS-1 z rozdzielczością 60 000 i w zakresie mas 150-2000 daltonów. Następnie wykryj jony wtórne MS-2 przy użyciu ustawień wskazanych w tabeli.

Aby zidentyfikować i określić ilościowo różne lipidy z szerokich tandemowych plików LC-MS, przeszukaj surowe pliki LC-MS zawierające pełne dane skanowania MS-1 i dane MS-2 zależne od danych dla wolnych, nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych, kardiolipidów, fitocerimidów, fitosfigocenu, fosfatydylocholiny, fosfatydyloglicerolu, fosfatydlinozytolu, fosfatydlseryny i triacyloglicerolu, używając masy podzielonej przez tolerancję ładunku wynoszącą pięć części na milion dla jonów prekursorowych i dziesięć części na milion dla jony produktowe. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi oprogramowania, aby zidentyfikować wewnętrzne wzorce lipidowe i gatunki lipidów o nietypowym składzie kwasów tłuszczowych. Ta czuła tandemowa metoda LC-MS umożliwia identyfikację i kwantyfikację cząsteczek lipidów w stężeniach tak niskich, jak 0,165 pikomolara na mikrolitr.

Ta granica oznaczalności różni się od różnych klas lipidów w szerokim zakresie stężeń. Metoda ta może być stosowana w celu zwiększenia efektywności jonizacji lipidów poprzez zastosowanie alternatywnych dodatków do fazy ruchomej do spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylaną. Każdy z tych alternatywnych dodatków do fazy ruchomej może być stosowany zarówno w kolumnach LC z fazą normalną, jak i z odwróconą fazą.

Metoda dysocjacji wywołanej zderzeniem jest korzystna, jeśli jest stosowana w połączeniu z dodatkiem do fazy ruchomej octanu amonu w ujemnym trybie jonizacji elektrorozpylania spektrometrii mas, ponieważ w tych warunkach pozwala na zwiększenie wydajności fragmentacji jonów lipidowych MS-1 do produktów MS-2. Natomiast metoda dysocjacji kolizyjnej o wysokiej energii jest korzystna, jeśli jest stosowana w połączeniu z dodatkiem fazy ruchomej mrówczanu amonu do dodatniego trybu jonizacji elektrorozpylania spektrometrii mas, ponieważ w tych warunkach umożliwia zwiększenie efektywności fragmentacji jonów lipidowych MS-1 na produkty MS-2. Nie mieszaj faz podczas zbierania fazy organicznej.

Zamknij rurki pod przepływem azotu gazowego. Wyeliminuj wszelkie pęcherzyki powietrza we wkładce i podłącz kolumnę we właściwym kierunku. Jeśli tożsamość dowolnego piku nie może być określona przez LC-MS, MS-NMR można użyć do wydedukowania struktury tej cząsteczki.